一种Grp94抑制剂的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及萜类化合物用作grp94抑制剂的用途。
背景技术：
热休克蛋白hsp90是细胞内高度保守的一类蛋白，其主要功能是辅助细胞内其他蛋白(客户蛋白)的成熟。hsp90包括四个亚型，分别是细胞质中的hsp90α/β，线粒体中的trap1和内质网中的grp94。作为hsp90的内质网亚型，grp94的客户蛋白广泛参与炎症相关性疾病的发生发展中，如心肌炎、心肌肥大、结肠炎等。grp94抑制剂在心肌炎、心肌肥大、结肠炎等炎症相关疾病的治疗方面具有巨大价值。技术实现要素：本发明的目的在于提供萜类化合物用作grp94抑制剂的用途。本发明技术方案如下：6-甲氧基半棉酚用作grp94抑制剂的用途。6-甲氧基半棉酚用于制备治疗心肌肥大的药物的用途。一种治疗心肌肥大的药物，含有grp94抑制剂，该抑制剂为6-甲氧基半棉酚。进一步地，还含有药学上可以接受的辅料。2-o-甲基异半棉酸内酯用作grp94抑制剂的用途。2-o-甲基异半棉酸内酯用于制备治疗心肌肥大的药物的用途。一种治疗心肌肥大的药物，含有grp94抑制剂，该抑制剂为2-o-甲基异半棉酸内酯。进一步地，还含有药学上可以接受的辅料。3β,4β-环氧沉香呋喃用作grp94抑制剂的用途。3β,4β-环氧沉香呋喃用于制备治疗心肌肥大的药物的用途。一种治疗心肌肥大的药物，含有grp94抑制剂，该抑制剂为3β,4β-环氧沉香呋喃。进一步地，还含有药学上可以接受的辅料。8β-乙氧基苍术内酯ⅱ用作grp94抑制剂的用途。8β-乙氧基苍术内酯ⅱ用于制备治疗心肌肥大的药物的用途。一种治疗心肌肥大的药物，含有grp94抑制剂，该抑制剂为8β-乙氧基苍术内酯ⅱ。进一步地，还含有药学上可以接受的辅料。α-山道年或β-山道年用作grp94抑制剂的用途。α-山道年或β-山道年用于制备治疗心肌肥大的药物的用途。一种治疗心肌肥大的药物，含有grp94抑制剂，该抑制剂为α-山道年或β-山道年。进一步地，还含有药学上可以接受的辅料。有益效果：本发明发现，6-甲氧基半棉酚、2-o-甲基异半棉酸内酯、3β,4β-环氧沉香呋喃、8β-乙氧基苍术内酯ⅱ、α-山道年、β-山道年为有效的grp94选择性抑制剂。附图说明图1为实施例测试的化合物的化学结构；图2为各化合物对心肌肥大细胞中grp94基因表达的影响；图3为各化合物对心肌肥大细胞氧化应激的影响。具体实施方式下面结合附图和实施例介绍本发明实质性内容，但本发明的保护范围并不局限于此。实施例1：分子水平抑制试验一、实验材料6-甲氧基半棉酚(cas登录号：50399-95-6)、2-o-甲基异半棉酸内酯(cas登录号：61470-49-3)、3β,4β-环氧沉香呋喃(cas登录号：149117-37-3)、3,4-二羟基二氢沉香呋喃(cas登录号：141554-22-5)、8β-乙氧基苍术内酯ⅱ(cas登录号：113269-35-5)、α-山道年(cas登录号：481-06-1)、β-山道年(cas登录号：481-07-2)购买或自制，纯度不低于98％。各化合物的结构式如图1所示。二、实验方法化合物对grp94、hsp90α抑制活性采用荧光偏正的方法测试(参见文献cn108147978a)。通过测试化合物与荧光基团标记的格尔德霉素(gm-fitc)竞争性结合重组grp94、hsp90α蛋白的能力，反应化合物对grp94、hsp90α的抑制作用。测试中使用384孔黑板(型号为corning#3575)，测试终体积选择60μl，所测试化合物和gm-fitc溶解于dmso中备用。将化合物用assaybuffer倍比稀释12个浓度梯度后每个孔板加入20μl稀释好的化合物，每个孔板再加入20μl用assaybuffer稀释好的6nm/l(终浓度)的gm-fitc，再加入20μl用assaybuffer稀释好的15nm/l(终浓度)蛋白。每个化合物浓度设定两个附孔，每次实验设置空白对照(20μlgm-fitc+40μlassaybuffer)和阴性对照(20μlgm-fitc+20μl蛋白+20μlassaybuffer)。之后在4℃摇床上震摇孵育2h，用synergy读板器扫板，激发波长设置为485nm，发射波长设置为535nm，结果graphpadprism6分析。根据不同浓度抑制率计算ic50值。三、实验结果各化合物对grp94、hsp90α蛋白的ic50值如表1所示。表1各化合物对grp94蛋白的ic50值上述化合物中，α-山道年、β-山道年对grp94蛋白的抑制作用最强，其次为6-甲氧基半棉酚、2-o-甲基异半棉酸内酯，最后为3β,4β-环氧沉香呋喃、8β-乙氧基苍术内酯ⅱ。这6个化合物不但对grp94蛋白抑制作用强，而且选择性强，对hsp90α抑制作用极弱。3,4-二羟基二氢沉香呋喃虽然与3β,4β-环氧沉香呋喃结构接近，但是对grp94、hsp90α抑制作用均极弱。实施例2：细胞水平抑制试验一、实验材料6-甲氧基半棉酚(cas登录号：50399-95-6)、2-o-甲基异半棉酸内酯(cas登录号：61470-49-3)、3β,4β-环氧沉香呋喃(cas登录号：149117-37-3)、3,4-二羟基二氢沉香呋喃(cas登录号：141554-22-5)、8β-乙氧基苍术内酯ⅱ(cas登录号：113269-35-5)、α-山道年(cas登录号：481-06-1)、β-山道年(cas登录号：481-07-2)购买或自制，纯度不低于98％。