孕激素在抑制血管内皮生长因子表达中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及孕激素在抑制血管内皮生长因子表达中的应用。
背景技术：
：雌激素和孕激素(progesterone)严格调控正常子宫内膜腺上皮细胞的生长和分化。雌激素可促进子宫内膜腺上皮细胞增生，而内源性孕激素具有保护腺上皮细胞过度增生的作用。雌激素替代疗法中，孕激素与雌激素联合使用可以预防子宫内膜腺癌的发生，但高剂量的孕激素也可诱发细胞凋亡。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，vegf)是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生。vegf-c(vascularendothelialgrowthfactorc，vegf-c)是vegf家族成员之一，其通过结合酪氨酸激酶受体和非酪氨酸激酶受体来激发信号传导通路，参与淋巴血管内皮细胞的增生、迁移及新生淋巴血管的生成。技术实现要素：本发明的目的是抑制血管内皮生长因子表达。本发明首先保护一种产品，其可含有孕激素；所述产品的功能可为抑制血管内皮生长因子表达。上述产品中，所述“抑制血管内皮生长因子表达”可通过抑制血管内皮生长因子的启动子和/或5’utr的活性来实现。上述任一所述的产品中，所述血管内皮生长因子可为血管内皮生长因子c。上述任一所述的产品中，所述血管内皮生长因子c的启动子和5’utr的核苷酸序列可如序列表中序列1所示。本发明还保护孕激素在抑制血管内皮生长因子表达中的应用。本发明还保护孕激素在制备抑制血管内皮生长因子表达的产品中的应用。上述任一所述的应用中，所述“抑制血管内皮生长因子表达”可通过抑制血管内皮生长因子的启动子和/或5’utr的活性来实现。上述任一所述的应用中，所述血管内皮生长因子可为血管内皮生长因子c。上述任一所述的应用中，所述血管内皮生长因子c的启动子和5’utr的核苷酸序列可如序列表中序列1所示。上述任一所述血管内皮生长因子c可为如下a1)或a2)或a3)：a1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白质；a2)在序列表中序列3所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。其中，序列表中序列3由714个氨基酸残基组成。为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列3所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的dna序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。编码上述任一所述血管内皮生长因子c的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的dna分子：b1)编码区是序列表中序列2所示的dna分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列2所示的dna分子；b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于人且编码所述血管内皮生长因子c的dna分子；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，来源于人且编码所述血管内皮生长因子c的dna分子。其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。其中，序列表中序列2由2145个核苷酸组成，序列表中序列2的核苷酸编码序列表中序列3所示的氨基酸序列。本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的血管内皮生长因子c的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明提供的血管内皮生长因子c的核苷酸序列80％或者更高同一性的核苷酸，只要编码血管内皮生长因子c，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。本发明还保护a1)或a2)。a1)孕激素在预防和/或治疗子宫内膜癌中的应用。a2)孕激素在制备用于预防和/或治疗子宫内膜癌的产品中的应用。上述任一所述孕激素具体可为sigma-alorich公司产品。具体的，孕激素为sigma-alorich公司的、产品目录号为p0130的产品。实验证明，孕激素通过抑制vegf-c启动子和/或5’utr的活性，下调vegf-c基因和vegf-c蛋白的表达。本发明具有重要的应用价值。附图说明图1为孕激素抑制vegf-c基因的表达。图2为孕激素对vegf-cmrna稳定性的影响。图3为荧光酶活性检测结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。ishikawa细胞为sigma-alorich公司产品，产品目录号为99040201-1vl。pgl3basic载体中为promega公司的产品，产品目录号为e1741。孕激素为sigma-alorich公司产品，产品目录号为p0130。雌激素为sigma-alorich公司产品，产品目录号为e1024。lipofectamine2000转染试剂为thermofisherscientific公司的产品，产品目录号为11668019。actinomycind溶液：将5mgactinomycind(sigma公司产品)溶于2ml乙醇，然后用水定容至1l，最后使用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。