用于制备替米考星纳米粒的方法及其产品与流程

本发明涉及与纳米粒合成有关的化学领域，尤其涉及替米考星纳米粒的制备。
背景技术：
：替米考星是一种抗生素，属于大环内酯族，在控制和治疗因放线杆菌、支原体、巴斯德氏菌、嗜血杆菌所致的动物呼吸系统疾病上有着广泛疗效：替米考星将被吸收且累积在呼吸道的细胞中，从而在病菌扩散到肺部之前对其进行攻击。此外，研究发现，替米考星在肺组织(尤其是肺部的主要白血细胞，即中性粒细胞和单核细胞)中的累积可造成相当有效的对感染区中细菌的破坏。此外，研究发现，替米考星还可与主要白血细胞共同作用以抑制猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(prrsv)。口服是安全且最普遍的给药方式，但存在一些制约因素，例如胃肠上皮细胞，它会形成使药物无法被吸收进入血液循环的物理屏障。因此，需要进一步调查和开发更好的药物递送系统以便提高从消化系统到血液循环系统的吸收能力。替米考星碱是具有低溶解度的原材料，但为了易于向动物喂食，便通过将替米考星碱与磷酸混合的方式，使用磷酸替米考星来改善其水溶性。然而，磷酸替米考星的问题与其相对较低的生物利用率有关。即使可以通过增大剂量来提高疗效或生物利用率，也存在快速和急性心脏毒性的风险，因为毒性水平取决于剂量。因此，有必要开发一种替米考星递送系统来改善替米考星的疗效并解决上述问题。可用于递送药物的赋形剂可由可生物降解的各种材料(诸如脂类)制成，为了改善被递送的药物的疗效和安全性，这些赋形剂应是稳定且无毒的。目前，来自合成和天然来源的基于脂类的纳米粒被普遍用作赋形剂以通过受控的释放来改善生物利用率。研究发现，此类基于脂类的纳米粒通过提高药物溶出度、降低胃空速率以及延长释放速率来改善消化道组织的吸收能力。此外，脂类可加快淋巴循环：囊封在这些脂类纳米粒中的药物可与脂类一起通过淋巴吸收，这也被称为特洛伊木马效应。脂类纳米粒可改善药物的溶解和吸收，由此，这些颗粒可囊封并保护药物免遭破坏，并且可与在消化系统中充当乳化剂的水混合。此外，脂类纳米粒可通过派尔集合淋巴结(peyer’spatch)中的微皱褶或m细胞吸收，并直接进入淋巴系统以防止不完全吸收和首过代谢。关于全球专利数据库中有关替米考星组成成分的现有发明，有如下发现：公布号为“cn102327225”的发明“一种替米考星脂质体注射液及其制备方法”公开了一种替米考星生产方法，其中，粒径在7-10微米的范围内，组成成分为3-5克的大豆卵磷脂、5-10克的替米考星、1.5-2.5克的胆固醇、2克的非离子表面活性剂以及20毫升的水，用于生产替米考星的脂质体。然而，此发明的脂质体颗粒难以批量生产。此外，还有与替米考星纳米乳相关的各种其他公开物，如下：公布号为“cn101422432”的发明“一种替米考星纳米乳抗菌药物的制备方法”公开了替米考星纳米乳，其中，粒径在1-100微米的范围内，其包括以下组成成分：0.01-0.06％的替米考星、20.0-40.0％的表面活性剂/助表面活性剂、2.2-10.0％的油、以及用于调节体积的水。优选的油类型为肉豆蔻酸异丙酯(ipm)或乙酸乙酯。公布号为“cn101983632”的发明“一种复方替米考星纳米乳抗菌药物及其制备方法”公开了替米考星纳米粒，其粒径在1-100纳米(nm)的范围内，具有以下比率：0.01-15.2％的替米考星、0.001-2.12％的氟苯尼考、13.38-36％的表面活性剂、0-26.5％的助表面活性剂、2.43-5.32％的油、以及用于调节体积的水，其中优选地，油选自肉豆蔻酸异丙酯(ipm)或乙酸乙酯、14.89-84.17％的替米考星溶液、以及0.004-2.12％的氟苯尼考可溶物。公布号为“cn105640887”的发明“一种防治鸡毒支原体感染的复方纳米乳及其制备方法”公开了替米考星纳米乳，其包括4-10份的替米考星、10-25份的油、20-40份的表面活性剂、8-16份的助表面活性剂、5-20份的螺旋霉素以及0.1-5份的二羟丙茶碱。