一种快速重建皮肤及毛囊的新方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速重建皮肤及毛囊的新方法。

背景技术：

皮肤是最大的器官，有保护机体屏障的作用，然而很多皮肤创伤后自身不能恢复，甚至会引发感染而导致死亡，皮肤的修复和再生一直是困扰人类的一大难题。毛囊是由多种细胞组成的皮肤附属器官，是皮肤的一个重要组成部分，具有特征性的周期循环。优良的毛囊实验模型对研究毛发再生、色素形成、伤口愈合等具有重要作用。研究发现，皮肤的严重缺损创面主要或可依靠残存附件尤其是毛囊细胞的增值来愈合，平均5个毛囊培养可形成1cm²的重建表皮；此外，还有研究发现，毛囊在保护体表、感觉传导、毛色肤色决定、表皮再生等多方面也同样发挥着重要作用。因此，研究毛囊的结构及功能在皮肤的再生医学、美容、以及疾病治疗等方面有着不可忽视的意义。

组织工程学是近年发展起来的一门新型科学，涉及到细胞生物学、生物力学、生物医学工程等许多学科。利用细胞在基质中的正常生长、分化，进而形成组织或器官，替换已损伤的组织和器官是现代细胞和组织工程研究的主要内容，使医学进人了细胞治疗和制造器官与组织的时代，因而临床上有着广泛的应用前景。而毛囊是皮肤生物学中进行组织工程学研究的一个很理想的器官，其中毛囊结构中的毛囊干细胞，可作为种子细胞参与组织工程全层皮肤的构建以及皮肤损伤后损伤组织的再生重建，在毛囊再生、血管重建、表皮及皮肤附属腺体的再生重建等一系列皮肤修复过程中均具有重要作用。

目前关于毛囊的重建大多通过毛囊干细胞，获取毛囊干细胞首先需要将表皮和真皮分离，从真皮中拔出毛囊，在解剖显微镜下剥离毛囊干细胞区，酶消化分离细胞，整个操作过程费时费力，且所分离细胞数量有限；也有研究用小鼠皮肤表皮和真皮细胞共移植诱导毛囊再生实验，但是这些细胞需要从皮肤中分离并单独培养，然后按照1：1混合后被植到裸鼠上，培养6周后才能观察到毛囊结构，但是该毛囊结构不能生长毛发，同时该方法操作时间长，细胞分离繁琐。此外，目前研究中，毛囊重建方法要求采用新鲜分离的新生小鼠皮肤细胞，但是新生鼠的来源有限，且在基础研究以及临床研究中成年鼠更有广的应用范围，且来源也多，但来源于成年鼠毛囊的皮肤组织重建毛囊一直很难突破的点。

因此，亟待开发一种操作简单、耗时短，且可以以成年鼠来源的皮肤组织重建皮肤毛囊的新方法。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明目的是提供一种全层背部皮肤组织细胞重建皮肤毛囊的新方法，该技术是获取全层背部皮肤组织细胞的体外增殖并维持多功能性的培养方法，通过该技术再生的皮肤毛囊可见完整的毛囊结构，并可以长出正常色素的毛发；而且该技术仅需要3周即可重建出带有毛发结构的皮肤毛囊；同时该方法对成年鼠来源的皮肤组织也可以进行皮肤毛囊重建，为毛发再生等提供了新思路。

本发明的技术方案是：

本发明提供一种快速重建皮肤毛囊的新方法，包括以下步骤：

(1)将动物全层背部皮肤组织制备成匀浆组织；

(2)将上述匀浆组织转移到带气孔的膜上，并均匀的平整铺开，在培养箱中培养；

(3)将步骤(2)培养好的带有匀浆皮肤组织的膜接合到裸鼠背部皮肤创口处，且匀浆组织朝下，膜覆盖在上，培养一段时间。

优选地，所述动物为鼠。

进一步，优选地，所述动物为新生鼠或成年鼠。

优选地，所述全层背部皮肤为剃掉毛发的皮肤组织。

所述匀浆为粘稠状。

优选地，所述带气孔的膜为纤维膜或硅胶膜；所述匀浆组织表面积小于纤维膜或硅胶膜表面积。

优选地，所述细胞培养箱培养的条件为37℃，含5％co2，培养时间为1～1.5小时；优选地，培养时间为1小时。

优选地，步骤(3)中，所述培养时间为3周以上。

本发明还提供了所述方法在皮肤再生和皮肤毛囊重建以及毛囊疾病中的应用。

本发明还提供了一种皮肤毛囊模型，所述模型由下述方法制备得到：

(1)培养动物全层背部皮肤组织，制备成匀浆组织；

(2)将上述匀浆组织转移到带气孔的膜上，并均匀的平整铺开，在培养箱中培养；

(3)将步骤(2)培养好的带有匀浆皮肤组织的膜接合到需要皮肤及毛囊重建的部位，且匀浆组织朝下，膜覆盖在上，培养一段时间。

优选地，所述动物为鼠；

进一步，优选地，所述动物为新生鼠或成年鼠。

优选地，所述全层背部皮肤为剃掉毛发的皮肤组织。

所述匀浆为粘稠状

优选地，所述带气孔的膜为纤维膜或硅胶膜；所述匀浆组织表面积小于纤维膜或硅胶膜表面积。

优选地，所述细胞培养箱培养的条件为37℃，含5％co2，培养时间为1～1.5小时；优选地，培养时间为1小时。

优选地，步骤(3)中，所述培养时间为3周以上。

本发明中皮肤毛囊模型在开发治疗创伤的临床产品方面、皮肤再生方面以及毛囊疾病研究方面的应用。

本发明的有益效果

1、本发明操作简单方便，耗时短，仅需要3周即可实现毛囊的重建，而且新生鼠和成年鼠来源的皮肤组织都能重建。因而本发明具有较强的实际应用前景和科研价值，不仅可以在皮肤损伤治疗中功能性皮肤的重建方面提供新思路，也可以在基础科学研究方面提供更简便易行的方法，对今后建立重建皮肤动物模型应用与科研及转化研究提供依据。

