心脉隆抗血小板及抗血栓药理应用的制作方法

本发明涉及的是心脉隆在抗血小板及抗血栓药理方面的应用，属于药物化学、药理学领域。

技术背景

心脑血管疾病主要包括缺血性心脏病、急性心肌梗死、肺梗死、脑卒中、脑梗死等常见病，极大威胁人类健康和生命，是我国居民首位死因^[1]。而心脑血管疾病的发生、发展主要是血小板激活、粘附、聚集直至血栓形成一系列的级联反应^[2,3]。因此，抑制血小板功能及血栓形成对于心脑血管疾病的防治至关重要。

心脉隆是一种由昆虫提取物为主要成分制成的含生物活性物质的临床药物，属国家中药二类新药(国药准字z20060443,中国专利申请号94118839.6)。心脉隆是由蟑螂、美洲大蠊等提取物制成并经纯化处理后的浸膏，该浸膏主要由复合核苷和粘氨酸组成，也可含有少量的游离氨基酸、中性糖、粘糖^[4]。心脉隆对心血管疾病具有较广泛的治疗作用，且通过急性毒性试验和长期毒性试验^[4]。研究发现心脉隆主要具有增强心肌收缩力、升压、改善微循环、抗动脉粥样硬化、增加冠状动脉血流，兴奋呼吸，增加肾血流和利尿等药理作用^[5,6]。目前临床上普遍用于治疗急慢性心力衰竭、休克、心肌缺血性疾病，可明显改善微循环，取得了良好的临床疗效，但对血小板功能以及血栓性疾病的影响还未见相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种心脉隆中药在用于制备抗血小板及抗血栓制剂中的应用。

所述的心脉隆中药可用于制备抗血小板及抗血栓的制剂。

所述的心脉隆具有抗血小板及抗血栓的药理作用，通过体外人血血小板聚集实验来测定其对血小板聚集活性的作用，通过小鼠急性肺栓塞模型来研究其对小鼠血栓性疾病的作用。实验证明，心脉隆对血小板功能及小鼠血栓性疾病有明显的抑制作用。本发明所涉及的新的心脉隆的药理作用，迄今尚未见到相关报道。

本发明所述的心脉隆是用生理盐水溶解浸膏而来，浓度以m/v表示。

在上述体外人血血小板聚集实验中，测定如下各种浓度0mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml、10mg/ml的心脉隆对人血血小板聚集功能的影响。

在上述小鼠急性肺栓塞模型实验中，给药浓度分别是0mg/kg、10mg/kg、20mg/kg，以及临床上常规抗血小板药物阿司匹林50mg/kg，对各组小鼠左肺行h＆e染色,光镜下观察肺组织中微血管内血栓的形态,分布,肺间质和实质的形态学变化，同时测定各组小鼠的存活时间，来评估心脉隆对血栓形成的影响。

本发明从分子、整体动物模型双层面进行研究，发现心脉隆可抑制胶原（collagen）、凝血酶（thrombin）、花生四烯酸（arachidonicacid,aa）、二磷酸腺苷（adp）等激动剂引起的血小板聚集，且可抑制小鼠急性肺血栓的形成，延长小鼠的生存时间。

本发明所提供的心脉隆另一生物学特性能预见其许多应用。

本发明可涉及用于血栓性疾病：评估血小板聚集功能，评价抗血小板治疗（如阿司匹林，氯吡格雷、替格瑞洛等）现在或将来治疗的有效性；同时，因其抑制血小板聚集作用，可用于抗血栓治疗。

本发明可作为瘢痕形成剂或皮肤病学乳剂的用途：某些伤口瘢痕形成或皮肤性疾病的愈合需要血小板的就地迁移、粘附、聚集和活化。

附图说明

图1为经光学比浊法检测不同浓度心脉隆（0mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml、10mg/ml）对胶原、adp、花生四烯酸、凝血酶诱导的血小板聚集影响的血小板聚集曲线图。洗涤血小板与不同浓度的心脉隆在37℃下孵育10分钟后，加入胶原、凝血酶、花生四烯酸、adp等诱导剂，并记录血小板聚集曲线（均数，n≥3）。

图2为经光学比浊法检测不同浓度心脉隆（0mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml、10mg/ml）对胶原、adp、花生四烯酸、凝血酶诱导的血小板聚集影响的条状图。[均数±标准误，n≥3；*（p<0.05），**（p<0.01）]。

图3为不同浓度心脉隆（0mg/kg、10mg/kg、20mg/kg）及临床上常规抗血小板药物阿司匹林（50mg/kg）对胶原-肾上腺素诱导的小鼠急性肺血栓后存活时间的影响。（横坐标为分组，纵坐标为存活时间：s）

图4为不同浓度心脉隆（10mg/kg、20mg/kg）及临床上常规抗血小板药物阿司匹林（50mg/kg）对胶原-肾上腺素诱导的小鼠急性肺血栓后的小鼠左肺组织行h＆e染色，放大倍数：10x4。

具体实施方式

1.洗涤血小板及心脉隆溶液的制备

洗涤血小板的制备：取健康志愿者肘静脉血于3.8%的枸橼酸钠（1:9）抗凝管内，tyrodebuffer等体积（1:1）稀释，同时加入pge1（终浓度为50ng/ml）；200×g离心15min,吸取上层富含血小板的液体，加入pge1（终浓度为50ng/ml），1000×g离心10min，弃去上清液，得到浓缩血小板团块，加入适量tyrodebuffer，并分别加入pge1（终浓度为50ng/ml）和终浓度1mmedta，巴氏吸管轻柔吹打，重悬血小板；1000×g离心10min，弃去上清液，得到血小板团块，加入适量tyrodebuffer，轻柔吹打，重悬血小板；用血细胞自动分析仪测定血小板数目，tyrodebuffer调整血小板数目为3×10⁸个/ml，室温存放备用。