上述发明是替米考星的纳米乳颗粒，不同于本发明的替米考星纳米粒。其区别与纳米乳的组成成分有关，纳米乳包含非常高比率的表面活性剂，从而导致其生产过程较为浪费。以下示例中提供了与提高的替米考星溶解度有关的其他发明：公布号为“cn105640883”的发明“一种替米考星乳剂及其制备方法”公开了替米考星的乳剂，其中该乳剂不形成为颗粒，而是仅涉及溶解替米考星的过程，该乳剂包含2-20％的卵磷脂、2-20％的替米考星、以及1-10％的乳化剂。公布号为“cn104906039”的发明“一种替米考星注射用混悬剂及其制备方法”公开了有助于改善替米考星溶解度而不形成为颗粒的组成成分，其中所述组成成分包括5-30％的替米考星、0.1-5.0％的表面活性剂、0.01-1％的抗氧化剂、以及脂肪乳。此类发明仅改善溶解度，并不被视为颗粒聚类；因此，所得到的产品表现出不同的特性。此外，有现有技术涉及微乳颗粒的聚集，如公布号为“cn101947202”的“兽用微乳剂及其制备方法”，还有聚集微球的发明，如公布号为“cn101810582”的“一种兽用替米考星微球的制备方法”。事实上，研究发现，与根据现有技术制备替米考星有关的发明试图聚集颗粒以便利用各种混合比来改善替米考星的溶解度。然而，所得到的许多颗粒被视为纳米乳、微乳、微胶囊、脂质体或微球，它们在比率或所使用的化学品、粒径上存在差异，这取决于所得产品的品质；并且，用作原材料的不同替米考星类型会影响不同成品类型。即，现有发明优选地使用比替米考星碱具有更高水溶速率、但具有高毒性的磷酸替米考星。需要执行进一步的研究和开发任务来调查替米考星碱的使用，但这些任务具有相当大的不可预知性并且高度依赖于在相关领域具有专业技能的技术人员。对于根据本发明的替米考星纳米粒，本发明通过将替米考星碱作为替米考星纳米粒来开发通过动物消化道实现的替米考星的出色吸收效率，从而在其尺寸和特性上均不同于任意前述发明。技术实现要素：根据本发明的用于制备替米考星纳米粒的方法及其产品涉及合成替米考星纳米粒的方法，该替米考星纳米粒是用于控制和治疗动物呼吸系统感染的抗生素。组成成分大体上包括替米考星碱抗生素:表面活性剂:油:水的比率为0.3-0.6wt％:3-6wt％:0.5-5.5wt％:88-96wt％。根据本发明的用于制备替米考星纳米粒的方法及其产品的主要目的是，通过合成替米考星纳米粒形式的替米考星抗生素碱来以高稳定性且对消化系统无毒的方式开发通过动物消化道实现的替米考星药物的吸收效率。附图说明图1示出了合成替米考星纳米粒的一个实例的粒径和表面电荷；图2示出了替米考星纳米粒的一个实例的形态；图3示出了替米考星纳米粒的一个实例的形态；图4示出了替米考星纳米粒的一个实例的稳定性；图5示出了替米考星纳米粒的一个实例的稳定性；图6示出了替米考星纳米粒的一个实例的稳定性；图7示出了消化系统内的模拟细胞的数量；图8示出了消化系统内的模拟细胞的存活百分比；图9示出了消化系统中的模拟细胞；图10示出了对通过消化系统模拟细胞的渗透性进行比较的百分比。具体实施方式根据本发明的用于制备替米考星纳米粒的方法及其产品包括替米考星碱抗生素、表面活性剂、油和水，其中替米考星碱抗生素由至少95v％的替米考星溶液制得，由此，所述替米考星碱是一种用于控制或治疗动物呼吸系统感染的生物活性化合物。油充当转运替米考星碱的赋形剂以使药物易于吸收，其中，根据本发明的油是来自对动物无毒的天然原材料的合成油或蒸馏油。根据本发明的油可选自以下各项中的至少一种：植物油或动物油。植物基油可选自大豆油、玉米油、棕榈油精、棕榈油、椰子油、橄榄油、向日葵油、米糠油、油茶籽油、或其他类型的植物基油以及作为工业副产物的其他油。动物基油可选自鱼油、猪油、或任何其他动物油。在一个实施方案中，最优选的是大豆油。本发明中使用的表面活性剂优选不带电荷且选自以下各项中的至少一种：泊咯沙姆、聚山梨醇酯或山梨糖醇酯，其中聚山梨醇酯选自聚氧化乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯、聚氧化乙烯(20)山梨醇酐单硬脂酸酯、聚氧化乙烯(20)山梨醇酐单棕榈酸酯、聚氧化乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯。