本发明属于生物医用材料领域，具体涉及具有抗肿瘤作用的纳米羟基磷灰石粒子其制备方法和用途。
背景技术：
羟基磷灰石是人体骨骼和组织中的主要无机成分，其对多种蛋白核酸分子具有吸附性、高结合性、生物相容性好以及良好的负载能力、可控释放等优点，已被广泛应用于生物医用领域，如硬组织修复材料、药物载体，基因载体等。
除此之外，越来越多的研究指出，纳米羟基磷灰石粒子能够诱导肿瘤细胞的凋亡，具有一定的抗肿瘤能力。如青芳竹等人通过水热反应法制备了粒径30～60nm，平均粒径为40nm的纳米羟基磷灰石粒子(ha-nps)，发现其对多种人肿瘤细胞(骨肉瘤细胞mg63、u-2os和saos-2以及肝癌细胞hepg2)具有选择性凋亡作用，且揭露了ha-nps对四种肿瘤细胞的抑制作用与其作用浓度和共培养时间相关：浓度越高，共培养时间越长，所受到的抑制作用越强，对各种细胞抑制强度依次为：骨肉瘤细胞mg63>骨肉瘤细胞u-2os>肝癌细胞hepg2>骨肉瘤细胞saos-2。最后，总结出：粒径30～60nm、浓度100～500μg/ml的ha-nps对细胞具有选择性的凋亡作用，ha-nps通过同时启动caspase依赖性的外源途径和内源途径诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞在体内的组织形成(青芳竹，纳米羟基磷灰石颗粒选择性诱导细胞凋亡的研究)。
又如钱江潮等人制备了不同大小、形貌和微观结构的纳米羟基磷灰石粒子，并以肝癌、胃癌、宫颈癌细胞为模型，考察了粒径为26nm、45nm、78nm和175nm的纳米羟基磷灰石粒子对肿瘤细胞的毒性作用，发现45nm的纳米羟基磷灰石粒子抗肿瘤效果最强。同时发现纳米羟基磷灰石粒子对肿瘤细胞的毒性作用还与细胞的种类有关，纳米羟基磷灰石粒子的毒性强度表现为mgc80-3＞hepg2＞hela(钱江潮，袁媛等，纳米羟基磷灰石抗肿瘤活性研究)。
上述研究披露了纳米羟基磷灰石粒子对肿瘤细胞的毒性作用与其粒子形貌、大小、浓度和作用时间有关，但关于不同结晶度对不同种类肿瘤细胞的毒性作用尚处于技术空白阶段，缺乏系统的研究。
其次，青芳竹和钱江潮等制备得到的纳米羟基磷灰石粒子证实对不同种类的肿瘤均具有一定的抑制作用，但是一般在≥400μg/ml的浓度，才具有较高的抑制率，有些甚至需要维持在1000μg/ml的浓度。因此，如何进一步提高纳米羟基磷灰石颗粒对肿瘤细胞的抑制作用是目前亟需解决的技术问题。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种具有抗肿瘤作用的纳米羟基磷灰石粒子及其制备方法和用途以解决上述技术问题。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：具有抗肿瘤作用的纳米羟基磷灰石粒子，该纳米羟基磷灰石粒子呈长棒状，其平均直径为10～50nm，平均长度为20～100nm，平均长径比为2～10，平均结晶度为30～80％，且粒度分布均匀。
进一步地，该纳米羟基磷灰石粒子平均直径为10～30nm，平均长度为30～80nm，平均长径比为3～8，平均结晶度为55-70％。
进一步地，该纳米羟基磷灰石粒子平均直径为20nm，平均长度为60nm，平均长径比为3，平均结晶度为60.3％。
进一步地，其由以下步骤制备得到：
s1、将0.2～1.0mol/l硝酸钙水溶液和0～10.0wt％的大分子模板水溶液混合，得混合溶液；