心脉隆溶液的配置：取心脉隆浸膏常温下溶于生理盐水配置为100mg/ml的心脉隆液体，室温存放备用。

2.人血血小板聚集功能的测定

（1）采用比浊法原理测定血小板聚集，在chrono-log公司双通道血小板聚集仪上进行，首先预热血小板聚集仪至37℃，记录仪走纸速度设置为1cm/分钟。比浊管中加入400ul血小板悬液和搅拌子，加入不同浓度（0.1mg/kg、1mg/kg、10mg/kg）心脉隆孵育10分钟后，以tyrodebuffer为参比，37℃恒温恒速磁力搅拌下(1200rpm)描记基线，待基线稳定后，加入不同激动剂（凝血酶、花生四烯酸、胶原、二磷酸腺苷等）观察记录聚集曲线变化。至少重复三次，取平均值。根据血小板聚集率记录血小板聚集曲线图（图1）和绘制相应的条状图（图2）。同时，通过以下公式计算血小板聚集抑制率：[(x-y)/x]*100%。x代表各激动剂诱导的血小板平均聚集率；y代表不同浓度心脉隆＋各激动剂诱导的血小板平均聚集率。

（2）实验数据用spss21.0统计软件进行处理。结果用均数±标准误表示。多组间比较先进行方差齐性检验，方差齐者用单因素方差分析（one-wayanova），两两比较用lsd（least-significantdifference,即最小显著性差异法）检验；若方差不齐则行tamhane’st2检验，两两比较采用t检验。p<0.05则认为差异具有统计学意义。

从实验结果可以看出，在上述有效剂量范围内，本发明所述的心脉隆对凝血酶、花生四烯酸（aa）、胶原（collagen）、二磷酸腺苷（adp）诱导的人血血小板聚集有显著的抑制作用，呈现剂量依赖关系（表1a及表1b，图1，图2）。

表1a

表1b

从表1a及表1b可知，本发明所述的心脉隆在上述有效剂量范围内，对花生四烯酸（aa）、凝血酶、胶原（collagen）、二磷酸腺苷（adp）诱导的人血血小板聚集有显著的抑制作用，呈现剂量依赖关系。

3.心脉隆对胶原-肾上腺素诱导的小鼠急性肺血栓的作用

实验动物为昆明小鼠50只，体重20-30g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：syxk（滇）2013-0004。

1)小鼠称重,记录并分组,本实验分为5组:空白组、模型组、心脉隆10mg/kg组、心脉隆20mg/kg组和阿司匹林50mg/kg组，每组10例；

2)配置胶原(1.0mg/kg)和肾上腺素(100ug/kg)混合注射液作模型诱导剂;

3)小鼠按组别尾静脉注射给药,空白对照组、模型组均给予生理盐水,阳性对照组给予50mg/kg阿司匹林，用药组分别给予心脉隆10mg/kg、20mg/kg;

4)给药30min后,使用胶原-肾上腺素混合液尾静脉注射造模;

5)记录造模5min内小鼠行为学改变和各组小鼠的存活时间;

6)取出各组小鼠左肺,使用4%多聚甲醛溶液固定;

7)固定后切片,h＆e染色,光镜下观察肺组织中微血管内血栓的形态,分布,肺间质和实质的形态学变化。

实验数据用spss21.0统计软件进行处理。结果用均数±标准误表示。多组间比较先进行方差齐性检验，方差齐者用单因素方差分析（one-wayanova），两两比较用lsd（least-significantdifference,即最小显著性差异法）检验；若方差不齐则行tamhane’st2检验，两两比较采用t检验。p<0.05则认为差异具有统计学意义。

实验结果显示：与模型组（152.40±2.31s）相比，心脉隆10mg/kg组（306.10±17.51s，p<0.05）和心脉隆20mg/kg组（352.70±10.53s，p<0.05）以及50mg/kg阿司匹林组（367.10±14.39s，p<0.05）均能延长小鼠死亡时间，且具有显著性差异(图3)；其中，50mg/kg阿司匹林组与心脉隆20mg/kg组均可使小鼠死亡率降低，且未见明显统计学差异（p>0.05）（图3），说明心脉隆20mg/kg组与50mg/kg阿司匹林组抑制体内血栓形成的效果相当（表2）。

表2

从表2可看出，本发明提供的心脉隆可延缓胶原-肾上腺素混合液诱导的小鼠急性肺栓塞后的死亡时间，且心脉隆20mg/kg组与临床上常规抗血小板药物50mg/kg阿司匹林组的抗血栓作用效果相当。

免疫组化结果显示:空白组无血栓形成（图4a）,模型组血栓形成明显（如图4b箭头所示）,而阿司匹林组和心脉隆高剂量组(20mg/kg)明显降低血栓形成(如图4e、4d箭头所示),心脉隆低剂量组(10mg/kg)内可见小血栓形成,但较模型组血栓形成减少(如图4c箭头所示)。因此得出结论,心脉隆对胶原-肾上腺素诱导的体内血栓的形成具有抑制作用。

参考文献

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