本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种Apelin脂质体及其制备方法。
背景技术：
：Apelin(爱帕琳肽)是人体内的一种重要功能肽。在体内蛋白酶的作用下，含有77个氨基酸的Apelin前肽裂解为具活性的Apelin片段，其片段依据氨基酸长度可分为：Apelin-13(十三肽)、焦谷氨酸型Apelin-13([Pyrl]-Apelin-13)、Apelin-17(十七肽)、Apelin-36(三十六肽)、Apelin-55(五十五肽)等(EuropeanJournalofPharmacology2015，763：149-159)，本文中，将上述Apelin片段统称为“Apelin”。Apelin是血管紧张素II样-1受体(APJ)的内源性配体。APJ受体亦称Apelin受体，是孤儿G-蛋白-偶联受体(GPCR)家族的一员。APJ受体的结构类似于血管紧张素II1型受体(AT1)，与AT1具有重要的同源序列，但差别在于APJ受体并不能与血管紧张素II结合。Apelin/APJ系统在生物体内广泛分布，在体内多种器官细胞上表达，尤其在心血管、中枢神经、肺血管等系统表达水平较高。近年，许多证据表明Apelin/APJ系统在心血管疾病、糖尿病、肿瘤、中枢神经系统疾病等病理生理过程中发挥作用，是治疗许多疾病的潜在重要靶点(PharmacologicalReviews2010，62：331-342)。然而，Apelin在生物体内的半衰期极短，有文献报道，动物静脉注射Apelin溶液，5分钟后体内就已经检测不到Apelin原型药物(Hypertension2016，68：365-377)。半衰期短这一缺陷，严重阻碍了Apelin临床治疗用药品的开发。针对Apelin在生物体内半衰期极短的缺陷，现有技术通常采用化学修饰的方式延长其半衰期。例如，WO2012/125408公开了一种聚乙二醇(PEG)化学修饰的Apelin，通过化学键将一个或多个分子量5000Da至50000Da的PEG分子连接到一个Apelin的N-末端的氨基酸残基上。与非PEG修饰的Apelin相比，PEG修饰的Apelin半衰期有一定的延长。WO2014/152955公开了一种包含融合至多聚组分的Apelin融合蛋白或Apelin融合多肽，在体外环境下将其与血浆或血清孵育，可获得约1～10小时的体外血浆或血清半衰期。WO2015/013169公开了一种合成的Apelin多肽的生物缀合物，通过共价连接或融合的方式将多肽与延长半衰期的结构进行化学连接，实现延长Apelin半衰期的目的。WO2015/013165公开了一种环状Apelin衍生物，通过更改Apelin的序列或空间结构增加Apelin的半衰期；WO2015/147641公开了一种合成的环状的Apelin类似物，环状的Apelin类似物在大鼠血浆中的稳定性至少为3小时，体外半衰期延长。WO2016/116842公开了化学合成的Apelin脂肪酸缀合物，通过PEGlinker连接脂肪酸等基团，增加了Apelin的半衰期，提供更长的体内循环时间。但是，上述化学修饰途径也存在Apelin活性下降，产率低、产业化困难等问题，严重影响了Apelin的成药性及其药用产品的开发。近年，也有学者采用物理包裹的方式延长Apelin在体内的作用时间。US2016/0058705A1公开了一种Apelin组合物及其制备方法，采用PEG修饰的脂质体将Apelin包载，实现Apelin在生理条件下的缓慢释放，提高Apelin的抗蛋白降解能力，延长药物在体内的作用时间。但是，该脂质体的制备工艺为薄膜分散法，属于实验室阶段技术，很难实现工业化大生产。不足的是，该专利公开的脂质体对Apelin的包封率仅有30％左右，未实现对其高效包封。另外，该工艺中使用了二氯甲烷或氯仿，易对生物体的中枢神经系统产生较大的毒性，甚至诱发致畸、致突变等严重副作用，因此必须对溶剂残留进行严格控制，间接地增加了生产成本。综上，不难发现，虽然现有的化学修饰及物理包裹技术等都能一定程度地延长Apelin在生物体内的半衰期或体内作用时间，但也存在一定问题，如Apelin的化学修饰存在一定程度上降低了药物原有活性、产业化困难、产率低等问题；而US2016/0058705A1公开的脂质体技术采用的制备工艺为薄膜分散法，该工艺属于实验室阶段技术，也存在产业化困难等问题，不足的是该工艺对Apelin的包封率较低，不符合现实的临床用药需求。