ZIF-8涂覆四氧化三铁纳米粒子材料及其制备方法和应用与流程

本发明涉及无机纳米材料和分子影像学技术领域，尤其是涉及一种zif-8涂覆四氧化三铁纳米粒子材料及其制备方法和应用。

背景技术：

磁共振成像(mri)是在射频波激发的强磁场中，通过检测(水)质子自旋的弛豫信号，并利用磁梯度进行体内水质子空间分辨的最强大的诊断工具之一。由于其具有无创性、亚毫米空间分辨率、高解剖学对比度和优异的软组织分化能力而受到广泛关注。然而，mri所得到的图像往往不足以区分正常组织和损伤，因此需要通过增强病灶部位与背景的对比度的造影剂以提高mri的灵敏度。造影剂可分为两大类，即阳性造影剂(或t1加权造影剂)和阴性造影剂(或t2加权造影剂)。阳性造影剂可以缩短质子的纵向弛豫时间(t1)，从而在t1加权mri中产生更明亮的图像(正增强)；而阴性造影剂可以缩短质子的横向弛豫时间(t2)，在t2加权mri中产生更暗的图像(负增强)。

而t2造影剂的广泛临床应用受到几个缺点的阻碍：首先，t2加权mri中的暗信号可能会误导临床诊断，因为用t2造影剂标记的病灶和肿瘤可能与其他阴影区域如出血，钙化或金属沉积混淆。其次，t2造影剂的高磁矩引起局部磁场的扰动，引起所谓的“起霜效应”。这种效果会夸大标记区域的大小并模糊图像。由于这些原因，t1造影剂比t2造影剂更适合精确的高分辨率成像。

由于t1对比效应是由水质子与造影剂电子自旋之间的相互作用引起的，因此t1造影剂需要包含gd³⁺、mn²⁺和fe³⁺等大量不成对电子的顺磁性化合物。钆配合物如gd-dota在其gd³⁺核心中具有7个不成对电子，被广泛用作t1造影剂。但是，钆配合物在临床上有几个缺点。由于通过尿液快速排泄，复合物通常具有较短的循环时间，这不利于需要长扫描时间的高分辨率成像。另外，从钆配合物中浸出的游离钆离子是非常有毒的，在肾功能受损的患者中可能会导致肾源性全身纤维化(nsf)。

为了克服基于gd复合物的t1mri造影剂的这些缺点，近年来，开发了含有gd³⁺或mn²⁺离子的纳米颗粒t1造影剂。然而，这些基于纳米粒子的t1造影剂仍然存在毒性问题。因此，为了早期诊断疾病，需要进一步优化造影剂。特别是，应开发新型无毒的t1mri造影剂，以克服t2造影剂的负面对比效应的缺点，并克服基于gd的t1剂的毒性。

相比于钆或锰基材料，铁基材料具有更高的生物相容性，因为人体血液中富含铁，它们大多作为铁蛋白存储在体内。具有5个不成对电子的铁(fe³⁺)离子增加了r1值，但由于固有的高磁矩导致氧化铁纳米粒子的高r2阻止了它们被用作t1造影剂。这个问题可以通过减小磁性纳米颗粒的尺寸得到解决。磁性纳米粒子的磁矩随着尺寸减小而迅速减小，这是由于体积磁各向异性和纳米粒子表面上的自旋失调引起的。小尺寸氧化铁纳米粒子可以做t1造影剂，因为纳米粒子可以通过其5个未成对电子的大表面积增强t1效应，通过它们的小磁矩抑制t2效应，并且具有低毒性。已经表明，可以使用小尺寸的氧化铁纳米颗粒例如超小型氧化铁颗粒作为t1造影剂。

沸石咪唑骨架(zifs)是被称为金属有机骨架(mofs)的新型混合有机-无机材料的成员。其中，对zif-8的研究较为广泛。zif-8由2-甲基咪唑和锌离子形成，锌离子是生理系统的组成部分，其中锌是生物学中第二丰富的过渡金属，咪唑基团与氨基酸组氨酸是不可分割的，因此zif-8无毒且具有生物相容性。研究表明，zif-8具有优异的水和氢氧化钠水溶液的稳定性，而由于质子化的作用，锌离子和咪唑离子之间的配位在ph5.0-6.0解离在酸性溶液中快速分解，这使得ph响应纳米粒子释放。已有研究表明，肿瘤内高表达的gsh和h⁺(即来自gsh的离子化h⁺)对zif-8的降解，纳米粒子的释放也作出贡献。