s2、在40～80℃下，将上述混合溶液与0.2～1.0mol/l磷酸氢二铵水溶液混合，钙磷比为1.50～1.67，以氨水调节溶液ph为9.0～11.0，搅拌反应6～12h，然后在40～80℃下陈化12～24h，得到含羟基磷灰石纳米粒子的浆料，将上述浆料在120～180℃下水热处理0～24h；
s3、将上述经水热处理后的浆料转移至板框式压滤机中，用去离子水或70～85v/v％乙醇溶液洗涤1～3次，压滤得到含纳米羟基磷灰石粒子的滤饼；
s4、将上述制备得到的滤饼进行球磨，加入适量水或70～85v/v％乙醇溶液，球磨4～12h，将球磨后的浆料经冷冻干燥后过筛分级，即获得具有良好分散性的纳米羟基磷灰石粒子。
进一步地，所述大分子模板选自聚乙烯醇、聚乙二醇、明胶、胶原和聚乳酸中的一种或两种。
进一步地，所述步骤s4还包括将过筛后的纳米羟基磷灰石粒子在200～800℃下煅烧1～120min。
进一步地，所述煅烧过程中加入0.01～5.00％的烧结助剂，所述烧结助剂为多孔球形碳酸钙。
相应地，本发明还提供了一种制备上述的具有抗肿瘤作用的纳米羟基磷灰石粒子的方法，包括以下步骤：
a)将0.2～1.0mol/l硝酸钙水溶液和0～10.0wt％的大分子模板水溶液混合，得混合溶液；
b)在40～80℃下，将上述混合溶液与0.2～1.0mol/l磷酸氢二铵水溶液混合，钙磷比为1.50～1.67，以氨水调节溶液ph为9.0～11.0，搅拌反应6～12h，然后在40～80℃下陈化12～24h，得到含羟基磷灰石纳米粒子的浆料，将上述浆料在120～180℃下水热处理0～24h；
c)将上述经水热处理后的浆料转移至板框式压滤机中，用去离子水或70～85v/v％乙醇溶液洗涤1～3次，压滤得到含纳米羟基磷灰石粒子的滤饼；
d)将上述制备得到的滤饼进行球磨，加入适量水或70～85v/v％乙醇溶液，球磨4～12h，将球磨后的浆料经冷冻干燥后过筛分级，即获得具有良好分散性的纳米羟基磷灰石粒子。
进一步地，所述步骤d)中还包括将过筛后的纳米羟基磷灰石粒子在200～800℃下煅烧1～120min，其中采用马弗炉烧结、微波烧结和微波辅助加热方法中的一种进行煅烧。
进一步地，所述步骤d)中所述煅烧过程中还加入0.01～5.00％烧结助剂，所述烧结助剂为多孔球形碳酸钙。
发明人通过将不同结晶度的纳米羟基磷灰石粒子(31.7％、40.7％、43.0％、55.1％、60.3％、65.7％、78.9％、64.3％、68.1％)与黑色素瘤细胞(a375)共培养，发现55～70％结晶度的纳米羟基磷灰石粒子对黑色素瘤细胞的抑制效率较高，其以200～300μg/ml的浓度存在即可均达到55％以上的肿瘤抑制率，在一定结晶度范围内，抑制作用随着浓度增加而增强。而结晶度过高(>70％)和过低(<50％)的纳米羟基磷灰石对黑色素瘤细胞的抑制作用均较弱，纳米羟基磷灰石粒子浓度过高(>300μg/ml)或较低(<200μg/ml)对黑色素瘤细胞的抑制作用也不甚理想，抑制率均低于50％。
此次，本发明另一个关键点在于煅烧过程中加入了烧结助剂，所述烧结助剂为多孔球形碳酸钙，其能够克服羟基磷灰石粒子在煅烧过程中结晶度过快增加的问题，并且还能起到细化晶核的作用。实施例7与实施例5相比不加入烧结助剂，相同煅烧条件下生产的纳米羟基磷灰石粒子结晶度较高。而加入碳酸钙作为烧结助剂，其无法起到克服羟基磷灰石粒子在煅烧过程中结晶度过快增加的问题。
本发明具有以下优点：
