一种前列腺素E1甲酯注射用冻干制剂及制备和应用的制作方法

本发明涉及医药领域，具体的说，本发明涉及一种前列腺素e1甲酯注射用冻干制剂及制备和应用。

背景技术：

前列腺素e1(pge1)为天然内源性血管舒张药，人体细胞均能合成，是调节细胞功能的重要物质，在体内不积累，不产生耐受性，且无毒、无损害性副作用，治疗效果确切，优于外源性药物。pge1生理活性极强，具有广泛的药理活性，临床上可应用于心脑血管疾病、糖尿病并发症、呼吸系统疾病、肺动脉高压、肝肾综合征(hrs)、肝衰竭、肾病等，研究发现前列腺素e1不仅有扩张血管、减轻心脏负荷的作用,同时有排钠、利尿、强心、改善冠状循环、保护心肌、改善微循环等功效。

但目前市售常见的前列腺素e1脂肪乳注射液本身也存在几个明显的缺点：化学稳定性差，高温灭菌致使前列腺素e1含量有所降低，而降解产物pga1含量明显升高，且产品贮存条件苛刻(0～5℃)，效期短仅有1年；由于前列腺素e1本身是致炎物质，临床应用与人体时具有强烈的疼痛感，引起静脉炎，限制了本品的推广。

针对上述缺点，重庆药友开发了前列腺素e1冻干乳剂(zl201010168597.2)—优帝尔，该上市产品通过过滤除菌避免了高温灭菌带来的含量损失，并克服了前列腺素e1在含水制剂中稳定性差的缺点，延长了效期，但其处方中采用环糊精作为冻干保护剂，由于环糊精作为注射用辅料存在一定的安全风险，尤其是β-环糊精注射给药会引起明显的肾毒性、溶血以及注射部位坏死，制剂安全隐患大，并且注射疼痛的问题并没有得到解决(优帝尔说明书)。

前列腺素e1烷酯目前被认为是前列腺素e1的前药。例如美国专利us5681850公开了前列腺素e1烷酯(c1-4)用于治疗阳痿，专利中认为前列腺素e1烷酯通过增强脂溶性可以更好地透过皮肤被吸收，随后被水解酶分解成前列腺素e1起效，属于前药；美国专利us6673841公开了前列腺素e1烷酯(c1-5)外用制剂，制剂包含作为前药的前列腺素e1烷酯，油性载体，皮肤渗透增强剂以及抗炎剂。

然而发明人在研究中意外发现，前列腺素e1甲酯本身具有很强的生物活性，具有良好的成药前景。美国专利us4849451中公开了前列地尔甲酯的脂肪乳制剂，但我们在研究过程中依据其实施例制备获得的前列地尔甲酯的脂肪乳，在使用美国药典关于乳滴粒径测定的新方法-光阻法(原常用动态光散射法无法准确测定5um以上大粒径粒子的数量)进行测定后发现其大粒径(>5um)乳滴明显较多，不符合乳滴粒径的要求，大乳滴(>5um)可堵塞毛细血管，引起栓塞，具有较大的安全隐患，美国曾发生注射脂肪乳大粒子导致病人死亡的医疗事故，调查研究证明为乳剂中存在大于5um乳粒引起，因此于2004年美国药典制定了测定乳剂大粒径的检测方法和标准，鉴于现有产品存在的缺点和不足，本发明旨在提供一种新型的，稳定性好，安全风险小，药效更优的前列腺素e1甲酯产品。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种前列腺素e1甲酯注射用冻干制剂；

