一种蚯蚓上清蛋白纳米胶原修复复合物的制备方法及应用与流程

本发明涉及动物纳米中药制备技术领域，特别是一种蚯蚓上清蛋白纳米胶原修复复合物的制备方法及应用。

背景技术：

在日常生活中，各种创伤事件时有发生。而伴随着社会经济的发展，由于交通事故，医疗创伤等原因造成的创伤病例也是在逐年攀增。当创伤发生之后，生物体会立刻启动自身缺损修复机制。一般认为伤口的修复分为三个不同的阶段：炎症期、增殖期和成熟期。从炎症期开始，受伤的组织即可开始胶原蛋白的分泌进行胶原沉积。大约三天之后，伤口修复进入增殖期，此时组织分泌iii型和v型胶原。此时的胶原为网状构型，已达到填充缺损部位和协助多种细胞迁移、定位的作用，从而达到促进伤口愈合的目的。当创伤进入成熟期后，组织分泌i型胶原，起到支撑拉伸的作用。因此组织的胶原蛋白含量直接影响到伤口愈合的速度。目前，已有的研究认为，蚯蚓组织中的蛋白成分可以促进创伤组织分泌各种类型的胶原蛋白，帮助创伤的修复作用。

然而，蛋白是一种在自然界中非常容易降解的生物大分子，非常不利于保存和运输。在实际医疗过程中也存在换药次数多(消耗量大)，经济成本高等问题。

技术实现要素：

本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种蚯蚓上清蛋白纳米胶原修复复合物的制备方法及应用。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

一种蚯蚓上清蛋白纳米胶原修复复合物的制备方法，包括以下步骤：

s1、制备蚯蚓上清蛋白：将鲜活的蚯蚓用0.9％的nacl溶液清洗多次，除去体表污物，将蚯蚓剪碎后用匀浆机破碎蚯蚓组织获得蚯蚓组织匀浆，然后按照蚯蚓组织匀浆质量的10％的比例加入蔗糖，搅拌均匀，静止30分钟后在4℃低速离心10分钟，取上清液即为蚯蚓上清蛋白，在上清液中加入1x的抗蛋白降解酶得到蚯蚓上清蛋白液，存贮备用；

s2、制备纳米介孔过渡系金属载体：称取1g分子量为58k的聚乙烯吡咯烷酮与十二烷基磺酸钠sds的混合液于三颈瓶中，加入聚乙烯吡咯烷酮与十二烷基磺酸钠sds的混合液总重量的2倍的去离子水在室温下搅拌2小时，而后逐滴加入浓度为20％的mxn金属盐溶液，其中m代表fe、ni、co、ca中的一种元素，x代表卤素、硝酸根、硫酸根中的一种，使最终金属盐浓度达到12.5mmol/l，搅拌均匀后加入0.4mmol的柠檬酸三钠，常温下将混合物超声3小时，再搅拌过夜；然后在水热反应釜中以195℃反应12小时，自然冷却；用乙醇和水的混合液冲洗沉淀4次后低温烘干，将烘干后的沉淀转移至氮气氛围中，然后以5℃/min的加热速率升温至600℃，维持2小时后自然冷却；再将冷却后的产物在空气中加热至700℃煅烧2小时，自然冷却后收集产物，低温烘干即得纳米介孔过渡系金属载体，备用；

s3、制备蚯蚓上清蛋白纳米胶原修复复合物：将2g制备好的纳米介孔过渡系金属载体与6mg以蛋白质量计的蚯蚓上清蛋白液混合，在氮气氛围中搅拌36小时，而后加入5g聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga，搅拌24小时，低温干燥，制备得到蚯蚓上清蛋白纳米胶原修复复合物。

优选地，所述步骤s1中的蚯蚓选用赤子爱胜蚓。

优选地，所述步骤s2中乙醇和水的混合液中乙醇和水的体积比为1:1。

优选地，所述步骤s3中的聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga由50％乳酸和50％羟基乙酸组成。

优选地，步骤s3中纳米介孔过渡系金属载体与蚯蚓上清蛋白液混合后的混合液的ph为7.0-7.8。

另外，本发明还提供一种蚯蚓上清蛋白纳米胶原修复复合物的应用，所述蚯蚓上清蛋白纳米胶原修复复合物应用于动物皮肤组织的胶原修复中。

与现有技术相比，本发明将有效蛋白成分以吸附力的方式接入到过渡系金属介孔纳米材料中，并且用plga来降低有效成分与空气接触的机会，保存药效的同时还具备了增强生物相容性，减小毒性的作用；从而制备出了一种具有缓释、高效，经济且生物相容的医用药物制剂，以达到促进胶原修复的目的。