山梨糖醇酯选自山梨糖醇单油酸酯、山梨糖醇单硬脂酸酯、山梨糖醇单棕榈酸酯或山梨糖醇单月桂酸酯。在本发明的一个实施方案中，最优选的是聚氧化乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯或聚氧化乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯，或者是这两者一起使用。根据本发明的一个实施方案中的替米考星纳米粒包括以下组成成分：可选地，可添加添加剂，其中所述添加剂可改善组成成分的特性或品质，优选地选自调味剂或着色剂，其中调味剂是天然制剂或合成制剂或它们的组合；着色剂也可选自天然制剂或合成制剂或它们的组合。后文示出了替米考星纳米粒的组成成分的其他实施方案，这些实施方案不应被视为对本说明书或专利权利要求的任何部分构成限制。这些实施方案不将相关领域技术人员已知的化学品和其他比率限制为这些化学品具有类似的特性或产生类似的效果，并且因此，可在根据本发明的权利要求的范围内进行任何改进或修改。实例1：用于合成替米考星纳米粒的组成成分包括以下成分：实例2：用于合成替米考星纳米粒的组成成分包括以下成分：实例3：用于合成替米考星纳米粒的组成成分包括以下成分：实例4：用于合成替米考星纳米粒的组成成分包括以下成分：在根据本发明的替米考星纳米粒的制备方法的一个实施方案中，该方法包括以下步骤：1.制备：-将0.3-0.6wt％的替米考星碱与0.5-5.5wt％的油混合，然后添加3-6wt％的表面活性剂以完全形成均质混合物；-在给定温度范围内添加88-96wt％的水以充满100％的体积，其中该温度优选地介于60-90℃之间，最优选地，介于70-80℃之间。2.粒径减小：-减小从步骤1得到的混合物的粒径，优选地使用超声波破碎仪将颗粒的粒径减小至纳米级，超声波破碎仪探头的能量级优选地为20-40％安培、最优选地为30％安培，操作时段为3-8分钟、最优选地为5分钟。在合成替米考星纳米粒混合物的过程结束后，在室温下将纳米溶液静置一段时间以调节温度并降温从而得到具有高吸收效率、稳定性的替米考星纳米粒溶液，其中，可调节所述溶液到动物的递送从而以适合每个个体的重量或疾病严重度或受治疗动物的种类的份量来控制或治疗各种动物的呼吸系统感染。以下实例显示了各种配置的分析或实验结果，其中包括在通过根据参考4个实例所述的过程得到的合成替米考星纳米粒与作为常用产品的磷酸替米考星之间进行比较。表1：在用于分析和试验的根据本发明的样本中，用于合成替米考星纳米粒的组成成分的比例。粒径分析(水力学直径)和表面电荷(zeta电位)图1示出了在测量后得到的合成替米考星纳米粒的粒径和zeta电位。研究发现，样本的粒径取决于所使用的油的比例或体积。表2：合成替米考星纳米粒的样本的粒径和表面电荷。粒径(nm)表面电荷(mv)样本1104.3-23.7样本2151.6-25.1样本3133.9-23.5样本4127.0-29.l从表2中发现，包含不同油浓度(即，分别为1wt％、1.5wt％、2.5wt％和4.5wt％)的样本1、2、3和4分别形成104.3nm、151.6nm、133.9nm和127.0nm的粒径以及-23.7毫伏(mv)、-25.1毫伏(mv)、-23.5毫伏(mv)和-29.1毫伏(mv)的表面电荷。发现了超过-20mv的负电荷值。可以得出结论，根据本发明的替米考星纳米粒合成可产生小于200nm的具有良好稳定性的替米考星纳米粒。利用透射式电子显微镜(tem)进行形态评估在分析了透射式电子显微镜(tem)的形态之后发现，合成纳米粒与100nm的脂肪酸聚类相似，其中，得到的粒径类似于动态光散射(dlc)技术。来自tem的粒径稍小，因为测量是对如图2所示的干燥后的颗粒进行的，图2显示了通过透射式电子显微镜在25,000倍的放大率下以500nm的比例尺显示的替米考星纳米粒的形态特性。