本发明涉及一种多价键纳米凝胶及其在宫颈癌原位治疗药物中的用途，属于抗癌药物肿瘤技术治疗领域。
背景技术：
宫颈癌是全球女性中最常见的癌症之一，每年大约有27.5万的妇女死于宫颈癌。对于晚期宫颈癌患者，全身给药难以到达粘膜组织，很大程度上降低了药物的疗效。同时，肿瘤的多药耐药性限制了大多数现有化疗药物的药效。然而，对于宫颈癌来说，通过阴道给药的方式能够更有效地进入宫颈，并且无肝脏首过效应。另外，阴道的表面积很大，有助于药物较强的吸附。鉴于以上优点，阴道给药被认为是宫颈癌治疗的有利选择。
随着生物医药领域的不断发展，最近已有大量的文献报道了用于阴道给药的各类阴道制剂，如凝胶(science,329,2010,1168-1174)，片剂(internationaljournalofbiologicalmacromolecules,69,2014,124-136)，薄膜(journalofbiomaterialsandtissueengineering,4,2014,796-803)和阴道环(antimicrobialagentsandchemotherapy,58,2014,2841-2848)等。然而，其中只有极少数被证明可用于宫颈癌的治疗。这主要是因为所有这些制剂的功效都具有以下的缺点而不能满足患者的治疗需求。例如，阴道凝胶倾向于输送亲水性的药物，易于从阴道泄漏。而其他的制剂也具有滞留时间较短的问题。作为改善阴道内输送药物的手段，粘膜粘附性药物已被广泛用于输送药物的研究。一方面，粘膜粘附系统可以粘附在粘膜上，改善药物的局部浓度。另一方面，大多数的粘膜粘附系统能够帮助药物穿过粘膜，克服粘膜的屏障功能。尽管如此，除了突破粘膜屏障之外，还需要克服耐药性，以提高药物的使用效率。肿瘤的多药耐药性在癌细胞中的主要作用机制是排出化疗药物外排泵的表达，即p糖蛋白的表达。因此，设计出一种既能穿越粘膜屏障，并且能克服多药耐药性的载药体系，将会是治疗宫颈癌的有效手段。
技术实现要素：
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种多价键纳米凝胶及其在宫颈癌原位治疗药物中的用途，该凝胶材料有利于药物更好地穿越粘膜屏障到达病灶部位，并且能克服肿瘤药物多药耐药性的缺点，从而解决了现有肿瘤治疗技术中普遍存在的药效低的问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了一种多价键纳米凝胶，其由聚丙烯酸接枝环糊精聚合物和聚丙烯酸接枝紫杉醇聚合物通过非共价键复合而成，所述聚丙烯酸接枝紫杉醇聚合物的结构式如式i所示：
作为优选方案，所述聚丙烯酸接枝环糊精聚合物的结构式如式ii所示：
作为优选方案，所述纳米凝胶的粒径为80～100nm。
第二方面，本发明提供了一种如前述的多价键纳米凝胶的制备方法，其包括如下步骤：
分别制备聚丙烯酸接枝环糊精聚合物和聚丙烯酸接枝紫杉醇聚合物；
将所述聚丙烯酸接枝环糊精聚合物和聚丙烯酸接枝紫杉醇聚合物在去离子水中混匀，通过非共价键形成所述多价键纳米凝胶。
作为优选方案，所述聚丙烯酸接枝环糊精聚合物和聚丙烯酸接枝紫杉醇聚合物的摩尔比为1:5，其中，环糊精与紫杉醇的摩尔比为1:1。
作为优选方案，所述聚丙烯酸接枝紫杉醇聚合物的制备方法为：
将聚丙烯酸和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐分散在溶剂中，在冰浴下反应后，加入紫杉醇和4-二甲氨基吡啶，在室温下进行反应，依次用二甲基亚砜和去离子水进行透析，得到聚丙烯酸接枝紫杉醇聚合物。
作为优选方案，所述聚丙烯酸中的羧基与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:1～1:1.5；聚丙烯酸中的羧基与紫杉醇的摩尔比为15:1～10:1；聚丙烯酸中的羧基与4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:1～1:1.5；所述溶剂为无水n,n-二甲基甲酰胺。
作为优选方案，所述聚丙烯酸的重均分子量为100000～250000。
第三方面，本发明还提供了一种如前述的多价键纳米凝胶在宫颈癌原位治疗药物中的用途。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明的负载紫杉醇的纳米凝胶，不仅可以增强紫杉醇在水中的溶解性，其形成纳米凝胶后，也解决了紫杉醇多药耐药的问题；