附图说明

图1为本发明实施例1中的fe纳米介孔过渡系金属载体的x-ray粉末衍射图。

图2为本发明实施例2中的胶原组织分布图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，在此发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例1

s1、制备蚯蚓上清蛋白：将鲜活的赤子爱胜蚓用0.9％的nacl溶液清洗多次，除去体表污物，将蚯蚓剪碎后用匀浆机破碎蚯蚓组织获得蚯蚓组织匀浆，然后按照蚯蚓组织匀浆质量的10％的比例加入蔗糖，搅拌均匀，静止30分钟后在4℃低速离心10分钟，取上清液即为蚯蚓上清蛋白，取蚯蚓上清蛋白采用bradford法(该方法为生化中的一个经典教科书的测试方法，因此本实施例不在赘述，主要为了测定蛋白质浓度，以便s3中通过蛋白浓度换算蛋白质量)在20摄氏度下测定蛋白质浓度后在上清液中加入1x的抗蛋白降解酶得到蚯蚓上清蛋白液，然后加入浓度为0.02％的nan3作为防腐剂，存贮备用；

s2、制备纳米介孔过渡系金属载体：称取1g分子量为58k的聚乙烯吡咯烷酮与十二烷基磺酸钠sds的混合液于三颈瓶中，加入聚乙烯吡咯烷酮与十二烷基磺酸钠sds的混合液总重量的2倍的去离子水在室温下搅拌2小时，而后逐滴加入浓度为20％的硫酸钙溶液，使最终金属盐浓度达到12.5mmol/l，搅拌均匀后加入0.4mmol的柠檬酸三钠，常温下将混合物超声3小时，再搅拌过夜；然后在水热反应釜中以195℃反应12小时，自然冷却；用体积比为1:1乙醇和水的混合液冲洗沉淀4次后低温烘干，将烘干后的沉淀转移至氮气氛围中，然后以5℃/min的加热速率升温至600℃，维持2小时后自然冷却；再将冷却后的产物在空气中加热至700℃煅烧2小时，自然冷却后收集产物，低温烘干即得纳米介孔过渡系金属载体，备用；

s3、制备蚯蚓上清蛋白纳米胶原修复复合物：将2g制备好的纳米介孔过渡系金属载体与6mg以蛋白质量计的蚯蚓上清蛋白液混合，调节混合液的ph为7.8，在氮气分为中搅拌36小时，而后加入5g由50％乳酸和50％羟基乙酸组成的聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga，搅拌24小时，低温干燥，制备得到蚯蚓上清蛋白纳米胶原修复复合物。

实施例2

s1、制备蚯蚓上清蛋白：将鲜活的赤子爱胜蚓用0.9％的nacl溶液清洗多次，除去体表污物，将蚯蚓剪碎后用匀浆机破碎蚯蚓组织获得蚯蚓组织匀浆，然后按照蚯蚓组织匀浆质量的10％的比例加入蔗糖，搅拌均匀，静止30分钟后在4℃低速离心10分钟，取上清液即为蚯蚓上清蛋白，取蚯蚓上清蛋白采用bradford法在20摄氏度下测定蛋白质浓度后在上清液中加入1x的抗蛋白降解酶得到蚯蚓上清蛋白液，然后加入浓度为0.02％的nan3作为防腐剂，存贮备用；

s2、制备纳米介孔过渡系金属载体：称取1g分子量为58k的聚乙烯吡咯烷酮与十二烷基磺酸钠sds的混合液于三颈瓶中，加入聚乙烯吡咯烷酮与十二烷基磺酸钠sds的混合液总重量的2倍的去离子水在室温下搅拌2小时，而后逐滴加入浓度为20％的硝酸铁溶液，使最终金属盐浓度达到12.5mmol/l，搅拌均匀后加入0.4mmol的柠檬酸三钠，常温下将混合物超声3小时，再搅拌过夜；然后在水热反应釜中以195℃反应12小时，自然冷却；用体积比为1:1乙醇和水的混合液冲洗沉淀4次后低温烘干，将烘干后的沉淀转移至氮气氛围中，然后以5℃/min的加热速率升温至600℃，维持2小时后自然冷却；再将冷却后的产物在空气中加热至700℃煅烧2小时，自然冷却后收集产物，低温烘干即得纳米介孔过渡系金属载体，备用；

s3、制备蚯蚓上清蛋白纳米胶原修复复合物：将2g制备好的纳米介孔过渡系金属载体与6mg以蛋白质量计的蚯蚓上清蛋白液混合，调节混合液的ph为7.0，在氮气分为中搅拌36小时，而后加入5g由50％乳酸和50％羟基乙酸组成的聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga，搅拌24小时，低温干燥，制备得到蚯蚓上清蛋白纳米胶原修复复合物。

