一种药物组合物、制备方法及其在缺血性脑卒治疗中的应用与流程

本发明涉及一种药物组合物的配方及其制备方法。本发明还涉及其在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。

背景技术：

《中国脑卒中防治报告(2017)》显示，2016年心脑血管疾病在全球造成1760余万人死亡，而我国脑卒中发病率呈不断上升、年轻化趋势，近二十年来，患病率升至1.23％，第一年复发率达17％，5年累积复发率﹥30％。脑卒中已成为中国居民疾病死亡的首要原因，死亡人数高于欧美4-5倍，卒中类型占比60％-80％的缺血性脑卒中死亡率更上升28.8％。

缺血性脑卒中损伤的发病因素和病理生理机制十分复杂，涉及到多个环节多个靶区的网络化分子紊乱，目前临床上用于治疗缺血性脑卒中的策略和药物主要有：

1、溶栓

脑缺血后恢复脑血流是治疗脑缺血的关键。溶栓治疗是目前最重要的恢复血流措施，重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-pa)和尿激酶(uk)是我国目前使用的主要溶栓药，其有效治疗时间窗为发病后3小时内、4.5小时内或6小时内。

但是uk造成全身溶栓状态，作用时间长，易出血，不宜用于急性脑梗塞治疗。rt-pa虽能选择性作用于局部血栓中的纤溶酶原，使之转化为纤溶酶而起溶栓作用，但也有出血风险，有报道显示其显著增加致死性颅内出血率；此外还有出现血管源性水肿引起呼吸道部分梗阻的报道。且溶栓药物必须静脉注射用药，口服无效。

2、抗血小板

临床上用溶栓药进行治疗急性脑缺血虽收到较好效果，但尚未解决出血率高的危险性。由于缺乏治疗药物，现在多用预防药，如阿司匹林等，进行二级预防。阿司匹林能显著降低随访期末的病死或残疾率，减少复发，仅轻度增加症状性颅内出血的风险，是目前最常用的抗血小板凝集的药物。

胃肠道症状是阿司匹林众所周知的不良反应，口服阿司匹林可直接剌激胃黏膜引起上腹不适及恶心呕吐，长期使用易致胃黏膜损伤，引起胃溃疡及胃出血。长期使用应经常监测血像、大便潜血试验及必要的胃镜检查。

此外，对不能耐受阿司匹林者，可考虑选用磷酸二酯酶抑制剂(双嘧达莫)、腺苷受体拮抗剂(噻氯匹啶或氯吡格雷)等抗血小板药物。

3、抗凝

抗凝药物主要包括口服抗凝剂(华法林)和非口服抗凝剂(肝素类)。有报道显示，抗凝药治疗不能降低随访期末病死率；随访期末的残疾率亦无明显下降；抗凝治疗能降低缺血性脑卒中的复发率、降低肺栓塞和深静脉血栓形成发生率，但被症状性颅内出血增加所抵消，脑出血危险较高。

4、神经保护

理论上，针对急性缺血或再灌注后细胞损伤的药物(神经保护剂)可保护脑细胞，提高对缺血缺氧的耐受性。目前临床上使用的神经保护剂主要有：

钙拮抗剂(尼莫地平)，能减轻缺血性脑损伤，对神经元有直接保护作用；

自由基清除剂(超氧化物歧化酶、地塞米松、甘露醇、ve、vc及氨基类固醇等)；

丁基苯酞，能够改善线粒体功能和脑微循环，降低glu的释放，改善神经功能缺损。

脑缺血损伤在初始和迟发性损伤过程中是一多因素参与的过程，以上药物在治疗上单独使用只解决复杂过程中的一个方面，不会获得理想的效果。在治疗上同时阻断脑缺血病理过程中的多个环节是很重要的，在疾病发病不同时期应使用不同药物或多种药物配合进行治疗，急性期治疗须严格适应证，严密监测；进入恢复期，则应采用促神经恢复药物进行治疗，并进行康复治疗；需要综合考虑急性期和恢复期药物的过渡、剂量调整、药物之间相互作用、减少副反应等，才能收到较好效果。