此外，该工艺中使用的二氯甲烷或氯仿等有机溶剂，易对人体及环境造成危害。虽然二氯甲烷或氯仿等有机溶剂可采用一些技术手段在终端制剂中除去，但也增加了脂质体通过人体静脉注射使用的临床用药风险。技术实现要素：针对上述现有技术存在的缺点或不足，本发明的目的在于提供一种高包封率、且半衰期长的Apelin脂质体，并提供一种简单、环保、易产业化的Apelin脂质体的制备方法。本发明提供以下方案：一种Apelin脂质体，其特征在于，包含Apelin、磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物，且Apelin与磷脂酰甘油的摩尔比为1∶2～1∶10。优选Apelin与磷脂酰甘油的摩尔比为1∶4～1∶10。优选Apelin与磷脂酰胆碱的摩尔比为1∶2～1∶10。优选Apelin与胆固醇的摩尔比为1∶2～1∶16。优选Apelin与磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物的摩尔比为1∶0.2～1∶3。优选Apelin为选自[Pyrl]-Apelin-13、Apelin-13、Apelin-17、Apelin-36、Apelin-55及它们药学上可接受盐中的一种；磷脂酰甘油为选自二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二芥酰磷脂酰甘油及1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰甘油中的任一种；磷脂酰胆碱为选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二月桂酰基卵磷脂、二油酰基磷脂酰胆碱、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂及二花生酰基磷脂酰胆碱中的任一种；磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物为选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇3400、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000及二油酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000中的任一种。另外，优选Apelin为[Pyr1]-Apelin-13或其药学上可接受的盐。另外，本发明的Apelin脂质体还可以包含冻干保护剂，且所述冻干保护剂占液态脂质体重量体积比的0～30％(g/mL)。所述冻干保护剂为选自蔗糖、乳糖、海藻糖、甘露醇中的至少一种。此外，本发明还提供一种Apelin脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)有机相的制备，将Apelin、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物称量于容器内，使Apelin与磷脂酰甘油的摩尔比为1∶2～1∶10，然后，加入适量有机溶剂使其完全溶解，体系呈现均相溶液；(2)水相的制备，称取冻干保护剂，在50℃～75℃水浴条件下，用适量的灭菌注射用水使其完全溶解，制得水相；(3)脂质体初品的制备，在50℃～75℃水浴条件下将(1)所得的有机相和(2)所得的水相混合，在100～500转/分钟的条件下，搅拌10～30分钟，得到脂质体初品；(4)脂质体粒径控制，将(3)所得的脂质体初品置于均质机，在600～2000Bar均质压力条件下循环1～10次，得到最终的液体脂质体制剂，脂质体的平均粒径在50～500nm之间；(5)脂质体冻干，将(4)所得的液体脂质体制剂除热源，除菌，分装，冷冻干燥得到脂质体冻干粉末。通过本发明，能够获得高效包封、且半衰期长的Apelin脂质体，且该Apelin脂质体的制备方法简单、环保、易产业化。