实施例1、孕激素抑制vegf-c基因的表达设置孕激素处理试验组、雌激素处理试验组和对照组。试验重复三次，每次重复的步骤如下：1、孕激素处理试验组(1)取ishikawa细胞，加入胎牛血清和孕激素，得到处理体系。该处理体系中，孕激素的浓度为1×10－8m，胎牛血清的浓度为0.1％(v/v)。(2)完成步骤(2)后，取所述处理体系，37℃处理36h。(3)完成步骤(2)后，提取所述ishikawa细胞的总rna，然后进行cdna第一条链合成反应，得到cdna。向该cdna中加入ddh2o，得到cdna浓度为1000ng/μl的模板溶液。(4)以步骤(3)得到的模板溶液为模板进行实时定量pcr检测，得到孕激素处理试验组中vegf-c基因的相对表达量(以36b4基因为内参基因)。鉴定vegf-c基因的引物为5’-agggtcaggcagcgaacaaga-3’和5’-cctcctgagccaggcatctg-3’。内参为36b4基因，内参的引物为5’-atacagcagatccgcatg-3’和5’-tcatggtgttcttgcccatca-3’。反应程序：95℃变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸10min。2、雌激素处理试验组按照步骤1的方法，将孕激素替换为雌激素，其它步骤均不变，得到雌激素处理试验组中vegf-c基因的相对表达量(以36b4基因为内参基因)3、对照组将步骤1中的(1)替换为步骤(a)，其它步骤均不变，得到对照组中vegf-c基因的相对表达量。步骤(a)为：取ishikawa细胞，加入胎牛血清，得到处理体系。该处理体系中，胎牛血清的浓度为0.1％(v/v)。将对照组中vegf-c基因的相对表达量作为1，计算试验组(孕激素处理试验组或雌激素处理试验组)中vegf-c基因的相对表达量。比较对照组与试验组(孕激素处理试验组或雌激素处理试验组)的vegf-c基因的相对表达量，进行t-test检验，计算p值。孕激素处理试验组中vegf-c基因的相对表达量见图1。结果表明，孕激素处理试验组和雌激素处理试验组中vegf-c基因的相对表达量分别为对照组的0.42倍(p<0.01)和1.1倍(p>0.05)。因此，孕激素可以抑制vegf-c基因的表达，而雌激素不可以抑制vegf-c基因的表达。实施例2、孕激素抑制vegf-c基因的表达的机制一、孕激素对vegf-cmrna稳定性的影响设置孕激素处理试验组和对照组。试验重复三次，每次重复的步骤如下：1、孕激素处理试验组(1)用0.25％胰蛋白酶消化处于对数生长期的ishikawa细胞，然后用含10％(v/v)fbs的dmem培养基重悬并稀释，获得细胞密度为6×106个/cm2的细胞悬浮液。(2)完成步骤(1)后，取96孔培养板，每孔接种100μl步骤1获得的细胞悬浮液，37℃、5％co2环境中培养24h。(3)完成步骤(2)后，取所述96孔板，吸弃上层培养基，加入100μl含0.1％(v/v)fbs的dmem培养基，37℃、5％co2环境中培养24h。(4)完成步骤(3)后，取所述96孔板，加入孕激素，得到处理体系(处理体系中的孕激素的浓度为5×10－8m)，然后5％co2、37℃培养0h、2h、4h、6h、8h、10h或12h，最后加入2μlactinomycind溶液，继续5％co2、37℃培养4h。孕激素每个处理时间设置3个复孔。(5)完成步骤(4)后，取所述96孔板，吸弃上层培养基，收取ishikawa细胞。(6)完成步骤(5)后，提取所述ishikawa细胞的总rna，然后进行cdna第一条链合成反应，得到cdna，向上述cdna加入ddh2o稀释，得到cdna浓度为1000ng/μl的模板溶液。(7)以步骤(6)得到的模板溶液为模板进行实时定量pcr检测，得到孕激素处理试验组中vegf-c基因的相对表达量(以36b4基因为内参基因)。鉴定vegf-c基因的引物为5’-agggtcaggcagcgaacaaga-3’和5’-cctcctgagccaggcatctg-3’。内参为36b4基因，内参的引物为5’-atacagcagatccgcatg-3’和5’-tcatggtgttcttgcccatca-3’。2、对照组(1)同步骤1中(1)。(2)同步骤1中(2)。(3)完成步骤(2)后，取所述96孔板，吸弃上层培养基，加入100μl含0.1％(v/v)fbs的dmem培养基，37℃、5％co2环境中培养24h、26h、28h、30h、32h、34h或36h，然后加入2μlactinomycind溶液，继续5％co2、37℃培养4h。(4)完成步骤(3)后，取所述96孔板，吸弃上层培养基，收取ishikawa细胞。(5)完成步骤(4)后，提取所述ishikawa细胞的总rna，然后进行cdna第一条链合成反应，得到cdna，向上述cdna加入ddh2o稀释，得到cdna浓度为1000ng/μl的模板溶液。(6)以步骤(5)得到的模板溶液为模板进行实时定量pcr检测，得到对照组中vegf-c基因的相对表达量(以36b4基因为内参基因)。鉴定vegf-c基因的引物和内参的引物同步骤1中(7)。以孕激素处理试验组中处理时间为0h的vegf-c基因的相对表达量作为1，孕激素处理试验组中其它处理时间的vegf-c的相对表达量见图2。以对照组中加入含0.1％(v/v)fbs的dmem培养基培养24h(即图2中的0h)的vegf-c基因的相对表达量作为1，对照组中其它培养时间的vegf-c基因的相对表达量见图2(培养26h即图2中的2h，培养28h即图2中的4h，培养30h即图2中的6h，培养32h即图2中的8h，培养34h即图2中的10h，培养36h即图2中的12h)。