中药具有多成分、多途径、多靶点、整体作用、安全性高的特点，在复杂性疾病治疗，尤其是涉及多个环节和多种因素发生改变的脑血管疾病的治疗上，中药能够充分发挥其“慢性起病、急性发作、病后调养”的特性，具有明显的优势与特色。

三七具有散瘀止血，消肿定痛的功效；其主要成分三七总皂苷能活血祛瘀，扩张血管，改善血液循环。红花具有活血通经，散瘀止痛的功效；红花黄色素能够活血化瘀，通脉止痛。葛根具有解肌退热，生津止渴，透疹，升阳止泻，通经活络，解酒毒的功效；葛根总黄酮能够活血化瘀，用于缺血性中风中经络恢复期淤血痹阻脉络证。山楂具有消食健胃，行气散瘀、化浊降脂的功效。

现代药理学研究表明，三七富含三七总皂苷，具有扩张血管，降低心肌耗氧量，抑制血小板凝集，延长凝血时间，降血脂，清除自由基，抗炎抗氧化等药理作用；红花中的红花黄色素等查尔酮类成分在增加冠脉流量，抗缺血，抗血凝血栓等方面具有较好的活性；葛根总黄酮具有提高免疫，增强心肌收缩力，保护心肌细胞，降低血压，抗血小板聚集等作用；川芎和山楂均能扩张冠状动脉，增加冠脉流量；川芎和山楂中含量较高的阿魏酸，具有强大的抗氧化，清除自由基等活性。

以上五味中药合理配伍，则可以有效扩张血管，增加心脑血流量、改善微循环及具有抗血小板凝集、抗动脉硬化、降低血压和血脂、减少脂质过氧化、清除自由基、神经保护等作用，可同时作用于缺血性脑卒中的多个病理环节，实现多成分、多途径、整体作用，用于脑缺血急性期和恢复期治疗，能够加快恢复进程，具有明显的优势与特色。

然而传统中药的制备方法，多为将药材混合煎煮，有效成分不清楚；多为工艺控制，而质量可控性差；药品溶解性差，制剂性能差，患者服药量大，依从性不好。

技术实现要素：

本发明提供了一种溶解性好、稳定性好、疗效高的治疗缺血性脑卒中的药物组合物及其制备方法。本发明的药物组合物可用于制备治疗缺血性脑卒中的药物。

本发明的特征是采用三七的有效部位—三七总皂苷；对红花、葛根、川芎、山楂分别采用醇-水提取工艺，以吸附树脂技术富集各味中药的有效部位；按一定比例配比制成组合物。

本发明的药物组合物，是三七总皂苷、以及红花、葛根、川芎、山楂中的有效部位，其配比是：三七总皂苷1～5份，红花10～30份的提取物，葛根15～60份的提取物，川芎10～40份的提取物，山楂20～45份的提取物

本发明采取如下的技术方案：

1、将红花、葛根、川芎、山楂等药材粉碎；

2、称取一定量的红花，用8-15倍水或乙醇水溶液提取2-3次，每次1-3小时，合并提取液，浓缩至约10倍生药量；过大孔吸附树脂柱，用水除杂，再用50％乙醇水溶液洗脱，洗脱液浓缩，干燥，粉碎，即得。

3、称取一定量的葛根，用6-10倍50％-95％乙醇水溶液提取2-3次，时间1-3小时，合并提取液，减压蒸馏回收乙醇，加水至约2-3倍生药量；过大孔吸附树脂柱，用水除杂，再用70％乙醇水溶液洗脱，洗脱液浓缩，干燥，粉碎，即得。

4、称取一定量的川芎，用6-10倍水或乙醇水溶液提取2-3次，每次1-3小时，合并提取液，浓缩至约4倍生药量；过大孔吸附树脂柱，用水除杂，再用50％％乙醇水溶液洗脱，洗脱液浓缩，干燥，粉碎，即得。