2、本发明成功的将全层背部皮肤组织细胞移植到免疫缺陷的裸鼠背上再生出带有毛发的完整毛囊结构，实现了背部全层皮肤缺失后皮肤毛囊的重建。

3、本发明成本低，成功率高，大大提高了操作的可重复性和可操作性，易于推广使用。

附图说明

图1为组织匀浆在膜上培育。

图2为移植3周后带有毛发的再生皮肤。

图3为再生皮肤的组织切片图。

图4为重建的皮肤毛囊结构he染色后的组织学分析。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

材料：成年c57小鼠(8周龄)，免疫缺陷(nude/nude,裸鼠)小鼠(10周龄)，新生c57小鼠(1-4周龄)，纤维膜或硅胶膜，co2细胞培养箱，he染色试剂盒，显微镜。

正如背景技术所介绍的，现有技术中存在皮肤毛囊重建方法复杂且操作时间长，而且目前研究中，毛囊重建方法要求采用新鲜分离的新生小鼠皮肤细胞，但是新生鼠的来源有限，且在基础研究以及临床研究中成年鼠更有广的应用范围，且来源也多，但来源于成年鼠毛囊的皮肤组织重建毛囊一直很难突破的点，为了解决如上的技术问题，本申请提出了一种快速重建皮肤毛囊的新方法及其模型。

本申请的一种典型实施方式，提供了一种快速重建皮肤毛囊的新方法，包括以下步骤：

(1)将动物全层背部皮肤组织制备成匀浆组织；

(2)将上述匀浆组织转移到带气孔的膜上，并均匀的平整铺开，在培养箱中培养；

(3)将步骤(2)培养好的带有匀浆皮肤组织的膜接合到裸鼠背部皮肤创口处，且匀浆组织朝下，膜覆盖在上，培养一段时间。

优选地，所述动物为鼠。

进一步，优选地，所述动物为新生鼠或成年鼠。

优选地，所述全层背部皮肤为剃掉毛发的皮肤组织。

所述匀浆为粘稠状

优选地，所述带气孔的膜为纤维膜或硅胶膜；所述匀浆组织表面积小于纤维膜或硅胶膜表面积。

优选地，所述细胞培养箱培养中的条件为37℃，含5％co2，培养时间为1～1.5小时；优选地，培养时间为1小时。

优选地，步骤(3)中，所述培养时间为3天以上。

本申请的一种典型实施方式，提供了一种上述所述方法在皮肤再生和皮肤毛囊重建以及毛囊疾病中的应用。

本申请的第三种实施方式，提供了一种皮肤毛囊模型，所述模型由下述方法制备得到：

(1)培养动物全层背部皮肤组织，制备成匀浆组织；

(2)将上述匀浆组织转移到带气孔的膜上，并均匀的平整铺开，在培养箱中培养；

(3)将步骤(2)培养好的带有匀浆皮肤组织的膜接合到裸鼠背部皮肤创口处，且匀浆组织朝下，膜覆盖在上，培养一段时间。

优选地，所述动物为鼠；

进一步，优选地，所述动物为新生鼠或成年鼠。

优选地，所述全层背部皮肤为剃掉毛发的皮肤组织。

所述匀浆为粘稠状。

优选地，所述带气孔的膜为纤维膜或硅胶膜；所述匀浆组织表面积小于纤维膜或硅胶膜表面积。

优选地，所述细胞培养箱培养中的条件为37℃，含5％co2，培养时间为1～1.5小时；优选地，培养时间为1小时。

优选地，步骤(3)中，所述培养时间为3天以上。

本申请的第四种实施方式，提供了一种本发明中皮肤毛囊模型在开发治疗创伤的临床产品方面、皮肤再生方面以及毛囊疾病研究方面的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

实施例1

一种快速重建皮肤毛囊的新方法及其模型，包括以下步骤：

(1)培养去掉毛发的成年鼠全层背部皮肤组织，并制备成匀浆组织；(如图1)

(2)将上述匀浆组织转移到带气孔的纤维膜或硅胶膜上，并均匀的平整铺开，在37℃，含5％co2的培养箱中培养1小时；(如图2)

(3)将步骤(2)培养好的带有匀浆皮肤组织的膜接合到裸鼠背部皮肤创口处，且匀浆组织朝下，膜覆盖在上，培养3周；(如图3)

(4)取重建长有毛发的皮肤进行固定，切片，he染色，组织学分析重建的皮肤毛囊结构。(如图4)

结论：经图4组织学分析(he染色)重建皮肤中毛囊结构完整，毛囊含成熟的毛干和真皮乳头，且毛囊外根鞘与真皮界限明显，毛囊密度正常，成熟的毛囊都带有相应的皮脂腺，说明此时重建的毛囊发育正常。

实施例2

一种快速重建皮肤毛囊的新方法及其模型，包括以下步骤：

(1)培养去掉毛发的新生鼠全层背部皮肤组织，并制备成匀浆组织；

(2)将上述匀浆组织转移到带气孔的纤维膜或硅胶膜上，并均匀的平整铺开，在37℃，含5％co2的培养箱中培养1小时；

(3)将步骤(2)培养好的带有匀浆皮肤组织的膜接合到裸鼠背部皮肤创口处，且匀浆组织朝下，膜覆盖在上，培养3周；

(4)取重建长有毛发的皮肤进行固定，切片，he染色，组织学分析重建的皮肤毛囊结构。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。