本发明的另一目的在于提供一种前列腺素e1甲酯注射用冻干制剂的制备方法；

本发明的再一目的在于提供所述的制备方法制备得到的前列腺素e1甲酯注射用冻干制剂；

本发明的再一目的在于提供所述的前列腺素e1甲酯注射用冻干制剂的应用。

为达上述目的，一方面，本发明提供了一种前列腺素e1甲酯注射用冻干制剂，其中，所述冻干制剂包含如下重量份成分：前列腺素e1甲酯0.1-10份、注射用油500-4000份、乳化剂500-2000份、助乳化剂0-10份、冻干保护剂5000-50000份、以及甘油200-1500份。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述注射用油选自大豆油、中链油、橄榄油、茶油、玉米油或蓖麻油的一种或多种的混合。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述乳化剂选自蛋黄磷脂和/或大豆磷脂。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述助乳化剂选自油酸、棕榈酸、硬脂酸、亚麻酸、亚油酸和油酸钠中的一种或多种的混合。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述冻干保护剂选自乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇、葡萄糖和麦芽糖中的一种或多种的混合。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述冻干制剂包含如下重量份成分：前列腺素e1甲酯0.1-10份、注射用油500-4000份、乳化剂500-1500份、助乳化剂0-10份、冻干保护剂5000-20000、以及甘油200-1500份。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述冻干制剂在冻干前每100ml包含如下重量份成分：前列腺素e1甲酯0.1-10mg、大豆油0.5-4g、蛋黄磷脂0.5-1.5g、油酸钠0-0.01g、乳糖5-20g、以及甘油0.2-1.5g。

其中可以理解的是，本发明所述的“所述冻干制剂在冻干前每100ml包含如下重量份成分”中的“每100ml”是指在冻干前所配制的每100ml的溶液；即含有各组分的水溶液。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述冻干保护剂与前列腺素e1甲酯的重量比为20～500:0.01。

另一方面，本发明还提供了一种前列腺素e1甲酯注射用冻干制剂的制备方法，其中，所述方法包括以如下重量百分比成分为原料制备所述冻干制剂：前列腺素e1甲酯0.0001-0.01％、注射用油0.5-4％、乳化剂0.5-2％、助乳化剂0-0.01％、冻干保护剂5-50％、甘油0.2-1.5％、ph调节剂适量、以及余量的注射用水。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述注射用油选自大豆油、中链油、橄榄油、茶油、玉米油或蓖麻油的一种或多种的混合。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述乳化剂选自蛋黄磷脂和/或大豆磷脂。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述助乳化剂选自油酸、棕榈酸、硬脂酸、亚麻酸、亚油酸和油酸钠中的一种或多种的混合。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述冻干保护剂选自乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇、葡萄糖和麦芽糖中的一种或多种的混合。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述方法包括以如下重量百分比成分为原料制备所述冻干制剂：前列腺素e1甲酯0.0001-0.01％、注射用油0.5-4％、乳化剂0.5-1.5％、助乳化剂0-0.01％、冻干保护剂5-20％、甘油0.2-1.5％、ph调节剂适量、以及余量的注射用水。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述方法包括以如下重量份成分为原料制备所述冻干制剂：前列腺素e1甲酯0.1-10份、大豆油500-4000份、蛋黄磷脂500-1500、油酸钠0-10份、乳糖5000-20000份、甘油20-1500份、柠檬酸钠或盐酸适量、以及以原料总重量为100×10³份计的余量的注射用水。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述ph调节剂用量是在用注射用水定容至全量配制成混合溶液后，将混合溶液ph调至4.5～6.5。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述方法包括如下步骤：

a.将前列腺素e1甲酯和乳化剂均匀分散于油性溶剂中作为油相；

b.将渗透压调节剂和冻干保护剂溶于适量注射用水中，作为水相；

c.将助乳化剂溶于油相或水相；

d.将油相在搅拌的条件下加入水相，或水相在搅拌的条件下加入油相中，剪切获得初乳；

e.将初乳均质得到均匀的乳状液，然后用注射用水定容至全量，用ph调节剂将ph调至4.5～6.5；

f.将获得的乳状液添加冻干保护剂搅拌溶解，过滤除菌、分装、冻干、封口，获得冻干剂。

根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤d是在20℃-50℃的恒温条件下剪切获得初乳。

根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤f的冻干过程包括-50℃至-35℃下预冻100-200分钟，然后在-25℃至-15℃下，以70-90mtorr抽真空420-540分钟，再在5℃至15℃下，以50-70mtorr抽真空240-360分钟，然后在35℃至45℃下，以35-45mtorr抽真空300-420分钟。

根据本发明一些具体实施方案，其中，步骤f的冻干过程包括-40℃下预冻150分钟，然后在-20℃下，以80mtorr抽真空480分钟，再在10℃下，以60mtorr抽真空300分钟，然后在40℃下，以40mtorr抽真空360分钟。

再一方面，本发明还提供了本发明所述的制备方法制备得到的前列腺素e1甲酯注射用冻干制剂。

再一方面，本发明还提供了本发明所述的前列腺素e1甲酯注射用冻干制剂在制备扩血管药物中的应用、冠心病、心绞痛、心力衰竭、肺心病、脑梗死、羊水栓塞、或硬皮病)。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述扩血管药物用于治疗如下疾病：微循环障碍。