5、称取一定量的山楂，用6-10倍40％-70％乙醇水溶液提取2-3次，每次1-3小时，合并提取液，减压蒸馏回收乙醇，加水至约2.5倍生药量；过大孔吸附树脂柱，用水除杂，再用40％-75％乙醇水溶液洗脱，洗脱液浓缩，干燥，粉碎，即得。

6、将上述红花提取物、葛根提取物、川芎提取物、山楂提取物及三七总皂苷进行配比，混合均匀，即得药物组合物。

本发明涉及了一种药物组合物，包括以本发明所述的方法制成的提取物及药学上可接受的载体。

本发明涉及上述方法得到的提取物，上述提取物可经冷冻干燥或真空干燥成干粉，也可把浓缩液体直接喷雾干燥成干粉，然后制成各种剂型。

本发明还涉及含有作为活性成份的本发明提取物以及常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明提取物占药物组合物总重量的1～95％。

本发明还提供一种药物组合物，它包括药物有效剂量的作为活性成分的平滑苍耳提取物及药学上可接受的载体。

本发明所述的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明提取物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为药物使用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明组合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺、皮肤、阴道、腹膜、直肠等，优选口服给药。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括水包油型、油包水型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明提取物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯毗咯烷酮、聚乙二丙醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯毗咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与构椽酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、月桂酸聚乙二醇甘油酯、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄菩胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。

为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明提取物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明提取物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明提取物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、l,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、ph调节剂等。这些辅料是本领域常用的。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的提取物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明提取物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明提取物的每天的合适剂量范围：本发明的药物组合物的用量为0.01～150mg/kg体重，优选为1～100mg/kg体重，更优选为10～50mg/kg体重，最优选为20～30mg/kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药，这取决于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。每一种治疗所需总剂量可分成多次或按一次剂量给药。本发明的提取物或药物组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。

本发明通过药物组合物在小鼠和大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的作用的研究，证明，本发明的药物组合物具有显著的缩小模型动物脑缺血面积，改善神经行为功能缺失的作用。

本发明优选的技术方案如下：

一种治疗缺血性脑卒中的药物组合物，其特征在于所述组合物由红花提取物、葛根提取物、川芎提取物、山楂提取物和三七总皂苷组成。

优选的原料配比如下：

三七总皂苷1～5份，红花10～30份的提取物，葛根15～60份的提取物，川芎10～40份的提取物，山楂20～45份的提取物。

更优选的原料配比：

三七总皂苷1份，红花20份的提取物，葛根57份的提取物，川芎17份的提取物，山楂34份的提取物。

所述的药物组合物中，所述三七总皂苷的皂苷含量为75％以上。

所述的药物组合物的制备方法，其特征在于：

所述的红花提取物的制备：称取一定量的红花，用8-15倍水或乙醇水溶液提取2-3次，每次1-3小时，合并提取液，浓缩至约10倍生药量；过大孔吸附树脂柱，用水洗脱除去杂质，再用50％乙醇水溶液洗脱，洗脱液浓缩，干燥，粉碎，即得。

所述的葛根提取物的制备：称取一定量的葛根，用6-10倍50-95％乙醇水溶液提取2-3次，每次1-3小时，合并提取液，减压蒸馏回收乙醇，加水至约1～2倍生药量；过大孔吸附树脂柱，用水洗脱除去杂质，再用70％乙醇水溶液洗脱，洗脱液浓缩，干燥，粉碎，即得。

所述的川芎提取物的制备：称取一定量的川芎，用6-10倍水或乙醇水溶液提取2-3次，每次1-3小时，合并提取液，浓缩至约4倍生药量；过大孔吸附树脂柱，用水洗脱除去杂质，再用50％乙醇水溶液洗脱，洗脱液浓缩，干燥，粉碎，即得。