附图说明图1为[Pyr1]-Apelin-13溶液剂和本发明的[Pyr1]-Apelin-13脂质体在大鼠中的血药浓度时间曲线。具体实施方式为了提高脂质体对Apelin的包封率，延长Apelin在生物体内的半衰期，解决现有物理包裹技术的不足，本发明的发明人进行了大量的研究，基于脂质体经典配方(膜材组成为磷脂酰胆碱、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物)，用多种方法将Apelin制备成PEG化脂质体，分别使用薄膜分散法、逆相蒸发法、乙醇注入法、硫酸铵梯度法、pH梯度法、醋酸钙梯度法等常规方法制备PEG修饰的Apelin脂质体，结果与US2016/0058705A1公开的PEG修饰的Apelin脂质体类似，所得脂质体包封率均在30％左右，未能实现对Apelin的高效包载。本领域技术人员都非常清楚，薄膜分散法制备脂质体时不可避免地要用到二氯甲烷和/或氯仿；逆相蒸发法中用到乙醚和/或甲醇，这些有机溶剂均易对人体及环境造成危害；硫酸铵梯度法、醋酸钙梯度法和pH梯度法等制备方法中涉及铵梯度、醋酸钙梯度和pH梯度的建立，工艺中要进行大量的透析和/或离子交换，存在操作繁琐复杂、生产成本高、工业化生产重现性差等不足；依据脂质体经典配方(膜材组成为磷脂酰胆碱、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物)，采用可实现工业化生产的乙醇注入法，所制备的脂质体包封率低，不能满足临床用药需求。经潜心研究后，本发明的发明人意外发现：通过向上述现有的脂质体经典配方(膜材组成为磷脂酰胆碱、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物)中加入特定量的磷脂酰甘油，即，脂质体膜材包含磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、胆固醇及磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物，且使Apelin与磷脂酰甘油的摩尔比为1∶2～1∶10时，通过简单的乙醇注入法，即可得到包封率大于90％的Apelin脂质体。本发明的Apelin脂质体中，包含作为药物活性成分的Apelin和脂质体膜材。其中，Apelin浓度为0.005～10mg/mL，优选为1mg/mL，脂质体膜材包含磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物，通过使Apelin与磷脂酰甘油的摩尔比为1∶2～1∶10、优选1∶4～1∶10，能够实现对Apelin的高效包封，包封率达90％以上。对于磷脂酰胆碱、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物等脂质体膜材，可以按照脂质体经典配方中通常所采用的配比进行使用，具体而言，在本发明中，Apelin与磷脂酰胆碱的摩尔比为1∶2～1∶10，优选1∶3～1∶8，进一步优选1∶4～1∶7；Apelin与胆固醇的摩尔比为1∶2～1∶16，优选1∶2～1∶8，进一步优选1∶3～1∶6；Apelin与磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物的摩尔比为1∶0.2～1∶3，优选为1∶0.2～1∶1，进一步优选1∶0.4～1∶0.8。以下，基于实施例和试验例，进一步详细地说明本发明。在本发明中，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。需要说明的是，以下试验例及实施例只是用于针对本发明进行具体说明，本发明并不限定于此。说明书中所用各成分的简称如下述表1所示。表1本发明中使用的Apelin类型及其氨基酸序列如“EuropeanJournalofPharmacology2015，763：149-159”所示，具体如下述表2。这些Apelin均购自希施生物科技(上海)有限公司。