1)本发明提供了一种纳米羟基磷灰石颗粒，其对肿瘤细胞具有优异的抑制作用，其中200～300μg/ml55％～70％结晶度的纳米羟基磷灰石与黑色素瘤细胞细胞共培养，抑制率均可达到55％以上，与现有技术相比取得了显著的进步。
2)本发明通过在烧结过程中加入一种新型的烧结助剂，其能够克服羟基磷灰石粒子在煅烧过程中结晶度过快增加的问题，并且还能起到细化晶核的作用。
附图说明
图1为本发明实施例1～9所述纳米羟基磷灰石粒子的xrd图谱；
图2为本发明实施例3和实施例5所述纳米羟基磷灰石粒子的tem图谱；
图3为空白组和植入纳米羟基磷灰石粒子组术后4周肿瘤体积的对比图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
本发明公开了一种具有抗肿瘤作用的纳米羟基磷灰石粒子，该纳米羟基磷灰石粒子呈长棒状，其平均直径为10～50nm，平均长度为20～100nm，平均长径比为2～10，平均结晶度为30～80％，且粒度分布均匀。
制备方法：
a)将0.5mol/l硝酸钙水溶液和3.0wt％的大分子模板水溶液混合，得混合溶液；
b)在60℃下，将上述混合溶液与0.5mol/l磷酸氢二铵水溶液混合，钙磷比为1.67，以氨水调节溶液ph为11.0，搅拌反应12h，然后在60℃下陈化12h，得到含羟基磷灰石纳米粒子的浆料，将上述浆料在150℃下水热处理12h；
c)将上述经水热处理后的浆料转移至板框式压滤机中，用去离子水或75v/v％乙醇溶液洗涤3次，压滤得到含纳米羟基磷灰石粒子的滤饼；
d)将上述制备得到的滤饼进行球磨，加入适量水或75v/v％乙醇溶液，球磨4～12h，将球磨后的浆料冷冻干燥12h后过筛分级；
e)将过筛后的纳米羟基磷灰石粒子，采用微波加热烧结进行煅烧，煅烧温度为600℃，煅烧时间3min，即获得具有良好分散性的纳米羟基磷灰石粒子。
在上述的基础上按下表制备方法得到不同结晶度的纳米羟基磷灰石粒子
试验例一、材料表征
材料表征：采用x-ray衍射分析测定实施例1～9所述纳米羟基磷灰石粒子的x射线衍射图谱(图1)，以便对其粒径和结晶度进行核算，采用透射电子显微镜观察材料的表面形貌和微观结构，如图2所示，其中，(a)图为实施例3得到的粉体的tem图，平均长径比为6，(b)图为实施例5得到的粉体的tem图，平均长径比为3。
结晶度确定方法：(试样的10个特征峰积分强度之和)×100％/(标样的10个特征峰积分强度之和)代表了试样中的羟基磷灰石结晶相的含量。结果用百分比表示。(参照gb23101.3-2010外科植入物羟基磷灰石第3部分：结晶度和相纯度的化学分析和表征)
计算结果如表1所示。
表1实施例1～9制备得到的纳米羟基磷灰石粒子的形貌和结晶度
试验例二、不同结晶度的纳米羟基磷灰石的体内和体外抗肿瘤活性
2.1体外抗肿瘤活性
2.1.1实验目的：采用mtt法考察实施例1～9制备得到的纳米羟基磷灰石粒子对黑色素瘤细胞的增殖活性的影响。
2.1.2试验方法：取实施例1～9制备得到的纳米羟基磷灰石粒子经灭菌后，将用dmem高糖培养基稀释成浓度为250μg/ml的纳米羟基磷灰石悬浮液。
取对数期生长的黑色素瘤细胞(a375)，0.25％胰蛋白酶消化，待细胞变圆脱离培养皿时立即终止消化，用血球计数板对细胞进行计数后，配制成2×104个/ml细胞悬液，将此细胞悬液按每孔1ml接种到96孔板中，待细胞贴壁后，吸掉培养基，加入1ml各纳米羟基磷灰石悬浮液继续于37℃恒温、5％co2中培养72h。培养结束后，每孔加入30μlmtt试剂，37℃恒温继续孵育4h后，吸掉上层液，每孔加入200μldmso，常温震荡10min后，并离心去掉材料，每孔取出150μl放入新的96孔酶标板中在490nm波长处检测每孔的吸光值，每个样品做3个平行样，样品组与空白对照组数据的比值作为粒子在