所述的山楂提取物的制备：称取一定量的山楂，用6-10倍40-70％乙醇水溶液提取2-3次，每次1-3小时，合并提取液，减压蒸馏回收乙醇，加水至约2.5倍生药量；过大孔吸附树脂柱，用水洗脱除去杂质，再用40-75％乙醇水溶液洗脱，洗脱液浓缩，干燥，粉碎，即得。

以上制备方法中，所述的大孔吸附树脂柱的吸附速度是1-3bv/h，水洗除杂流速是1-3bv/h，解吸速度是1-3bv/h。

本发明技术方案还提供了一种含有所述药物组合物的制剂，其特征在于，所述制剂由治疗有效量的所述的药物组合物与药学上可以接受的赋形剂制成。所述的制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液中的任一种。

本发明技术方案还提供了所述的药物组合物以及所述的制剂在制备预防或治疗缺血性脑卒中药物中的应用。

本发明具有的技术优势为有益技术效果：

1.药材资源丰富易得，制备工艺简单，适合大规模工业化生产。

2.具有明显的减少脑缺血面积，改善神经行为功能缺失的作用。

3.作用物质基础和作用机理明确，稳定可控，使用安全。

4.使用范围特别广泛，容易推广应用。

附图说明

图1.药物组合物(pp6)对icr小鼠mcao/r模型脑缺血面积的改善作用

图2.药物组合物(pp6)对sd大鼠mcao/r模型脑缺血面积的改善作用

注：与假手术组比较，###p<0.001；与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图3.药物组合物(pp6)单次治疗sd大鼠mcao/r模型longa法神经行为功能评分

注：与假手术组比较，##p<0.01；与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01。

图4.药物组合物(pp6)预防给药对sd大鼠mcao/r模型脑缺血面积影响

注：与假手术组比较，###p<0.001；与模型组比较，*p<0.05。

图5.药物组合物(pp6)预防给药sd大鼠mcao/r模型longa法神经行为功能评分

注：与假手术组比较，##p<0.01；与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01。

图6.不同组别sd大鼠mcao/r模型核磁共振成像t2wi扫描图像(4h,24h)

图7.药物组合物(pp6)预防给药对sd大鼠mcao/r模型不同时间脑缺血面积影响(4h,24h)

注：与假手术组比较，###p<0.001；与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图8.药物组合物(pp6)预防给药sd大鼠mcao/r模型不同时间longa’s神经行为功能评分(4h,24h)

注：与假手术组比较，###p<0.001；与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图9.药物组合物(pp6)预防给药sd大鼠mcao/r模型不同时间3d-tofmra血管结构(4h,24h)

图10.药物组合物(pp6)预防给药对sd大鼠mcao/r模型不同时间主要脑代谢物含量影响(4h,24h)

图11.药物组合物(pp6)预防给药7天对sd大鼠mcao/r模型缺血侧脑组织蛋白tpa、pai-1表达影响

(n＝4-6，mean±sem；与假手术组相比，##p<0.01；与模型组相比，**p<0.01)

图12.药物组合物(pp6)治疗给药7天对sd大鼠mcao/r模型缺血侧脑组织蛋白tpa、pai-1表达影响

(n＝6，mean±sem；与假手术组比较，##p<0.01；与模型组比较，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05)

具体实施方式

下面的实施例及药理活性实验用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。

实施例1：

取红花18.4g，粉碎，用10倍水提取2次，每次2小时；提取液合并浓缩至约180ml。d101型大孔吸附树脂200g装柱，上样。水洗1.3l，流速2bv/h，水洗液弃去；50％乙醇450ml洗脱，流速2bv/h；收集洗脱液，浓缩、干燥，得红花提取物。

取葛根52.5g，粉碎，用8倍95％乙醇提取2次，每次2小时；提取液合并浓缩至无醇味，加水稀释至约52ml。ab-8型大孔吸附树脂130g装柱，上样。水洗520ml，流速2bv/h，水洗液弃去；70％乙醇650ml洗脱，流速2bv/h；收集洗脱液，浓缩、干燥，得葛根提取物。