实施例3

s1、制备蚯蚓上清蛋白：将鲜活的赤子爱胜蚓用0.9％的nacl溶液清洗多次，除去体表污物，将蚯蚓剪碎后用匀浆机破碎蚯蚓组织获得蚯蚓组织匀浆，然后按照蚯蚓组织匀浆质量的10％的比例加入蔗糖，搅拌均匀，静止30分钟后在4℃低速离心10分钟，取上清液即为蚯蚓上清蛋白，取蚯蚓上清蛋白采用bradford法在20摄氏度下测定蛋白质浓度后在上清液中加入1x的抗蛋白降解酶得到蚯蚓上清蛋白液，然后加入浓度为0.02％的nan3作为防腐剂，存贮备用；

s2、制备纳米介孔过渡系金属载体：称取1g分子量为58k的聚乙烯吡咯烷酮与十二烷基磺酸钠sds的混合液于三颈瓶中，加入聚乙烯吡咯烷酮与十二烷基磺酸钠sds的混合液总重量的2倍的去离子水在室温下搅拌2小时，而后逐滴加入浓度为20％的溴化铁溶液，使最终金属盐浓度达到12.5mmol/l，搅拌均匀后加入0.4mmol的柠檬酸三钠，常温下将混合物超声3小时，再搅拌过夜；然后在水热反应釜中以195℃反应12小时，自然冷却；用体积比为1:1乙醇和水的混合液冲洗沉淀4次后低温烘干，将烘干后的沉淀转移至氮气氛围中，然后以5℃/min的加热速率升温至600℃，维持2小时后自然冷却；再将冷却后的产物在空气中加热至700℃煅烧2小时，自然冷却后收集产物，低温烘干即得纳米介孔过渡系金属载体，备用；

s3、制备蚯蚓上清蛋白纳米胶原修复复合物：将2g制备好的纳米介孔过渡系金属载体与6mg以蛋白质量计的蚯蚓上清蛋白液混合，调节混合液的ph为7.5，在氮气分为中搅拌36小时，而后加入5g由50％乳酸和50％羟基乙酸组成的聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga，搅拌24小时，低温干燥，制备得到蚯蚓上清蛋白纳米胶原修复复合物。

图1为本发明实施例3中的fe纳米介孔过渡系金属载体的x-ray粉末衍射图，从图中看出：在2θ＝18.86°,31.32°,36.74°,44.85°,55.87°,59.48°,65.26°均出现明显的特征峰值，经过与标准物质pdf卡片对比，可以认定我们成功制备出来的fe纳米介孔材料的主要成分是fe2o3，符合我们的预期结果。

验证实例

将实施例1-3中任一制备的蚯蚓上清蛋白纳米胶原修复复合物用于动物创伤愈合，验证其对动物创伤愈合的效果。

使用5周龄的balb/c小鼠进行试验，将小鼠适应性饲养1周后，分2组进行试验。2组分别为空白对照组和复合物组，试验步骤如下：

1)将小鼠置于无菌单上，采用俯卧位，利用异氟烷为麻醉剂进行深度呼吸麻醉；

2)对小鼠进行机械脱毛，用碘伏消毒后使用无菌眼科剪刀在小鼠背部做一个圆形的切口(直径1.5cm)，造成开放性创伤模型，而后单笼继续饲养。饲养环境温度为25摄氏度；

3)依据创伤面积对复合物组小鼠伤口进行涂药，用药量为60mg/cm²(以复合物质量计算)，空白对照组仅涂抹生理盐水；

4)正常饲养5天后用过度麻醉法处死小鼠，取伤口组织样品，进行masson染色法实验，观察胶原修复情况。

研究结果证明，涂抹复合物小鼠组的细胞外胶原蛋白的沉积情况优于空白对照组。图2a为空白对照组细胞外胶原蛋白的沉积情况，图2b为涂抹了复合物后细胞外胶原蛋白的沉积情况。我们发现，b中的细胞外胶原蛋白的几乎已经填充满了整个组织，并且出现了在组织中起到支撑作用的比较规整的i型胶原结构，而在a中胶原尚在对组织结构进行填充，而且此时的胶原结构尚不规整，主要呈现出iii型胶原和v型胶原，尚处于修复的增殖期。说明复合物会加速对缺损组织的细胞外胶原蛋白的修复。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。