图3示出了由电子显微镜在200,000倍的放大率下以50nm的比例尺显示的抽样替米考星纳米粒的形态特性。利用水力学直径和表面电荷分析颗粒稳定性纳米粒稳定性分析可分为2个阶段：(1)在24天的周期内通过6轮升温(冻融)来培养纳米粒；(2)在1个月和2个月内以如下培养温度通过不同温度的升温来培养纳米粒：(2.1)4摄氏度；(2.2)25摄氏度；(2.3)45摄氏度表3：升温条件下在粒径和表面电荷方面的颗粒稳定性表3示出了升温条件下的颗粒稳定性分析。发现样本1表现出明显的粒径变化：从培养前的104.3nm变化成培养后的142.7nm；其表面电荷从培养前的-23.7mv变化成培养后的-40.9mv。研究发现，样本1的粒径在升温条件下表现出显著变化。此外，颗粒不形成任何沉淀或离析，并且粒径和表面电荷也在可用于实际生产或改进的可接受范围内。同时，通过考虑升温下的粒径和表面电荷，样本2、样本3和样本4的颗粒表现出极少变化，如图4所示。样本2显示出从培养前的151.6nm变化成培养后的130.7nm，其表面电荷相应地从-25.lmv变化成-35.7mv。样本3显示出从培养前的133.9nm变化成培养后的129.2nm，其表面电荷相应地从-23.5mv变化成-35.7mv。样本4显示出从培养前的127.0nm变化成培养后的120.6nm，其表面电荷相应地从-29.1mv变化成-32.0mv。通过分析替米考星纳米粒在粒径和表面电荷上的变化发现，所有样本在升温条件下都是稳定的。表4：在1个月的周期内在不同温度的升温条件下基于粒径和表面电荷来考虑颗粒稳定性。表4示出了通过分析1个月内在不同升温条件(即4℃、25℃和45℃)下的粒径和表面电荷得到的颗粒稳定性结果，如图5所示，其中替米考星纳米粒的稳定性由它们的在1个月内在不同升温条件下的粒径和表面电荷决定。在4℃、25℃和45℃的升温条件下，样本1在粒径上从培养前的104.3nm分别变化成125.9nm、122.2nm和118.7nm。在4℃、25℃和45℃的升温温度下，表面电荷也从培养前的-23.7mv分别变化成-22.6mv、-22.6mv和-24.2mv。在4℃、25℃和45℃的升温条件下，样本2在粒径上从培养前的151.6nm分别变化成157.2nm、158nm和157.1nm；在4℃、25℃和45℃的升温条件下，表面电荷也从培养前的-25.1mv分别变化成-26.3mv、-22.2mv和-22.2mv。在4℃、25℃和45℃的升温条件下，样本3在粒径上从培养前的133.9nm分别变化成139.6nm、139.7nm和140.9nm；在4℃、25℃和45℃的升温条件下，表面电荷也从培养前的-23.5mv分别变化成-23.0mv、-22.3mv和-27.lmv。在4℃、25℃和45℃的升温条件下，样本4在粒径上从培养前的127nm分别变化成128.2nm、125.9nm和127.0nm；在4℃、25℃和45℃的升温条件下，表面电荷也从培养前的-29.1mv分别变化成-27.6mv、-27.6mv和-25.1mv。表5：在2个月的周期内在不同升温条件下基于粒径和表面电荷来考虑颗粒稳定性。表5显示了2个月内在各种升温温度(即4℃、25℃和45℃)下基于粒径和表面电荷的颗粒稳定性分析结果，如图6所示，该图示出了在2个月的周期内在各种升温条件下基于粒径和表面电荷的替米考星纳米粒稳定性。在4℃、25℃和45℃的升温条件下，样本1的粒径从培养前的104.3nm分别变化成118.7nm、113.9nm和126.1nm；在4℃、25℃和45℃的升温条件下，表面电荷也从培养前的-23.7mv分别变化成-25.4mv、-24.0mv和-24.2mv。在升温温度(即4℃、25℃和45℃)下，在样本2中看到的粒径变化为：从培养前的151.6nm分别变化成159.8nm、158.7nm和156.0nm。在4℃、25℃和45℃的升温条件下，表面电荷从培养前的-25.1mv分别变化成-24.1mv、-23.6mv和-7.97mv。