取川芎15.6g，粉碎，用10倍水提取2次，每次2小时；提取液合并浓缩至约60ml。d101型大孔吸附树脂47g装柱，上样。水洗200ml，流速2bv/h，水洗液弃去；50％乙醇235ml洗脱，流速2bv/h；收集洗脱液，浓缩、干燥，得川芎提取物。

取山楂31.4g，粉碎，用10倍60％乙醇提取2次，每次2小时；提取液合并浓缩至60ml。d101型大孔吸附树脂95g装柱，上样。水洗660ml，流速2bv/h，水洗液弃去；40％乙醇750ml洗脱，流速2bv/h；收集洗脱液，浓缩、干燥，得山楂提取物。

上述红花提取物、葛根提取物、川芎提取物、山楂提取物，加三七总皂苷0.92g，混合均匀，即得药物组合物。

实施例2：

取红花1.84kg，粉碎，用12倍、11倍水提取2次，每次2小时；提取液合并浓缩至约1.8l。d101型大孔吸附树脂20kg装柱，上样。水洗130l，流速2bv/h，水洗液弃去；50％乙醇45l洗脱，流速2bv/h；收集洗脱液，浓缩、干燥，得红花提取物。

取葛根5.13kg，粉碎，用8倍95％乙醇提取2次，每次2小时；提取液合并浓缩至无醇味，加水稀释至约5.1l。ab-8型大孔吸附树脂12.8kg装柱，上样。水洗50l，流速2bv/h，水洗液弃去；70％乙醇64l洗脱，流速2bv/h；收集洗脱液，浓缩、干燥，得葛根提取物。

取川芎1.20kg，粉碎，用10倍水提取2次，每次2小时；提取液合并浓缩至约4.8l。d101型大孔吸附树脂3.6kg装柱，上样。水洗14.4l，流速3bv/h，水洗液弃去；50％乙醇18l洗脱，流速3bv/h；收集洗脱液，浓缩、干燥，得川芎提取物。

取山楂3.84kg，粉碎，用8倍60％乙醇提取2次，每次2小时；提取液合并浓缩至7.7ld101型大孔吸附树脂11.5kg装柱，上样。水洗80l，流速2bv/h，水洗液弃去；40％乙醇92l洗脱，流速2bv/h；收集洗脱液，浓缩、干燥，得山楂提取物。

上述红花提取物、葛根提取物、川芎提取物、山楂提取物，加三七总皂苷92.2g，混合均匀，即得药物组合物。

实施例3：

取红花184g，粉碎，用12倍、11倍水提取2次，每次2小时；提取液合并浓缩至约180ml。d101型大孔吸附树脂2kg装柱，上样。水洗13l，流速2bv/h，水洗液弃去；50％乙醇4.5l洗脱，流速2bv/h；收集洗脱液，浓缩、干燥，得红花提取物。

取葛根371g，粉碎，用10倍、9倍95％乙醇提取2次，每次2小时；提取液合并浓缩至无醇味，加水稀释至约740ml。ab-8型大孔吸附树脂900g装柱，上样。5％乙醇洗3.6l，流速2bv/h，洗脱液弃去；70％乙醇4.5l洗脱，流速2bv/h；收集洗脱液，浓缩、干燥，得葛根提取物。

取川芎156g，粉碎，用10倍、8倍95％乙醇提取2次，每次2小时；提取液合并浓缩至约80ml，加水稀释至约620ml。d101型大孔吸附树脂470g装柱，上样。水洗1.88l，流速2bv/h，水洗液弃去；50％乙醇2.35l洗脱，流速2bv/h；收集洗脱液，浓缩、干燥，得川芎提取物。

取山楂314g，粉碎，用10倍、8倍70％乙醇提取2次，每次2小时；提取液合并浓缩至630ml。d101型大孔吸附树脂940g装柱，上样。水洗6.6l，流速2bv/h，水洗液弃去；75％乙醇7.5l洗脱，流速2bv/h；收集洗脱液，浓缩、干燥，得山楂提取物。