基于此，我们设计只在肿瘤区域有更亮的图像，而正常组织没有亮图像，进而提高对肿瘤的诊断。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种zif-8涂覆四氧化三铁纳米粒子材料及其制备方法和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种zif-8涂覆四氧化三铁纳米粒子材料，通过将具有t1加权mri效果的fe3o4纳米粒子包埋于zif-8中，得到具有t2加权mri效果的zif-8涂覆四氧化三铁纳米粒子材料(fe3o4@zif-8)。

优选地，该材料的粒径为100～130nm，fe3o4纳米粒子的粒径为4～8nm。

所述的zif-8涂覆四氧化三铁纳米粒子材料的制备方法，包括以下步骤

(1)将水溶性fe3o4纳米粒子溶于水中，得到fe3o4水溶液，

(2)将2-甲基咪唑和聚乙烯吡咯烷酮分散于fe3o4水溶液中，溶解，并于室温下搅拌，得到混合溶液；

(3)将六水合硝酸锌水溶液快速倒入混合溶液中，继续搅拌；

(4)离心分离、洗涤，收集颗粒物，得到zif-8涂覆四氧化三铁纳米粒子材料。

优选地：

所述的2-甲基咪唑、聚乙烯吡咯烷酮、水溶性fe3o4纳米粒子和六水合硝酸锌的用量之比为400～450mg:10～30mg:5～15mg:20～30mg。

其中2-甲基咪唑(配体)和六水合硝酸锌(中心离子)通过配位键结合形成zif-8；fe3o4(造影剂)表面的羧酸基团可以和六水合硝酸锌配位结合；聚乙烯吡咯烷酮可以改善材料的水溶性。

优选地：

步骤(2)和步骤(3)中搅拌的转速为600～800rpm；

步骤(4)中的离心分离是指在5000～8000rpm的转速下离心处理3～8min，并分散在水中，离心分离操作进行多次；

步骤(4)中的洗涤采用二次水洗涤多次。

优选地，所述的水溶性fe3o4纳米粒子通过配体交换法制备得到，包括以下步骤：

(a)将油溶性fe3o4分散在四氢呋喃中，加入dhca(3-(3,4-二羟基苯基)丙酸)，常温下于摇床中进行反应；

(b)离心分离，洗涤，得到水溶性fe3o4纳米粒子，并用水溶解备用。

优选地：

步骤(a)中所述的油溶性fe3o4、四氢呋喃和dhca的用量之比为10～30mg:15～35ml:80～120mg；

步骤(a)中在摇床中反应的时间为1～4h；

步骤(b)中的离心分离是指加入naoh溶液后，在5000～10000rpm的转速下处理5～15min，naoh溶液的使用量与油溶性fe3o4的使用量之比为100～1000μm:20～30mg；弃去上清液后，再加入naoh溶液、水(作为分散机)和乙醇(作为沉淀剂)，超声溶解，在10000～20000rpm的转速下处理15～40min后弃去上清液。

进一步优选地，所述的naoh溶液的浓度为0.5m。

优选地，所述的油溶性fe3o4通过高温热解法制备得到，包括以下步骤：

(i)氮气氛围下，将油胺缓慢加热到高温；

(ii)将乙酰丙酮铁、n-甲基吡咯烷酮和油胺的混合溶液注入，之后持续加热，停止加热后继续搅拌，直至冷却至室温；

(iii)离心分离，得到所述的油溶性fe3o4，并用有机溶剂溶解备用。

优选地：

步骤(i)中的高温为300℃；

步骤(ii)中的混合溶液中乙酰丙酮铁、n-甲基吡咯烷酮和油胺与步骤(i)中的油胺的用量之比为1～4mmol:2～6ml:3～8ml:20～40ml；

步骤(iii)中离心分离是指加入乙醇，在7000～14000rpm的转速下处理5～15min，弃去上清液；离心分离操作进行多次，两次离心分离操作之间用有机溶剂对固体物质进行溶解；