根据本发明一些具体实施方案，其中，所述微循环障碍由如下病症引起：血栓闭塞性脉管炎、闭塞性动脉硬化症、糖尿病、冻伤、烧伤或褥疮。

发明人在在研究中意外发现，前列腺素e1甲酯本身具有很强的生物活性，抗凝以及扩血管活性方面都优于前列腺素e1，具有较好的药物开发潜力，发明人通过进一步的制剂研究，选择冻干剂作为前列腺素e1甲酯的制剂形式，并意外发现本发明制备的前列腺素e1甲酯冻干剂相比较现有制剂具有以下显著特点：

1.本发明前列腺素e1甲酯冻干剂在具体实验例中表现出了比优帝尔更优的药物活性和治疗效果。

2.本发明前列腺素e1甲酯冻干剂相比脂肪乳剂明显降低了乳滴的平均粒径和减少了大粒径乳滴比例，意外改善了药代动力学行为，从而提高药效。

2.显著降低了冻干剂复溶后的游离药物含量，尤其是按照说明书给药方式稀释10倍后游离药物没有明显增加，避免了血管注射刺激。

3.显著提高了制剂的稳定性，降低了对生产、运输和贮存条件的需求，延长了效期。

附图说明

图1为实验例1的化合物对adp诱导血小板聚集的抑制率与孵育时间关系曲线；

图2为实验例2的血管环的舒张效能与前列腺素e1浓度关系曲线；

图3为实验例3的肠系膜微动脉的管径与给药时间关系曲线；

图4为大鼠静脉注射40μg/kg前列地尔后前列地尔的血浆浓度-时间曲线。

具体实施方式

以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。

实施例1

本发明化合物1([(1r,2r,3r)-3-羟基-2-(s,e)-3-羟基-1-烯基)-5-氧代环戊基]庚酸甲酯)的合成(前列腺素e1甲酯)

原料pge1(63mg，0.18mmol)加入三口烧瓶中，然后加入配置好的1m的干燥thf/et2o溶液溶液搅拌溶解，冰浴条件下，向反应液中缓慢中滴加mei(26mg，1m)溶液，滴加完后加入koh(10mg，0.18mmol)和bu4nbr(6mg，0.018mmol)。反应搅拌1h后，加热至室温，tlc监控至反应结束。加水20ml猝灭反应，用etoac(10ml×3)萃取，合并有机相，用无水na2so4干燥并过滤。滤液减压浓缩，用柱层析纯化(洗脱液正己烷/ea＝1/1)，得到白色固体产物(24.8mg，38％收率)。

lcms(msfound:391.3[m+na]⁺。

¹hnmr(400mhz,dmso)(ppm):5.46(s,2h),5.01(s,1h),4.57(s,1h),3.88(s,2h),3.57(s,3h),1.9-2.3(m,5h)1.2-1.48(m,19h),0.85(s,3h)。

实施例2

化合物2([(1r,2r,3r)-3-羟基-2-(s,e)-3-羟基-1-烯基)-5-氧代环戊基]庚酸乙酯)的合成(前列腺素e1乙酯)

原料pge1(63mg，0.18mmol)加入三口烧瓶中，然后加入配置好的1m的干燥thf/et2o溶液溶液搅拌溶解，冰浴条件下，向反应液中缓慢中滴加etbr(20mg，1m)溶液，滴加完后加入koh(10mg，0.18mmol)和bu4nbr(6mg，0.018mmol)。反应搅拌1h后，加热至室温，tlc监控至反应结束。加水20ml猝灭反应，用etoac(10ml×3)萃取，合并有机相，用无水na2so4干燥并过滤。滤液减压浓缩，用柱层析纯化(洗脱液正己烷/ea＝1/1)，得到白色固体产物(20.5mg，29.8％收率)。

lcms(msfound:405[m+na]⁺。

¹hnmr(400mhz,dmso)(ppm):5.46(s,2h),5.01(s,1h),4.57(s,1h),3.88(s,2h),3.57(s,3h),1.9-2.3(m,7h)1.2-1.48(m,19h),0.85(s,3h)。