实施例1处方：[Pyrl]-Apelin-130.058mmolDSPG0.116mmolDSPC0.116mmolCH0.116mmolDSPE-mPEG20000.012mmol蔗糖10g海藻糖5.5g灭菌注射用水加至100mL工艺：(1)有机相的制备，将上述处方量的Apelin、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、胆固醇、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇衍生物称量于容器内，加入适量有机溶剂使其完全溶解，体系呈现均相溶液，所述有机溶剂选自乙醇或乙醇/水混合溶液；(2)水相的制备，称取上述处方量的冻干保护剂，在50℃～75℃水浴条件下，用适量的灭菌注射用水使其完全溶解，制得水相；(3)脂质体初品的制备，在50℃～75℃水浴条件下将(1)所得的有机相和(2)所得的水相混合，在100～500转/分钟的条件下，搅拌10～30分钟，得到脂质体初品；(4)脂质体粒径控制，将(3)所得的脂质体初品置于均质机，在600～2000Bar均质压力条件下循环1～10次，得到最终的液体脂质体制剂，脂质体的平均粒径在50～500nm之间；(5)脂质体冻干，将(4)所得的液体脂质体制剂除热源，除菌，分装，冷冻干燥得到脂质体冻干粉末。将所得脂质体冻干制剂用5％葡萄糖注射液复溶至1mg/ml，即得Apelin脂质体溶液，取此溶液0.5mL加至超滤离心管(30K道尔顿)的上层，然后将离心管放入离心机，6000rpm离心30min，收集下层液体，通过高效液相色谱法(HPLC)测定下层的游离药物的含量A；用破乳剂将所得脂质体破坏，通过HPLC测定脂质体制剂中药物总含量B。通过下述公式测定脂质体的包封率，测定结果为95％。脂质体的包封率(E％)＝(1-A/B)*100％实施例2～45实施例2～45按照下述表3～5所示处方，采用与实施例1相同的制备方法进行制备，得到Apelin脂质体。并采用与实施例1相同的测定方法测定包封率，结果一同示于表3～5。由上述实施例1～45可知，通过本发明能够获得包封率高达90％以上的Apelin脂质体。试验例试验例一、不含磷脂酰甘油的Apelin脂质体1、不含磷脂酰甘油的Apelin脂质体的制备依据常规脂质体的经典处方，按下述表6所示的处方1～10及上述实施例1的制备方法制备不含磷脂酰甘油的Apelin脂质体。表62、脂质体包封率的测定针对由处方1-10制备的Apelin脂质体，按照与上述实施例1相同的包封率测定方法进行测定，测定结果如表7所示。表7处方处方1处方2处方3处方4处方5处方6处方7处方8处方9处方10E％30261823321925283027表6和表7的实验数据表明，采用不含磷脂酰甘油的常规经典脂质体处方制备的Apelin脂质体包封率均在20％～30％之间，均未实现对Apelin的高包封率，均不符合脂质体制剂临床应用时包封率的基本要求。试验例二、磷脂酰甘油的用量对Apelin脂质体包封率的影响1、含磷脂酰甘油的Apelin脂质体的制备按下述表8所示的处方11-20及上述实施例1的制备方法制备Apelin脂质体。表82、Apelin脂质体包封率的测定针对基于上述处方11-20制备的Apelin脂质体，按照与上述实施例1相同的方法测定包封率，结果如表9所示。表9处方处方11处方12处方13处方14处方15处方16处方17处方18处方19处方20E％3540529198999999NANANA：表示无法成功制备脂质体，故不能测定具包封率。将处方1～10(特别是处方2)与处方11～18比较可知，通过在Apelin常规长循环脂质体处方中添加磷脂酰甘油，Apelin脂质体的包封率呈增加趋势，当Apelin与磷脂酰甘油的摩尔比在特定范围内时，即在1：2～1：10的范围内时，能够得到包封率高达90％以上的Apelin脂质体。试验例三、Apelin的类型对脂质体包封率的影响1、Apelin的脂质体的制备：按表10中处方21-25及上述实施例1所述的制备方法制备含有不同Apelin类型的载药脂质体。表102、Apelin脂质体包封率的测定针对基于上述处方21-25制备的Apelin脂质体，按照与上述实施例1相同的方法测定包封率，结果如下述表11所示。表11处方组成处方21处方22处方23处方24处方25包封率(E％)9997999899由表10及表11的数据可知，按照本发明的特定组成，当药物活性成分为[Pyrl]-Apelin-13、Apelin-13、Apelin-17、Apelin-36、Apelin-55时，均能制成高包封率的脂质体。