一种慢性血栓栓塞性肺动脉高压大鼠模型及其构建方法与流程

本发明属于脊椎动物的新品种技术领域，尤其涉及一种慢性血栓栓塞性肺动脉高压大鼠模型及其构建方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

慢性血栓栓塞性肺动脉高压(chronicthromboembolicpulmonaryhypertension，cteph)是急性肺栓塞(acutepulmonaryembolism，ape)或肺动脉原位血栓形成后，血栓因种种原因未溶解而持续存在，通过机化、纤维化、重构而导致肺血管阻塞的后果。cteph的发生率虽较低，但预后很差，持续升高的肺血管阻力最终会使患者发展至右心功能衰竭而死亡。研究数据显示，肺动脉压力高低与预后密切相关。目前，肺动脉血栓内膜剥脱术(pulmonaryendarterectomy，pea)是cteph的首选治疗方案，效果明显。然而就目前cteph的诊治情况，大部分患者就诊时已处于中晚期，其中有37％的患者因肺远端血管存在血栓、继发性肺小血管病或其它严重疾病不适合手术。因此探索其发病机制，防治cteph的发生发展，提高cteph的疗效及改善预后具有特殊的重要性和迫切性。鉴于人类伦理、技术因素等，无法对患者行在体深入研究。鉴于动物高效的纤溶能力及无自发性下肢深静脉血栓形成，cteph理想动物模型很难建立，虽然已有猪、狗、大鼠等不同动物种属的栓塞性肺动脉高压模型，但是栓塞物质为小玻璃珠、聚苯乙烯微球、聚多卡醇等等非血栓物质，无法真正模拟肺血栓对血管的刺激等类似临床cteph患者的病理生理过程。设法让血栓能够在肺动脉血管内持续停留足够长的时间或继发新的血栓形成，模拟人类慢性血栓栓塞，使肺动脉内皮得到持续的刺激，引起血管重构，是构建稳定、病理生理接近临床cteph患者动物模型的关键。近年来，炎症反应与反复血栓栓塞及肺动脉重塑的关系越来越受到重视。炎症被认为是cteph血栓不溶或形成的主要原因之一，而不仅仅是一个促凝因子。栓塞后由于机械阻塞及血流剪切力的变化，启动了复杂的炎症反应，活化的血小板、受损的肺动脉内皮及浸润的白细胞释放炎症介质。这些炎症介质促进肺血管局部血栓形成，抑制血栓溶解，并参与肺血管重塑。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)动物高效的纤溶能力及无自发性下肢深静脉血栓形成，cteph理想动物模型很难建立。

(2)已有猪、狗、大鼠等不同动物种属的栓塞性肺动脉高压模型，但是栓塞物质为小玻璃珠、聚苯乙烯微球、聚多卡醇等等非血栓物质，无法真正模拟肺血栓对血管的刺激等类似临床cteph患者的病理生理过程。

解决上述技术问题的难度和意义：

设法让血栓能够在肺动脉血管内持续停留足够长的时间或继发新的血栓形成，模拟人类慢性血栓栓塞，使肺动脉内皮得到持续的刺激，引起血管重构，是构建稳定、病理生理接近临床cteph患者动物模型的关键。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种慢性血栓栓塞性肺动脉高压大鼠模型及其构建方法。

本发明是这样实现的，一种慢性血栓栓塞性肺动脉高压大鼠模型，所述慢性血栓栓塞性肺动脉高压大鼠模型为：经腹腔注射10％水合氯醛麻醉，无菌条件下，经左颈内静脉，将混有约32±5个自体血栓栓子的含氨甲环酸的1.5ml生理盐水以0.5ml/min的速度栓塞肺动脉，栓塞过程中缓慢翻动体位使更大数量的栓子进入大鼠肺循环内；栓塞后可见大鼠发绀，呼吸加快；栓塞后第4天、第11天以同样方法进行第二、第三次栓塞，共观察5周。

本发明的另一目的在于提供一种所述慢性血栓栓塞性肺动脉高压大鼠模型的构建方法，所述慢性血栓栓塞性肺动脉高压大鼠模型构建方法包括以下步骤：

步骤一，建立简单的栓塞装置，用一次性2ml注射器针筒，连接一次性采血针建立简单可行的栓塞装置；制备自体血栓，大鼠麻醉后，用熔点毛细玻璃管自sd大鼠眼眶后静脉采血，放于无菌玻璃平皿静置2-3h后，用生理盐水冲出后切成1.1×3mm的自体血栓柱，放入65-70℃水浴10min，加2ml生理盐水4℃冷藏过夜备用；