不同主药含量的前列腺素e1甲酯冻干剂

实施例3

制备工艺如下：

油相：称取大豆油2g，加入蛋黄磷脂0.5g，前列腺素e1甲酯0.5mg，50℃下剪切至溶解；

水相：称取注射用水90g，加入甘油0.75g，乳糖12.5g，油酸钠0.01g，剪切混匀，0.1m柠檬酸钠调节ph到6.5，再加入2g磷脂，继续剪切10min；

将油相缓慢加入到水相，继续在50℃下剪切10min，得到初乳，加水至100ml；

将初乳过均质机，850bar压力下，均质8次；

将均质后的乳剂进行无菌过滤，分装、-40℃下预冻150分钟，然后-20℃，80mtorr抽真空480分钟，10℃，60mtorr抽真空300分钟，40℃，40mtorr抽真空360分钟，抽真空下压盖，即得冻干粉针剂。

实施例4

制备工艺同实施例3

实施例5

制备工艺同实施例3

不同注射液用油、磷脂及含量的前列腺素e1甲酯冻干剂

实施例6

制备工艺同实施例3

实施例7

制备工艺同实施例3

实施例8

制备工艺同实施例3

实施例9

制备工艺同实施例3

实施例10

制备工艺同实施例3

不同助乳化剂及含量的的前列腺素e1甲酯冻干剂

实施例11

制备工艺同实施例3

实施例12

制备工艺同实施例3

实施例13

制备工艺同实施例3

实施例14

制备工艺同实施例3

不同冻干保护剂及含量的的前列腺素e1甲酯冻干剂

实施例15

制备工艺同实施例3

实施例16

制备工艺同实施例3

实施例17

制备工艺同实施例3

实施例18

制备工艺同实施例3

对比例1

依据美国专利us4849451中实施例2制备获得。

对比例2

将对比例1所得制剂添加本发明处方所用冻干保护剂进行冷冻干燥。

实验例1

体外抗血小板凝集试验中的作用

健康成年sd大鼠腹腔注射10％水合氯醛麻醉后，腹主动脉采集大鼠新鲜全血加入使用3.8％枸橼酸钠溶液抗凝的离心管中，900转离心10min取上层富含血小板的血浆(prp)备用。取出prp的试管继续4000转离心10分钟，取上层澄清血浆(ppp)备用。实验选用泰利康信lby-nj4型4通道血小板聚集仪测定各化合物的抗凝效能。

含有300μlprp样品杯中先加入，2μl100μm的pge1、实施例化合物1、实施例化合物2和甲醇(溶剂)，孵育不同的时间(0、1、2、4、7、10、15min)后加入聚集诱导剂180μmadp溶液20μl，测定各样品的聚集率，并计算化合物对adp诱导血小板聚集的抑制率。

抑制率％＝(溶剂聚集率-化合物聚集率)/溶剂聚集率×100％

由结果(图1所示)可知，prp中加入pge1与实施例化合物1后立即生效，抑制率相当，随孵育时间延长，实施例化合物抗凝效能缓慢降低，10分钟后抑制率仍为43.66％，pge1孵育4分钟后抑制率仅为4.93％。实施例化合物2加入后并未立即生效，随时间延长效能逐渐加强，孵育10分钟后达到最大抑制率51.86％。故实施例化合物1为具有活性的非前药化合物，其抗凝作用时长超过pge12倍，而实施例化合物2为典型的前药型化合物。

实验例2

体外血管条扩张试验

实验选用家兔制备离体主动脉环标本：新西兰大白兔,雄性,体重(2.5±0.3)kg。用钝器击昏兔子,固定于兔解剖台,迅速分离出胸主动脉,放入盛有37℃饱和的kerbs液(每1000ml中含nacl6.9g,kcl0.35g,mgso4·7h2o0.29g,kh2po40.16g,nahco32.1g,cacl20.28g,葡萄糖2g)并持续通入通混合气体(95％o2,5％co2)的培养皿中,将血管内的残存血液挤出,并小心剥去外围的脂肪及结缔组织,剪成0.5cm长的动脉环数段备用。血管环用两根不锈钢l型挂钩贯穿血管管腔,横向悬挂在20ml浴管内,下方固定,上方以一细钢丝连于张力换能器,先调解静息张力为0.00g,稳定20min后,再给予3.00g张力,不断调整张力水平,使之维持在3.00g左右,稳定2h(每15min沿浴槽壁换kerbs液一次)。