上述红花提取物、葛根提取物、川芎提取物、山楂提取物，加三七总皂苷9.2g，混合均匀，即得药物组合物。

实施例4：

取红花1.5kg，粉碎，用10倍水提取2次，每次2小时；提取液合并浓缩至约15l。d101型大孔吸附树脂7.5kg装柱，上样。水洗15l，流速3bv/h，水洗液弃去；50％乙醇37.5l洗脱，流速2bv/h；收集洗脱液，浓缩、干燥，得红花提取物。

取葛根1.1kg，粉碎，用8倍70％乙醇提取3次，时间3小时、1.5小时、1.5小时；提取液合并浓缩至无醇味(约0.95kg)，加水稀释至约1.8l。ab-8型大孔吸附树脂2.2kg装柱，上样。水洗5.5l，流速3bv/h，水洗液弃去；70％乙醇6.6l洗脱，流速2bv/h；收集洗脱液，浓缩、干燥，得葛根提取物。

取川芎2.3kg，粉碎，用8倍95％乙醇提取3次，时间3小时、1.5小时、1.5小时；提取液合并浓缩至无醇味(约2.9kg)，加水加热溶解，得约8.6kg。d101型大孔吸附树脂4.6kg装柱，上样。水洗11l，流速3bv/h，水洗液弃去；50％乙醇35l洗脱，流速2bv/h；收集洗脱液，浓缩、干燥，得川芎提取物。

取山楂1.3kg，粉碎，用10倍、8倍、8倍70％乙醇提取3次，时间3小时、1.5小时、1.5小时；提取液合并浓缩至无醇味(约2kg)，加水稀释至约4kg。d101型大孔吸附树脂3.3kg装柱，上样。水洗6.5l，流速3bv/h，水洗液弃去；75％乙醇10l洗脱，流速2bv/h；收集洗脱液，浓缩、干燥，得山楂提取物。

上述红花提取物、葛根提取物、川芎提取物、山楂提取物，加三七总皂苷65g，混合均匀，即得药物组合物。

实施例5：

取红花455g，粉碎，用10倍水提取2次，每次2小时；提取液合并浓缩至约4.5l。d101型大孔吸附树脂2.275kg装柱，上样。水洗4.5l，流速3bv/h，水洗液弃去；50％乙醇13.5l洗脱，流速2bv/h；收集洗脱液，浓缩、干燥，得红花提取物。

取葛根1.31kg，粉碎，用8倍70％乙醇提取3次，时间3小时、1.5小时、1.5小时；提取液合并浓缩至无醇味(约1.1kg)，加水稀释至约1.8l。ab-8型大孔吸附树脂2.6kg装柱，上样。水洗6.5l，流速3bv/h，水洗液弃去；70％乙醇7.8l洗脱，流速2bv/h；收集洗脱液，浓缩、干燥，得葛根提取物。

取川芎390g，粉碎，用8倍水提取2次，每次2小时；提取液合并浓缩至无醇味(约1kg)，加水加热溶解，得约1.5kg。d101型大孔吸附树脂1.17kg装柱，上样。水洗4.7l，流速3bv/h，水洗液弃去；50％乙醇5.8l洗脱，流速2bv/h；收集洗脱液，浓缩、干燥，得川芎提取物。

取山楂785g，粉碎，用10倍、8倍、8倍60％乙醇提取3次，时间3小时、1.5小时、1.5小时；提取液合并浓缩至无醇味(约1kg)，加水稀释至约2kg。d101型大孔吸附树脂2.4kg装柱，上样。水洗4.8l，流速3bv/h，水洗液弃去；40％乙醇14.4l洗脱，流速2bv/h；收集洗脱液，浓缩、干燥，得山楂提取物。