在升温温度(即4℃、25℃和45℃)下，在样本3中看到的粒径变化为：从培养前的133.9nm分别变化成138.0nm、137.9nm和138.1nm。在4℃、25℃和45℃的升温条件下，表面电荷从培养前的-23.5mv分别变化成-22.9mv、-23.4mv和-6.54mv。在升温温度(即4℃、25℃和45℃)下，在样本4中看到的粒径从培养前的127nm分别变化成126.1nm、125.6nm和121.9nm。在4℃、25℃和45℃的升温条件下，表面电荷从培养前的-29.1mv分别变化成-27.2mv、-27.4mv和-11.6mv。通过在1个月和2个月的周期内在各种温度的升温条件(即4℃、25℃和45℃)下分析粒径和表面电荷以及物理特性，根据阿伦尼乌斯方程(arrhenius’sequation)，2个月时的颗粒稳定性与1年等同，其被用来控制替米考星纳米粒在使用前的稳定性。试验结果显示，粒径和表面电荷未出现任何明显变化并且未出现任何替米考星纳米粒层沉淀或离析。可以得出结论，根据所制备的样本，替米考星显示出良好的稳定性，可用于生产或进一步开发。替米考星纳米粒和磷酸替米考星标准药物的毒性试验通过根据本发明的合成得到的替米考星纳米粒的毒性可通过以下方式来检测：创建动物消化系统的一组模拟细胞，并在使用浓度介于25-200ppm范围内的4个替米考星纳米粒样本和磷酸替米考星药物对动物消化系统的模拟细胞进行培养之后，在磷酸替米考星药物与4个替米考星纳米粒样本之间比较48小时。使用celltiter-发光法细胞活力检测试剂盒来测量细胞存活率，其中细胞应使用英杰公司(invitrogen,ltd.)的live/dead染色试剂盒来染色，如图7所示，该图显示了在使用200ppm的替米考星纳米粒和磷酸替米考星进行培养之后消化系统中的模拟细胞数量。分析结果应使用荧光来显示，其中，根据图8，活细胞将显示为绿色，死细胞将显示为红色，该图显示了在使用各种浓度的4个替米考星纳米粒样本和磷酸替米考星药物进行培养之后消化系统的细胞存活百分比。研究发现，用于试验4个替米考星纳米粒样本和磷酸替米考星药物的浓度对生物体是无毒的。替米考星纳米粒和磷酸替米考星标准药物的吸收能力比较根据本发明的合成替米考星纳米粒的吸收能力可通过以下方式来检测：创建动物消化系统的一组模拟细胞，并将磷酸替米考星标准药物与4个替米考星纳米粒样本进行比较，其中caco-2单层细胞的渗透性试验(使用培养了21-23天的caco-2对消化道组织进行的模拟吸收试验)通过以下方式来执行：在相对侧(bl-ap)上对从单层细胞的顶(ap)侧向基底(bl)侧的转移进行试验。图9示出了消化系统中的用于对替米考星纳米粒和磷酸替米考星标准药物进行吸收能力试验的模拟细胞，其中样本溶液是在30-120分钟的周期内在各时间从受体收集的，替米考星的量分为4个样本使用biooscientific公司的maxsignaltilmicosinelisa试剂盒来分析。研究发现，4个替米考星纳米粒样本的caco-2单层细胞渗透性快于磷酸替米考星标准药物，如图10所示，该图显示了通过消化系统细胞模拟得到的4个替米考星纳米粒和磷酸替米考星标准药物在各时间点的百分比渗透率。通过根据本发明的替米考星纳米粒制备方法得到的产品将形成小于200nm或者介于100-160nm范围内、表面电荷低于-20mv并且具有稳定性的替米考星纳米粒。粒径和表面电荷不显示任何显著变化。产品对对生物体无毒，而且吸收能力高且优于磷酸替米考星标准药物。通过根据本发明的制备方法得到的成品替米考星纳米粒可被进一步开发或与其他方法结合以得到任何合适的形式，如液体、固体或粉末形式或者不受选择限制的任何其他形式。尽管本发明是以某些实施方案和实例为背景来公开的，但本领域的技术人员应当理解，本发明可从具体公开的实施方案延伸到本发明的其他替代性实施方案和/或用途以及本发明的明显修改和等同物。本发明的最佳实施方案根据本发明的具体实施方式。当前第1页12