2、相比静脉注射的紫杉醇制剂而言，本发明的原位粘膜粘附给药体系，可以提高局部药物浓度，并且增加药物在阴道内的滞留时间，从而提高紫杉醇对于宫颈癌的治疗效果。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明中实施例1聚甲基丙烯酸接枝环糊精paa-βcd的反应路线图；
图2为本发明中实施例2聚甲基丙烯酸接枝紫杉醇paa-tax的反应路线图；
图3为本发明中实施例3组装形成纳米凝胶的示意图；
图4为本发明中实施例3组装得到的纳米凝胶的透射电镜图；
图5为紫杉醇tax和纳米凝胶nanogel对肿瘤细胞hela细胞系生长抑制作用的示意图；
图6为紫杉醇tax和纳米凝胶nanogel对耐药肿瘤细胞hela/tax细胞系生长抑制作用的示意图；
图7为紫杉醇tax和纳米凝胶nanogel在体外模拟上皮细胞渗透模型中的渗透作用示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例涉及一种聚丙烯酸接枝环糊精的制备方法，如图1所示，具体包括如下步骤：
称取聚丙烯酸(mw＝250,000)0.05g溶于20ml的无水n,n-二甲基甲酰胺中，并往溶液中加入0.0215g六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷以及0.006ml的三乙胺，混合物搅拌2小时后，加入0.159g单氨基单脱氧β-环糊精，继续在常温下反应12小时。反应完毕后，混合物在200ml的乙醇中沉淀，并用乙醇洗涤三次，离心收集沉淀物。将沉淀物溶于水中，用截留分子量为1,4000的透析袋透析七天，冻干得到产物。
实施例2
本实施例涉及一种聚丙烯酸接枝环糊精紫杉醇的制备方法，如图2所示，具体包括如下步骤：
称取聚丙烯酸(mw＝250,000)0.0842g溶于20ml的无水n,n-二甲基甲酰胺中，加入0.0157g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，在冰浴下反应1小时。依次加入0.02g的4-二甲氨基吡啶，0.1g的紫杉醇。在常温下搅拌72小时后，在二甲基亚砜中透析72小时(mw＝1,4000)，继续用去离子水再透析72小时，最后冻干得到产物。
实施例3
本实施例涉及一种负载紫杉醇的纳米凝胶的制备方法，具体包括如下步骤：
称取聚丙烯酸接枝紫杉醇聚合物10mg和聚丙烯酸接枝环糊精聚合物2mg置于4ml透明样品瓶中，加入1ml去离子水，在室温下剧烈搅拌72h，即制得环糊精包含紫杉醇的纳米凝胶溶液，如图3所示。本实施例制备的环糊精包含紫杉醇的纳米凝胶的透射电镜照片如图4所示，纳米凝胶粒径的平均尺寸在80nm左右。
实施例4
按照实施例3的方法制得浓度为0.5mg/ml的纳米凝胶原液以及紫杉醇注射剂，分别用细胞培养液稀释至0.0098、0.0195、0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5μg/ml，与hela细胞共同培养72小时之后，采用mtt法进行细胞的活性测试，所得结果如图5所示。同样地，将纳米凝胶原液和紫杉醇注射液稀释至0.039、0.078、0.156、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10μg/ml，与耐紫杉醇的hela耐药细胞共同培养72个小时之后，进行细胞活性的测试，所得结果如图6所示。当纳米凝胶浓度达到0.076μg/ml时，显示出很好的杀死肿瘤细胞的能力；对于耐药细胞而言，纳米凝胶也显示出了很好的逆转多药耐药的效果，证明了纳米凝胶在治疗癌症中具有潜在的应用价值。
实施例5
将caski细胞接种于具有0.4μm孔径聚四氟乙烯膜的transwell板的上室中，膜上预涂了大鼠尾部型胶原ⅰ型(10μg/cm2)。将培养基加到上室以及下室中，并且每隔一天更换新鲜的培养基以使细胞形成完整的细胞层。通过跨膜电阻仪监测跨膜电阻值来评估细胞单层的形成和完整性。在分析渗透性实验的当天，移除培养基后，分别在上室中加入350μl紫杉醇(tax)以及纳米凝胶(paa-βcd/paa-tax)的hank’s平衡盐溶液(其中tax浓度为5μg/ml)，并在下室中补充900μl的hank’s平衡盐溶液。实验组在37℃/5v/v％co2的条件下培养，每隔一定时间从下室中收集500μl样品，并用hplc-uv来测定紫杉醇的含量，如图7所示。由图7可以证明，纳米凝胶可以促进紫杉醇在上皮细胞膜中的渗透。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。