结果表明，孕激素处理试验组中vegf-c的mrna在每个时间点降解速度与对照组相比没有明显差别，vegf-c的mrna半衰期为2.5h。因此孕激素对vegf-c的mrna的稳定性基本无影响。二、孕激素对vegf-c启动子和/或5’utr活性的影响本发明的发明人采用报告基因荧光酶活性检测方法检测孕激素对vegf-c启动子和/或5’utr活性的影响。vegf-c启动子和5’utr的核苷酸序列如序列表中序列1所示。1、重组质粒的获得(1)重组质粒甲的构建人工合成序列表中序列1自5’末端起第1至1193位所示的双链dna分子1。将双链dna分子1插入pgl3basic载体的限制性内切酶mlui和xhoi之间，得到重组质粒甲。(2)重组质粒乙的构建人工合成序列表中序列1自5’末端起第1至1041位所示的双链dna分子2。将双链dna分子2插入pgl3basic载体的限制性内切酶mlui和xhoi之间，得到重组质粒乙。(3)重组质粒丙的构建人工合成序列表中序列1自5’末端起第1至949位所示的双链dna分子3。将双链dna分子3插入pgl3basic载体的限制性内切酶mlui和xhoi之间，得到重组质粒丙。(4)重组质粒丁的构建人工合成序列表中序列1自5’末端起第1至848位所示的双链dna分子4。将双链dna分子4插入pgl3basic载体的限制性内切酶mlui和xhoi之间，得到重组质粒丁。2、采用lipofectamine2000转染试剂将重组质粒(重组质粒甲、重组质粒乙、重组质粒丙或重组质粒丁)转染至ishikawa细胞。3、完成步骤2后6h，加入孕激素，得到处理体系。该处理体系中，孕激素的浓度为2×10－9m。将所述处理体系37℃处理30h，然后检测荧光酶活性。4、完成步骤2后6h，加入乙醇(与步骤3中的孕激素体积相同)，得到对照体系。将所述对照体系37℃处理30h，然后检测荧光酶活性。重组质粒丁转染至ishikawa细胞的荧光酶活性检测结果见图3。结果表明，转染重组质粒甲、重组质粒乙、重组质粒丙或重组质粒丁的ishikawa细胞的荧光酶活性明显受到孕激素的抑制。由此可见，孕激素通过抑制vegf-c启动子和/或5’utr的活性，下调vegf-c基因的表达。<110>常州大学<120>孕激素在抑制血管内皮生长因子表达中的应用<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>1732<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1ccgagccatgttctcaaccgcatacttcatgaacatggaaagctaacagtatggttaagg60ggggaaactggaactgtcatcttggggaataaaagggatatttagccaggagtaaagtta120gcttagggagaccatgataaatattttcaaaatatttgaaggactcagttgtggaagtga180gattagatttattgtgtaaaactccaggagtcaaaagcaatrgagagatagaaggaaayg240cytttcagcagtgttgctcatcaataaagggagtgaacagccacacagaatggaaggttc300cctgtcctttgagatatttaagccttcaagtaaattatgggtggggagtttcaaatctag360agttgaaccagataagaaagtctcttcttccggtaagatattatggacctataacatctg420tgtacttaaaagtagattgggagtgaaaggcagacttttgatgttctgtacactgttgaa480accccttagcgtggtcctctgtaacctgctcaccctgccccaaggaggcagctagccaat540gccaccagcccaacggaaaccccagtgcttttccaatggggaaatgcagtcacttttctt600tggatgctacacatcctttctggaatatgtctcacacacatctctctttatcaccccctt660tttcaagtaaaccaacttcttgcagaagctgacaatgtgtctctttactctccacgaaga720ttctggcccttctcttcacctgtcagaagtttaggattccaaagggatcattagcatcca780tcccaacagcctgcactgcatcctgagaactgcggttcttggatcatcaggcaactttca840actacacagaccaagggagagaggggacccctccgaggtcccatagggttctctgacata900gtgatgaccttttcttggaacttttacaacccccaggacatttccaaactttgagcaggg960cgctgggggccaggcgtgcgggagggaggataagaactcgggagtggccgaggataaagc1020gggggctccctccaccccacggtgcccagtttctccccgctgcacgtggtccagggtggt1080cgcatcacctctaaagccggtcccgccaaccgccagccccgggactgaacttgcccctcc1140ggccgcccgctccccgcaggggacaggggcggggagggagagatccagaggggggcyggg1200ggaggtggggccgccggggaggaggcgagggaaacggggagctccagggagacggcttcc1260gagggagagtgagaggggagggcagcccgggctcggcacgctccctccctcggccgcttt1320ctctcacataagcgcaggcagagggcgcgtcagtcatgccctgcccctgcgcccgccgcc1380gccgccgccgccgctcagcccggcgcgctctggaggatcctgcgccgcggcgctcccggg1440ccccgccgccgccagccgccccgccgccctcctcccgcccccggcaccgccgccagcgcc1500cccgccgcagcgcccgcggcccggctcctctcacttcggggaaggggagggaggaggggg1560acgagggctctggcgggtttggaggggctgaacatcgcggggtgttctggtgtcccccgc1620cccgcctctccaaaaagctacaccgacgcggaccgcggcggcgtcctccctcgccctcgc1680ttcacctcgcgggctccgaatgcggggagctcggatgtccggtttcctgtga1732<210>2<211>2145<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2atgggcagctgtgacctatttgctgcctgcaaacagagcagtgttccatggctaccccca60gacaatagccaggaggcaggctgggaacgcgtaggctgtcgttgccctgattacgtgact120ctccatggtggtctcaggatgactctgccggtggtaacaccaaacactactgacacaaat180gactgttgtcgtatggtcatgatgccccctactctgtcccttgttaaactctgcccccct240ccctatcccactctccggaccttagttcccatcgcatcgtgcatgatcagcttttattcg300tctggatgctttcagttaatggcgcaagaacgtctgctggaagagcagaggcttgccttg360cacacccgctccacggccgctatgtcctcatcacgttcccgccgccaagcggcagatgaa420gggtcaagccgaaatgtcttccaaaggagggaagtcgtggaaaataactacctggtttct480aaagaacaaatatttgaaggtcctcatcatctcttggattactccagctgtgccctgcct540ggcatcccgcccaagctgcttggcaccacctatccatacaaagtcatcgccctaaagagc600attacctccactgatgaaacagatatagcaactgcactgtgtctccagacaattgacttg660gacatagtggacagcattcagagtcgcataagaaggcactatcaacagtactcttggaaa720actagaaatttaaaggcagaatggtccataatcccttacaagaagtccctcagcataact780atgtctcagaatcttcaggttttaggatcttcctcagtgaacggtataacagatcttcac840actgaggaggcctcagggcccctggccatgtctgaggttctcacttggttgcctcttaag900atcctgatgactacgtgtcaggctttaccagctgtttctgtggatctgtgttgtggttca960atcgtcacactttgtaactatgatgttgagcatcttttcatgaacctcttagccactgga1020atactgtttttggcttatgcaggcagagatctggaggagcagttgcgttcagtgtccagt1080gtagacgagctcatgaccgtactctacccagaatattggaaaatgtacaagtgtcagtta1140agaaaaggaggctggcatcatgctagagagcaacccaacgtcaatacgaggacagaagag1200actataaaattcgctgcagcccattataatgcagagatcttgaaaagtattgataatgag1260tggagaaagactcaatgcatgccacgtgaggtgtgtatagatgtggggaaggagtttgga1320gcagccacaaacaccttctttaaacctccatgtgtgtccgtctacagatgtggaggctgc1380tgcaacagcgaggggctacagtgcatgaacaccagcacaagctacctcagcaagacgttg1440tttgaaattacagtgcctctctctcaaggccccaaaccagtaaccatcagttttgccaac1500cacacctcctgccggtgcatgtctaagctggatgtttacagacaagtccattcaattatt1560agacgttccctgccagcaacactaccgcagtgtcaggctgcaaacaagacttgccccaca1620aattatatgtggaataatcatatctgcagatgcctggctcaacaggattttattttttcc1680tctaacactggagatgattctccaggtgaataccatgacatctgtgggccccacaaagaa1740ctggatgaagaaacctgtcaatgtgtctgcaaaggggg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