孵育条件下对肿瘤细胞的毒性效果。试验结果如表2所示。
抑制率(％)＝无材料空白对照组吸光值-样品组吸光值/空白对照组数据吸光值×100％
表2不同结晶度的纳米羟基磷灰石对黑色素瘤细胞的体外增殖
活性的影响
由上表2可知，相同浓度的31.7％、40.7％、43.0％、55.1％、60.3％、65.7％、78.9％、64.3％和68.1％结晶度的纳米羟基磷灰石之间对黑色素瘤细胞抑制效率差别较大，在一定结晶度范围内，抑制作用随着浓度增加而增强。其中以55.1％、60.3％、65.7％、64.3％、68.1％结晶度的纳米羟基磷灰石对黑色素瘤细胞抑制作用最强，抑制率均达到55％以上，尤其是实施例5(60.3％的结晶度)，250μg/ml时抑制率可达到64.5％。而结晶度过高(>70％)和过低(<50％)的纳米羟基磷灰石对黑色素瘤细胞的抑制作用均较弱。
2.2体内抗肿瘤活性
2.2.1肿瘤组织块准备：
无菌条件下，用手术刀切取肿瘤组织，所用的肿瘤组织系vx2肿瘤细胞株悬液注射到新西兰大白兔皮下21天形成。用无菌生理盐水冲洗肿瘤组织上附着的血液，并去除坏死组织及肿瘤表面纤维薄膜，保留新鲜鱼肉状肿瘤组织；用无菌眼科剪将其剪成2*2*2立方毫米的肿瘤组织块，放置盛有无菌生理盐水的手术平皿中备用。
2.2.2实验动物准备：
麻醉实验动物(新西兰大白兔)后，进行备皮、皮肤消毒与铺巾等术前准备；在背部双侧行手术切口，分离皮下组织，使腰大肌完全暴露，在双侧行1cm手术切口。
2.2.3植入纳米粒子材料，建立抗肿瘤模型：
将辐照灭菌的实施例5纳米羟基磷灰石粉体材料250mg均匀包覆在2*2*2立方毫米的肿瘤组织块外，沿一侧手术切口放置在腰大肌内部，对侧肌肉手术切口内放置没有包裹纳米粒子的相同大小肿瘤组织块作为对照组，缝合双侧肌肉及皮肤。
2.2.4结果
术后2/3/4周，对肿瘤体积进行测量，并统计抑制率，结果如下表3所示，肿瘤组织未植入材料(空白组，图a)和植入纳米羟基磷灰石粒子(图b)术后4周后的对比如下图3所示，从图3可以看出，植入纳米羟基磷灰石粒子后肿瘤体积有明显的缩小。
抑制率(％)＝对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积/对照组肿瘤体积×100％
表3实施例5纳米羟基磷灰石体内增殖活性
2.3不同浓度的60.3％结晶度的纳米羟基磷灰石对黑色素瘤细胞的增殖活性的影响
取实施例5制备得到的60.3％结晶度的纳米羟基磷灰石，经高温灭菌后，将用dmem高糖培养基稀释成浓度为0、100、200、250、300和400μg/ml的纳米羟基磷灰石悬浮液，按照2.1试验方法考察不同浓度的60.3％结晶度的纳米羟基磷灰石对黑色素瘤细胞的毒性效果，测试结果如表4所示。
表4不同浓度的60.3％结晶度的纳米羟基磷灰石对黑色素瘤细胞的增殖活性的影响
由上表可知，200～300μg/ml60.3％结晶度的纳米羟基磷灰石粒子对黑色素瘤细胞的抑制率达到50％以上，抑制作用随浓度增加而增强，其中250μg/ml的纳米羟基磷灰石粒子对黑色素瘤细胞的抑制率最高，达到64.5％以上，与现有技术相比取得了显著的进步。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。