各化合物的结构式如图1所示。1～2日龄wistar乳鼠由南京江宁青龙山动物中心提供。dmem、胎牛血清购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司。trizol、rt-pcr试剂盒购自invitrogen公司；sybrgreenpcrmastermix试剂盒购自美国appliedbiosystems公司。rt-pcr引物由上海生工设计合成。sod、mda检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。二、实验方法1、心肌肥大细胞模型的构建及分组给药取wistar乳鼠，75％乙醇皮肤消毒后剪除头部，开胸取心脏，放置装有dmem的无菌玻璃平皿中洗净血污，每个心脏剪成大小均匀的组织块，将所有组织块转移至无菌离心管中，加0.25％胰酶在37℃恒温水浴中振摇消化、自然沉降。收集细胞悬液于离心试管中，加入等体积预冷细胞培养液(dmem+10％fbs)混匀，经200目无菌不锈钢网滤过后装置另一离心管中，2500r/min离心2min，弃上清液，沉淀加入培养液吹打均匀制成细胞悬液，接种于细胞瓶中，按差速贴壁分离法预接种。2h后将未贴壁细胞吸出，在培养液中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷(brdu，0.1mmol/l)，48h后将培养液换为无血清的培养液，饥饿12h。心肌细胞随机分为：对照组只加入培养液，异丙肾上腺素10μm(模型)组、各化合物5μm与异丙肾上腺素10μm共同给药组，各组细胞给予相应物质后于培养箱中孵育48h，备用。2、rt-pcr法检测grp94基因表达取各组细胞，trizol法提取总rna，逆转录获得cdna，采用sybrgreenpcrmastermix试剂盒进行pcr反应。反应体系20μl(10μm上游引物、10μm下游引物各1μl，sybrgreenmix10μl，ddh2o7μl，cdna1μl)。反应条件：预变性，95℃、2min；变性，95℃、30s；退火，60℃、30s；延伸，70℃、45s；末次延伸，72℃、6min；共35个循环。grp94正向引物：5’-cagttttggatcttgctgtgg-3’grp94反向引物：5’-cagctgtagattcctttgc-3’gapdh正向引物：5’-tctacatgttccagtatgactc-3’gapdh反向引物：5’-actccacgacatactcagcacc-3’3、sod活性和mda检测取各组细胞，采用黄嘌呤氧化法检测sod的活性，采用硫代巴比妥酸法测定mda的量，操作严格按照试剂盒说明书进行。4、统计学处理数据均用均值±标准偏差表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用q检验，用graphpadprism5分析软件分析程序。三、实验结果1、各化合物对心肌肥大细胞中grp94基因表达的影响结果见表2和图2所示，除3,4-二羟基二氢沉香呋喃外的6个化合物均可以有效降低心肌肥大细胞中grp94基因的表达水平，抑制grp94基因表达。表2各化合物对心肌肥大细胞中grp94基因表达的影响组别grp94mrna/gapdhmrna对照组1.00模型组(异丙肾上腺素)3.15±0.096-甲氧基半棉酚+异丙肾上腺素1.95±0.072-o-甲基异半棉酸内酯+异丙肾上腺素1.92±0.093β,4β-环氧沉香呋喃+异丙肾上腺素2.41±0.073,4-二羟基二氢沉香呋喃+异丙肾上腺素3.02±0.088β-乙氧基苍术内酯ⅱ+异丙肾上腺素2.37±0.06α-山道年+异丙肾上腺素1.36±0.06β-山道年+异丙肾上腺素1.34±0.072、各化合物对心肌肥大细胞氧化应激的影响结果见表3和图3所示，除3,4-二羟基二氢沉香呋喃外的6个化合物均可以有效改善心肌肥大细胞的氧化应激状态(sod活性升高和mda量降低)。表3各化合物对心肌肥大细胞氧化应激的影响组别sod/(u·ml-1)mda/(μmol·ml-1)对照组17.89±1.143.15±0.32模型组(异丙肾上腺素)12.15±1.075.83±0.556-甲氧基半棉酚+异丙肾上腺素15.89±1.104.29±0.412-o-甲基异半棉酸内酯+异丙肾上腺素15.92±1.154.33±0.423β,4β-环氧沉香呋喃+异丙肾上腺素14.63±1.184.95±0.453,4-二羟基二氢沉香呋喃+异丙肾上腺素12.28±1.095.72±0.578β-乙氧基苍术内酯ⅱ+异丙肾上腺素14.51±1.134.88±0.46α-山道年+异丙肾上腺素17.05±1.143.47±0.38β-山道年+异丙肾上腺素17.12±1.083.42±0.35本领域技术人员知道，心肌肥大与氧化应激有关，改善氧化应激有助于缓解心肌肥大，除3,4-二羟基二氢沉香呋喃外的6个化合物通过抑制grp94可以有效缓解心肌肥大。上述实验结果表明，6-甲氧基半棉酚、2-o-甲基异半棉酸内酯、3β,4β-环氧沉香呋喃、8β-乙氧基苍术内酯ⅱ、α-山道年、β-山道年为有效的grp94选择性抑制剂。上述实施例的作用在于具体介绍本发明实质性内容，但本发明的保护范围并不局限于此。当前第1页12