所述的有机溶剂为正己烷。

上述zif-8涂覆四氧化三铁纳米粒子材料在制备肿瘤磁共振照影剂方面的应用。

优选地，上述zif-8涂覆四氧化三铁纳米粒子材料在制备利用肿瘤微环境的至少一个条件触发的肿瘤磁共振造影剂方面的应用。

优选地，该材料到达肿瘤区域后，肿瘤微环境的至少一个条件触发zif-8解体，释放出具有t1加权mri效果的fe3o4纳米粒子，在肿瘤内实现从横向弛豫时间t2加权对比的“暗”信号到纵向弛豫时间t1加权对比的“亮”信号的切换。提高了对肿瘤的诊断。

优选地，所述的肿瘤微环境的条件包括肿瘤微环境的ph条件和/或谷胱甘肽条件。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明通过对fe3o4进行配体交换，改变其水溶性，同时用一种金属有机框架(zif-8)涂覆四氧化三铁(fe3o4)纳米粒子，从而得到一种能够提高肿瘤诊断的试剂。

(2)本发明制备的fe3o4@zif-8，具有良好的t2成像效果，可以作为mr成像造影剂，zif-8对酸和gsh敏感，在肿瘤内zif-8降解，释放具有良好的t1成像效果的fe3o4，是一种提高肿瘤诊断的纳米材料。

(3)本发明的合成过程简单，成本低廉。

(4)可利用肿瘤微环境来提高对早期肿瘤的诊断。

附图说明

图1为制备的水溶性四氧化三铁纳米粒子(a)及表面涂覆金属有机框架的四氧化三铁(b)的透射电子显微镜图。

图2为水溶性四氧化三铁纳米粒子及表面涂覆金属有机框架的四氧化三铁的粒径(a)和zeta电位图(b)。

图3为表面涂覆金属有机框架的四氧化三铁对癌细胞(4t1)(a)和人脐静脉内皮细胞(huvec)(b)的细胞毒性图。

图4为表面涂覆金属有机框架的四氧化三铁降解过程(a)5mmgsh，(b)ph5.0，(c)ph5.05mmgsh的粒径变化图。

图5为表面涂覆金属有机框架的四氧化三铁降解前(a，b)和后(c，d)的透射电子显微镜图。

图6为表面涂覆金属有机框架的四氧化三铁降解前(a)和降解后(b)的核磁共振成像图。

具体实施方式

一种zif-8涂覆四氧化三铁纳米粒子材料，通过将具有t1加权mri效果的fe3o4纳米粒子包埋于zif-8中，得到具有t2加权mri效果的zif-8涂覆四氧化三铁纳米粒子材料。

优选地，该材料的粒径为100～130nm，fe3o4纳米粒子的粒径为4～8nm。

所述的zif-8涂覆四氧化三铁纳米粒子材料的制备方法，包括以下步骤

(1)将水溶性fe3o4纳米粒子溶于水中，得到fe3o4水溶液，

(2)将2-甲基咪唑和聚乙烯吡咯烷酮分散于fe3o4水溶液中，溶解，并于室温下搅拌，得到混合溶液；

(3)将六水合硝酸锌水溶液快速倒入混合溶液中，继续搅拌；

(4)离心分离、洗涤，收集颗粒物，得到zif-8涂覆四氧化三铁纳米粒子材料。

优选地：

所述的2-甲基咪唑、聚乙烯吡咯烷酮、水溶性fe3o4纳米粒子和六水合硝酸锌的用量之比为400～450mg:10～30mg:5～15mg:20～30mg。

其中2-甲基咪唑(配体)和六水合硝酸锌(中心离子)通过配位键结合形成zif-8；fe3o4(造影剂)表面的羧酸基团可以和六水合硝酸锌配位结合；聚乙烯吡咯烷酮可以改善材料的水溶性。

优选地：

步骤(2)和步骤(3)中搅拌的转速为600～800rpm；

步骤(4)中的离心分离是指在5000～8000rpm的转速下离心处理3～8min，并分散在水中，离心分离操作进行多次；

步骤(4)中的洗涤采用二次水洗涤多次。

优选地，所述的水溶性fe3o4纳米粒子通过配体交换法制备得到，包括以下步骤：

(a)将油溶性fe3o4分散在四氢呋喃中，加入dhca(3-(3,4-二羟基苯基)丙酸)，常温下于摇床中进行反应；

(b)离心分离，洗涤，得到水溶性fe3o4纳米粒子，并用水溶解备用。

优选地：

步骤(a)中所述的油溶性fe3o4、四氢呋喃和dhca的用量之比为10～30mg:15～35ml:80～120mg；

步骤(a)中在摇床中反应的时间为1～4h；

步骤(b)中的离心分离是指加入naoh溶液后，在5000～10000rpm的转速下处理5～15min，naoh溶液的使用量与油溶性fe3o4的使用量之比为100～1000μm:20～30mg；弃去上清液后，再加入naoh溶液、水(作为分散机)和乙醇(作为沉淀剂)，超声溶解，在10000～20000rpm的转速下处理15～40min后弃去上清液。