上述红花提取物、葛根提取物、川芎提取物、山楂提取物，加三七总皂苷23g，混合均匀，即得药物组合物。

将上述药物组合物、微晶纤维素265g、硬脂酸镁5g分别过筛，混合均匀，压片，包薄膜衣，即得药物组合物片剂。

药理试验

实验例1：药物组合物(实施例2组合物)对icr小鼠mcao/r模型脑缺血的改善作用

实验方法：

icr小鼠按体重随机分组，线栓法制备icr小鼠局灶性大脑中动脉栓塞模型，缺血2h后再灌注。再灌注同时单次治疗灌胃给药1次，给药体积0.1ml/10g。再灌注后24h，测定小鼠神经行为功能评分及脑缺血面积。

结果：

1、脑缺血面积测定结果显示，局灶性icr小鼠mcao/r模型，经单次治疗给药，缺血再灌24h后，与模型组比较，药物组合物组再灌注损伤缺血面积有缩小趋势，其中，300mg·kg^-1组再灌注损伤缺血面积有极显著性差异(^**p<0.01)。(如图1)

2、神经行为学测试结果显示，与模型组比较，阳性对照组longa法神经行为功能评分未见显著性差异(p>0.05)；药物组合物300mg·kg^-1组longa法神经行为功能评分有显著性差异(^*p<0.05)，可明显改善icr小鼠mcao/r模型脑缺血神经行为学功能，见表1。

表1.局灶性icr小鼠mcao/r模型筛选longa法神经行为功能评分

实验例2：药物组合物(实施例2组合物)单次治疗给药对sd大鼠mcao/r模型脑缺血的改善作用

实验方法：

sd大鼠按体重随机分组，线栓法制备sd大鼠局灶性大脑中动脉栓塞模型，缺血2h后再灌注。再灌注同时单次治疗灌胃给药1次，给药体积0.1ml/10g。脑缺血再灌注后24h断头取脑，测定大鼠脑缺血面积和神经行为功能评分。

结果：

1、脑缺血面积测定结果显示，局灶性sd大鼠mcao/r模型，经单次治疗给药，缺血再灌24h后：(1)与模型组比较，阳性对照组再灌注损伤缺血面积有极显著性差异(^***p<0.001)；(2)与模型组比较，药物组合物200mg·kg^-1组sd大鼠再灌注损伤缺血面积有显著性差异(^**p<0.01)；100mg·kg^-1组、400mg·kg^-1组sd大鼠mcao/r损伤缺血面积显著性差异(^*p<0.05)。(如图2)

2、按照longa法对sd大鼠的神经行为学功能进行5分制评分，与假手术组比较，模型组大鼠神经行为功能显著缺失(^##p<0.01)，与模型组比较，药物组合物各剂量组longa法神经行为功能显著改善(^*p<0.05；^**p<0.01)(如图3)。

实验例3：药物组合物(实施例2组合物)预防给药对sd大鼠mcao/r模型脑缺血的“量-效”药效学评价

实验方法：

sd大鼠按体重随机分组，造模前预防性连续灌胃给药7天，线栓法制备sd大鼠局灶性大脑中动脉栓塞模型，缺血2h后再灌注，脑缺血再灌注后24h断头取脑，测定大鼠脑缺血面积和神经行为功能评分。

结果：

1、预防给药7天，缺血再灌24h，与模型组比较，阳性对照丁苯酞组再灌注损伤缺血面积有显著性差异(^*p<0.05)；药物组合物200mg·kg^-1组、400mg·kg^-1组再灌注损伤缺血面积有显著性差异(^*p<0.05)(如图4)。

2、按照longa法对sd大鼠的神经行为学功能进行5分制评分，与假手术组比较，模型组大鼠神经行为功能显著缺失(^###p<0.001)；与模型组比较，药物组合物200mg·kg^-1组、400mg·kg^-1组longa法神经行为功能显著改善(^*p<0.05；^**p<0.01)。(如图5)

实验例4：药物组合物(实施例2组合物)预防给药对sd大鼠mcao/r模型脑缺血的“时-效”药效学评价

实验方法：

sd大鼠按体重随机分组，造模前预防性连续灌胃给药7天，线栓法制备sd大鼠局灶性大脑中动脉栓塞模型，缺血2h后再灌注，分别于大鼠脑缺血再灌后4h和24h行脑部磁共振成像扫描，测定预防给药sd大鼠脑mcao/r损伤不同时间阶段的脑缺血面积、神经行为功能评分、脑水肿体积、脑血管结构和主要脑代谢物含量。