试验例四、磷脂酰甘油种类对Apelin脂质体包封率的影响1、Apelin的脂质体的制备使用不同种类的磷脂酰甘油，按表12中的处方26～32及上述实施例1所述的制备方法制备含有Apelin的脂质体。表122、Apelin脂质体包封率的测定针对基于上述处方26-32制备的Apelin脂质体，按照与上述实施例1相同的方法测定包封率，结果如表13所示。表13处方处方26处方27处方28处方29处方30处方31处方32包封率(％)99969897989998上述实验数据表明，只要磷脂酰甘油与Apelin的摩尔比在本发明的范围内，则不论使用何种磷脂酰甘油，Apelin脂质体的包封率均在90％以上，均实现了对Apelin的高效包封。试验例五、Apelin脂质体在大鼠体内生物半衰期的考察以自制[Pyr1]-Apelin-13溶液剂作为对照，对本发明所述的Apelin脂质体制剂进行了大鼠体内生物半衰期的考察。1、给药供试品制备(1)[Pyrl]-Apelin-13溶液剂的制备处方：处方组成处方用量[Pyrl]-Apelin-130.058mmol5％葡萄糖溶液加至100mL工艺：称取处方量的[Pyrl]-Apelin-13，室温搅拌条件下用5％葡萄糖溶液使其完全溶解，之后用5％葡萄糖溶液定容至100mL，过0.22μm微孔滤膜，即得自制[Pyr1]-Apelin-13溶液剂，[Pyr1]-Apelin-13规格为1mgmL-1。(2)[Pyr1]-Apelin-13脂质体制备按照上述处方16制备[Pyr1]-Apelin-13脂质体，包封率高达99％。[Pyrl]-Apelin-13规格为1mg/mL，给药前用5％葡萄糖溶液复溶。2、不同[Pyr1]-Apelin-13制剂在大鼠体内生物半衰期的考察(1)实验动物信息SPF级SD大鼠，雄性12只，体重190g至210g，斯贝福(北京)生物技术有限公司提供。(2)给药方案和血浆样品采集处理静脉注射给药，给药剂量均为10mg/kg，将大鼠随机分为自制[Pyr1]-Apelin-13溶液剂组、[Pyrl]-Apelin-13脂质体组，共2组(n＝6)，固定大鼠，通过尾静脉给药。在给药后不同时间点经颈静脉插管采全血0.2mL，置于1.5mLEDTA-2K抗凝离心管中，采血后从插管内补充0.2mL生理盐水并用50μL肝素钠溶液(50IU/mL)封管以备下一个时间点的顺利采集。血样在4℃下4000g离心5分钟，分离出血浆，沉淀蛋白血样，LC-MS/MS测定给予供试品后大鼠血浆中受试物的浓度，并计算生物半衰期。取血点：a)[Pyrl]-Apelin-13溶液剂组，给药后1min，3min，5min，10min，15min，30min，1h，2h采集血样；b)[Pyr1]-Apelin-13脂质体组，给药后1min，15min，30min，1h，4h，8h，24h，48h，72h，96h采集血样；(3)实验结果[Pyr1]-Apelin-13的溶液剂和脂质体制剂的血药浓度的经时变化曲线如图1所示，在大鼠体内的生物半衰期如下述表14所示。表14处方[Pyr1]-Apelin-13注射液[Pyr1]-Apelin-13脂质体半衰期(h)0.0169.5上述实验数据表明，[Pyrl]-Apelin-13注射液在大鼠体内生物半衰期极短，仅有0.016h(约1min)左右；而本发明的[Pyr1]-Apelin-13脂质体在大鼠体内生物半衰期显著延长，达9.5h。上述结果表明：相比于[Pyr1]-Apelin-13注射液，本发明的Apelin脂质体显著地延长了药物的半衰期，其半衰期是Apelin溶液剂的约590倍。综上所述，本发明提供的Apelin脂质体，可实现对Apelin的高效包封，包封率90％以上，并且该脂质体显著延长Apelin在生物体内的半衰期，本发明提供的Apelin脂质体的生物半衰期是Apelin溶液剂的约590倍。以上旨在进一步说明本发明，并不对本发明的范围加以限制。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。当前第1页1 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