进一步优选地，所述的naoh溶液的浓度为05m。

优选地，所述的油溶性fe3o4通过高温热解法制备得到，包括以下步骤：

(i)氮气氛围下，将油胺缓慢加热到高温；

(ii)将乙酰丙酮铁、n-甲基吡咯烷酮和油胺的混合溶液注入，之后持续加热，停止加热后继续搅拌，直至冷却至室温；

(iii)离心分离，得到所述的油溶性fe3o4，并用有机溶剂溶解备用。

优选地：

步骤(i)中的高温为300℃；

步骤(ii)中的混合溶液中乙酰丙酮铁、n-甲基吡咯烷酮和油胺与步骤(i)中的油胺的用量之比为1～4mmol:2～6ml:3～8ml:20～40ml；

步骤(iii)中离心分离是指加入乙醇，在7000～14000rpm的转速下处理5～15min，弃去上清液；离心分离操作进行多次，两次离心分离操作之间用有机溶剂对固体物质进行溶解；

所述的有机溶剂为正己烷。

上述zif-8涂覆四氧化三铁纳米粒子材料在制备肿瘤磁共振照影剂方面的应用。

优选地，上述zif-8涂覆四氧化三铁纳米粒子材料在制备利用肿瘤微环境的至少一个条件触发的肿瘤磁共振造影剂方面的应用。

优选地，该材料到达肿瘤区域后，肿瘤微环境的至少一个条件触发zif-8解体，释放出具有t1加权mri效果的fe3o4纳米粒子，在肿瘤内实现从横向弛豫时间t2加权对比的“暗”信号到纵向弛豫时间t1加权对比的“亮”信号的切换。提高了对肿瘤的诊断。

优选地，所述的肿瘤微环境的条件包括肿瘤微环境的ph条件和/或谷胱甘肽条件。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种zif-8涂覆四氧化三铁纳米粒子材料，通过将具有t1加权mri效果的fe3o4纳米粒子包埋于zif-8中，得到具有t2加权mri效果的zif-8涂覆四氧化三铁纳米粒子材料。

本实施例的zif-8涂覆四氧化三铁纳米粒子材料制备方法如下：

(1)油溶性fe3o4的制备方法，其步骤如下：

首先，通过高温热解法制备油溶性四氧化三铁：在三颈瓶中，n2氛围下，将30ml油胺缓慢加热到300℃，再将1mmol乙酰丙酮铁，4mln-甲基吡咯烷酮和6ml油胺的混合溶液注入三颈瓶中，之后持续加热，停止加热后继续搅拌，直至冷却至室温。转移入离心管中，加入乙醇，10000r，10min，弃去上清液；用正己烷溶解，再加乙醇，12000r，8min，弃去上清液，用少量正己烷溶解，转移入样品瓶中备用。

水溶性fe3o4纳米粒子的制备方法，其步骤如下：

通过配体交换法制备水溶性四氧化三铁：取20mg油溶性四氧化三铁分散在28ml四氢呋喃(thf)中，再加100mgdhca，常温下，于摇床中反应2h。转移入离心管中，取600μl、0.5m的naoh溶液于上述离心管中，5000r，5min，弃去上清液；再加600μl、0.5m的naoh溶液、水和乙醇，超声溶解，20000r，28min，弃去上清液，加少量水溶解，转移入样品瓶中备用。

fe3o4@zif-8纳米粒子材料的制备方法，其步骤如下：

取431mg2-甲基咪唑，25mg聚乙烯吡咯烷酮分散在1.5mlfe3o4水溶液(浓度为5mg/ml)中，超声溶解。在室温，750rpm下搅拌，再将1.5ml六水合硝酸锌水溶液(含六水合硝酸锌0.1mmol)快速倒入上述混合溶液中，继续搅拌。转移入离心管，5000rpm,3min离心，分散在水中。再5000rpm,3min离心。用二次水洗涤多次，收集fe3o4@zif-8纳米粒子。