结果：

预防给药7天，脑功能核磁共振成像t2wi分析表明：缺血再灌4h，与模型组比较，阳性对照组再灌注损伤缺血面积、脑水肿体积有极显著性差异(^***p<0.001)，药物组合物200mg·kg^-1组再灌注损伤缺血面积、脑水肿体积有显著性差异(^*p<0.05)；缺血再灌24h，与模型组比较，阳性对照组再灌注损伤缺血面积有显著性差异(^**p<0.01)，脑水肿体积有显著性差异(^*p<0.05)，药物组合物200mg·kg^-1组再灌注损伤缺血面积有显著性差异(^*p<0.05)，脑水肿体积有显著性差异(^**p<0.01)。同时，与模型组比较，阳性对照组、药物组合物200mg·kg^-1组、400mg·kg^-1组神经行为功能显著改善(4h、24h，^***p<0.001)。¹h-mrs显示，与模型组比较，缺血再灌4h，阳性对照组缺血侧naa极显著升高(^***p<0.001)，药物组合物200mg·kg^-1组缺血侧naa显著升高(^*p<0.05)；缺血再灌24h，阳性对照组缺血侧lip显著降低(^*p<0.05)、cho极显著降低(^***p<0.001)，药物组合物100mg·kg^-1组缺血侧cho极显著降低(^***p<0.001)，药物组合物200mg·kg^-1组缺血侧lip显著降低(^**p<0.01)、cho极显著降低(^***p<0.001)，药物组合物400mg·kg^-1组缺血侧lip显著降低(^*p<0.05)、cho显著降低(^**p<0.01)。(如图6～10)

实验例5：药物组合物(实施例2组合物)抗sd大鼠mcao/r模型脑缺血/再灌注损伤保护机制研究

实验方法：

sd大鼠按体重随机分组，线栓法制备sd大鼠局灶性大脑中动脉栓塞模型。(1)预防给药：造模前预防性连续灌胃给药7天，脑缺血再灌注24h后断头取脑；(2)治疗给药：模型制备成功后连续治疗性连续灌胃给药7天，末次给药2h后断头取脑。通过蛋白免疫印迹(westernblot)法，考察缺血侧脑组织中组织型纤溶酶原激活物(tissueplasminogenactivator，tpa)、纤溶酶原激活物抑制因子ⅰ(plasminogenactivatorinhibitor-1，pai-1)、amp依赖的蛋白激酶(amp-activatedproteinkinase，ampk)、蛋白激酶b(proteinkinaseb，akt)、内皮型一氧化氮合成酶(endothelialnitricoxidesynthase，enos)、表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)、细胞外调节蛋白激酶(extracellularsignalproteinkinase，erk1/2)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogenactivatedproteinkinase，p38mapk)的表达水平。

结果：

预防给药7天，与模型组比较，药物组合物组显著增加sd大鼠mcao/r缺血侧脑组织tpa(^**p<0.01)、p-p38mapk(^***p<0.001)蛋白表达量，显著升高p-ampk/ampk(^***p<0.001)、p-egfr/egfr(^***p<0.001)比值。治疗给药7天，与模型组比较，药物组合物组显著增加sd大鼠mcao/r缺血侧脑组织tpa(^***p<0.001)、p-p38mapk(^***p<0.001)蛋白表达量，降低pai-1(^*p<0.05)蛋白表达量，显著升高p-ampk/ampk(^**p<0.01)、p-akt/akt(^**p<0.01)、p-enos/enos(^*p<0.05)、p-erk/erk(^**p<0.01)比值。药物组合物脑血管及神经保护作用机制可能与促进缺血侧脑组织tpa表达，激活p38mapk-akt、bdnf-egfr-erk、akt-ampk-enos信号通路有关(如图11～12)。