步骤二，大鼠称重后，经腹腔注射10％水合氯醛麻醉，无菌条件下，经左颈内静脉，将混有32±5个自体血栓栓子的含氨甲环酸的1.5ml生理盐水以0.5ml/min的速度栓塞肺动脉，栓塞过程中翻动体位使更大数量的栓子进入大鼠肺循环内；栓塞后第4天、第11天以同样方法进行第二、第三次栓塞，共观察5周；

步骤三，术后全程腹腔予氨甲环酸抗纤溶，每周1次腹腔给0.2％角叉菜胶；术后均给予青霉素肌肉注射3天，1次/天，预防感染。

进一步，所述水合氯醛0.3ml/100g；含氨甲环酸200mg/kg；氨甲环酸200mg/kg.d；角叉菜胶20mg/kg；青霉素10万u/kg。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

cteph理想动物模型很难建立，国内外虽然已有猪、狗、大鼠等不同动物种属的栓塞性肺动脉高压模型报道，但是栓塞物质为小玻璃珠、聚苯乙烯微球、聚多卡醇等非血栓物质，无法真正模拟肺血栓对血管的刺激继发cteph等临床cteph患者的病理生理过程。本发明建立的cteph模型是以大鼠自体血栓为栓塞肺动脉，借助角叉菜胶的促炎作用，让自体血栓尽量长时间的栓塞血管，真正模型临床cteph患者肺栓塞继发cteph的整个病理生理过程。

附图说明

图1是本发明实施例提供的慢性血栓栓塞性肺动脉高压大鼠模型的构建方法流程图。

图2是本发明实施例提供的制备自体血栓，大鼠麻醉后，用熔点毛细玻璃管自sd大鼠眼眶后静脉采血，放于无菌玻璃平皿静置2-3h后，用生理盐水冲出后切成1.1×3mm的自体血栓柱，然后放入65-70℃水浴10min，最后加2ml生理盐水4℃冷藏过夜备用图。

图中：左盘为血栓条；右盘为血栓柱。

图3是本发明实施例提供的大鼠称重后，经腹腔注射10％水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉，无菌条件下，经左颈内静脉，将混有约32±5个自体血栓栓子的含氨甲环酸(200mg/kg)的1.5ml生理盐水以0.5ml/min的速度栓塞肺动脉，栓塞过程中缓慢翻动体位使更大数量的栓子进入大鼠肺循环内图。

图中：左图为自体血栓图；右图为注栓2小时后肺栓塞情况图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

角叉菜胶(carrageenin)是一种具有较强的致炎作用，并广泛接受用于诱导各种炎症模型的多糖，多次颈内静脉注射自体血栓联合腹腔注射角叉菜胶及氨甲环酸抗纤溶治疗可以确保血栓稳定保存在sd大鼠体内较长一段时间，并继发新的血栓形成，持续稳定刺激内皮，引起内皮重塑，建成较理想、病理生理与临床cteph患者接近的慢性血栓栓塞性肺动脉高压大鼠模型。

本发明实施例提供的慢性血栓栓塞性肺动脉高压大鼠模型经腹腔注射10％水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉，无菌条件下，经左颈内静脉，将混有约32±5个自体血栓栓子的含氨甲环酸(200mg/kg)的1.5ml生理盐水以0.5ml/min的速度栓塞肺动脉，栓塞过程中缓慢翻动体位使更大数量的栓子进入大鼠肺循环内；栓塞后可见大鼠发绀，呼吸加快等；栓塞后第4天、第11天以同样方法进行第二、第三次栓塞，共观察5周。