将该材料可以用于肿瘤磁共振照影，利用对肿瘤ph和gsh敏感的zif-8载体将具有t1成像效果的fe3o4包裹在zif-8中，得到具有t2成像效果的fe3o4@zif-8，到达肿瘤区域后，ph和gsh触发zif-8解体，释放出具有t1成像效果的fe3o4。在肿瘤内实现从横向弛豫时间t2加权对比度(包埋的氧化铁纳米粒子)的“暗”信号切换到纵向弛豫时间t1加权对比的“亮”信号(单个分散的氧化铁纳米粒子)，进而提高对肿瘤的诊断。

附图说明：

图1为制备水溶性四氧化三铁纳米粒子(图1a)及表面涂覆金属有机框架的四氧化三铁(fe3o4@zif-8)(图1b)的透射电子显微镜图。由粒径统计分析可知，fe3o4的平均粒径约为6nm，fe3o4@zif-8的平均直径约为110nm，还可以从图1(b)直观看出每个fe3o4@zif-8含有多个fe3o4纳米颗粒。

图2为不同纳米粒子的粒径及电位图。通过动态光散射(dls)测定的fe3o4和fe3o4@zif-8的平均流体动力学尺寸为约35.55和219.5nm，见图2(a)。该结果比tem测得的粒径大，可能是由于粒子表面的水合作用。粒径的变化初步认为是fe3o4@zif-8的成功合成。测定fe3o4@zif-8的ζ电位为-24.8mv。fe3o4@zif-8的负ζ电位是由于表面暴露的pvp和fe3o4-dhca，其ζ电位分别为-4.92和-41.2mv，见图2(b)。zif-8(ζ电位为27.6mv)是疏水骨架，fe3o4@zif-8的负ζ电位可以显着改善其水溶性。

图3为纳米粒子对癌细胞和人脐静脉内皮细胞的细胞毒性图。在进行体内试验之前，通过标准的甲基噻唑基四唑(mtt)试验用4t1(小鼠乳腺癌细胞系)细胞和人脐静脉内皮细胞系评估fe3o4@zif-8的体外细胞毒性，结果分别见图3(a)和图3(b)。如图3所示，孵育12小时后，不到15％的细胞死亡，fe3o4@zif-8的浓度高达100μg/ml，细胞存活率仍然保持在80％以上。用相同浓度的fe3o4@zif-8将时间延长至24小时。这些数据表明fe3o4@zif-8(小于100μg/ml)具有低细胞毒性，这也是纳米粒子作为mri造影剂的关键特征。

图4为表面涂覆金属有机框架的四氧化三铁降解过程的粒径变化图((a)5mmgsh，(b)ph5.0，(c)ph5.05mmgsh)。在5mmgsh、ph5.0、ph5.0和5mmgsh条件下，孵育5分钟后，散射信号的形状从初始的219nm变为约120nm。5小时后，它逐渐转变为约10nm，其接近母体亲水性fe3o4纳米颗粒的尺寸(6nm)，表明fe3o4@zif-8被分解以形成分散的fe3o4纳米颗粒。

图5为表面涂覆金属有机框架的四氧化三铁降解前后的透射电子显微镜图。将fe3o4@zif-8纳米晶体(图5(a)和(b))在ph5.0的pbs缓冲液中温育6小时，然后进行tem测量。仅存在fe3o4纳米颗粒，但没有发现直径约30-150nm的其他明显颗粒，如图5(c)和(d)所示，证明了zif-8的有效降解和fe3o4@zif-8的分解。

图6为表面涂覆金属有机框架的四氧化三铁降解前(a)和降解后(b)的核磁共振成像图。对降解前后的纳米粒子进行mri测试，由r2与r1的比值(18.46和5.58)可知，具有作为t2和t1加权成像的条件，如图6所示，随着铁浓度的增加，图像信号逐渐减弱和增强，即图像逐渐变暗和变亮。这也再次证明，fe3o4@zif-8的成功制备以及fe3o4@zif-8成功降解为有作为t1加权成像fe3o4纳米颗粒。

上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。