如图1所示，本发明实施例提供的慢性血栓栓塞性肺动脉高压大鼠模型的构建方法包括以下步骤：

s101：建立简单的栓塞装置及制备自体血栓：建立简单的栓塞装置，用一次性2ml注射器针筒，连接一次性采血针建立简单可行的栓塞装置；制备自体血栓，大鼠麻醉后，用熔点毛细玻璃管自sd大鼠眼眶后静脉采血，放于无菌玻璃平皿静置2-3h后，用生理盐水冲出后切成1.1×3mm的自体血栓柱，然后放入65-70℃水浴10min，最后加2ml生理盐水4℃冷藏过夜备用；

s102：栓塞，大鼠称重后，经腹腔注射10％水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉，无菌条件下，经左颈内静脉，将混有约32±5个自体血栓栓子的含氨甲环酸(200mg/kg)的1.5ml生理盐水以0.5ml/min的速度栓塞肺动脉，栓塞过程中缓慢翻动体位使更大数量的栓子进入大鼠肺循环内。栓塞后可见大鼠发绀，呼吸加快等；栓塞后第4天、第11天以同样方法进行第二、第三次栓塞，共观察5周；

s103：腹腔给药(角叉菜胶及抗纤溶)；术后全程腹腔予氨甲环酸(200mg/kg.d)抗纤溶，每周1次腹腔给0.2％角叉菜胶(20mg/kg)。术后均给予青霉素((10万u/kg)肌肉注射3天，1次/天，预防感染。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。

清洁级雄性健康sd(spraguedawley)大鼠80只，8周龄，体重230±22g，购自福建医科大学动物实验中心，动物自由进食饮水，适应4-5天后进行实验。角叉菜胶购自伊卡生物技术有限公司，上海。取80只sd大鼠，随机分为生理盐水对照组、角叉菜胶对照组、手术a组、手术b组四组，每组各20只。生理盐水对照组：注射生理盐水代替血栓柱，余同手术组；角叉菜胶对照组：注射生理盐水代替血栓柱，腹腔注射角叉菜胶，余同手术组；手术a组：血栓柱栓塞组；手术b组：血栓柱栓塞组+腹腔注射角叉菜胶组。

步骤一，建立简单的栓塞装置及制备自体血栓：

建立简单的栓塞装置，用一次性2ml注射器针筒，连接一次性采血针建立简单可行的栓塞装置；

制备自体血栓，大鼠麻醉后，用熔点毛细玻璃管自sd大鼠眼眶后静脉采血，放于无菌玻璃平皿静置2-3h后，用生理盐水冲出后切成1.1×3mm的自体血栓柱，然后放入65-70℃水浴10min，最后加2ml生理盐水4℃冷藏过夜备用(见图2)；

步骤二，栓塞；

大鼠称重后，经腹腔注射10％水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉，无菌条件下，经左颈内静脉，将混有约32±5个自体血栓栓子的含氨甲环酸(200mg/kg)的1.5ml生理盐水以0.5ml/min的速度栓塞肺动脉，栓塞过程中缓慢翻动体位使更大数量的栓子进入大鼠肺循环内(见图3)。栓塞后可见大鼠发绀，呼吸加快等。栓塞后第4天、第11天以同样方法进行第二、第三次栓塞，共观察5周；

步骤三，腹腔给药(角叉菜胶及抗纤溶)；

术后全程腹腔予氨甲环酸(200mg/kg.d)抗纤溶，每周1次腹腔给0.2％角叉菜胶(20mg/kg)。术后均给予青霉素((10万u/kg)肌肉注射3天，1次/天，预防感染。

下面结合实验对本发明的应用效果作详细的描述。

实验各组压力与血管重塑情况对比

注：实验室a组＝自体血栓栓塞组，实验b组＝自体血栓栓塞+角叉菜胶组，wa/ta＝血管壁面积/总面积表示血管重塑的指标；^*p<0.05与对照组相比较.^#p<0.05与实验a组相比较，^▲p＞0.05与生理盐水对照组比较。

三次栓塞后，手术组大鼠的肺动脉压力(mpap)和血管重塑(wa/ta)均高于对照组，注射角叉菜胶的手术b组较未注射角叉菜胶的手术a组压力升高显著(p<0.05)，并有明显的血管重塑表现；角叉菜胶对照组的肺动脉压力和血管重塑(wa/ta)表现虽然较生理盐水对照组有轻度升高，但结果无统计学差异(p＞0.05)。

由于颈内静脉细小，因此制备的自体血栓体积不能太大，因此需要量较多，多次栓塞；另外一次栓塞操作粗暴容易毁损颈内静脉，保护不好容易导致下一次栓塞失败，因此对颈内静脉保护有一定要求。

本实验过通过腹腔给药时，操作不当容易致胃肠道、黏连、感染，对腹腔给药操作技术有一定要求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。