使用bl-420s生物机能实验系统(成都泰盟科技)记录血管环张力变化。待血管环收缩达到稳定后,累积加入前列腺素e1和实施例化合物,使浴管中的前列腺素e1终质量浓度依次递增为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8、25.6nm,记录血管环的舒张效能。

结果显示(图2所示)在本实验条件下实施例1化合物对家兔离体血管的舒张效能(ec50＝1.090nm)明显强于pge1(ec50＝9.767nm)。

实验例3

肠系膜微循环障碍模型

2.5％戊巴比妥钠30mg/kgip麻醉大鼠，背位固定，于腹正中线作3～4cm长切口，轻拉回盲部一段小肠系膜，置于充满37℃生理盐水液的有机玻璃恒温水浴槽中，保持肠系膜湿润，并平铺在浴槽中央的有机凸型观察台上，压上固定板，利用生物显微镜(放大40倍)摄像头采集显微镜下视频图像利用bi-2000微循环观测系统对所采集的镜下视频图像进行实时分析。

固定一视野，平衡10min后，观察选定区域的微动脉和微静脉管径、流速，然后向选定区域滴加1∶100稀释盐酸肾上腺素生理盐水溶液100μl/只，正常对照组滴加等体积生理盐水，同时立即经尾静脉给与10μg/kg的实施例制剂和优帝尔，测量给药后0.5、1.2、4、6、8、10、12、15min时肠系膜微动脉的管径。

如图3所示，经管径测量，实施例3制剂组可极为明显改善肾上腺素引起的微循环障碍，给药后0.5分钟-10分钟均与模型组有明显的差异(p<0.05)，优帝尔组4分钟时与模型对照组相比差异已不显著(p>0.05)。实施例组改善肾上腺素引起循环障碍的效能明显高优帝尔，两者比较0.5-10min均具有显著性差异(p<0.05)。

实验例4

制剂游离药物测定

样品处理方法：各实施例冻干乳分别加10ml复乳同步取一份以水稀释10倍，精密量取适量置20ml棕色具塞试管中，加四氢呋喃2.5ml，混匀，加磷酸溶液(1→1000)15ml，混匀，通过预处理柱[填充物为十八烷基硅烷键合硅胶，粒径为70μm，φ10mm×9mm聚丙烯管(sep-pakc18柱，waters)。使用前用甲醇10ml、水10ml冲洗]，试管用10ml水冲洗并通过预处理柱。再用甲醇7ml洗脱，洗脱液全部移入10ml棕色蒸馏瓶中，50℃减压蒸馏10分钟，蒸干溶剂，残渣用内标溶液1ml溶解，摇匀，即得样品。

用十八烷基键合硅胶为填充剂，以0.0067mol/l磷酸盐缓冲液(ph＝6.3)(取磷酸二氢钾9.07g，加水使溶解，制成1000ml，另取无水磷酸氢二钠9.46g，加水使溶解，制成1000ml，将后者加入到前者中，直到ph为6.3，取此液100ml加水至1000ml，摇匀，即得)-乙腈(70:30)为流动相；流速为每分钟1ml；柱后反应液为1mol·l-1koh溶液，柱后反应管为聚四氟乙烯管柱温60℃；检测波长278nm。供试品和对照品溶液各进样20μl，按内标峰面积法计算。

将实施例3～18和优帝尔用生理盐水复溶，浓度均为1ug/ml，再取样均稀释10倍至0.1ug/ml，取上述复溶后各制剂适量，置于超滤离心管中，以2800r·min-1离心超滤30min后，取滤液1ml按上述样品处理方法配制样品溶液，进样20μl，测得的各药物含量即为游离药物含量。

同时测定各实施例样品1ml复乳(1×)和10倍稀释(10×)后样品的游离率。

游离率％＝游离药物总量/总药物量×100％

测得的各实施例游离率如下表1所示：

表1

实验结果表明，实施例3～18药物复溶后游离药物显著低于优帝尔，且优帝尔按照说明书使用方法稀释10倍后，游离率显著上升，而本发明实施例制备制剂稀释后游离药物无明显增加。

实验例5

血管刺激试验

选取新西兰大白兔20只，分为2组体重约2kg。实施例制剂与优帝尔均采用生理盐水复乳为1μg/ml,并继续用生理盐水稀释至0.1μg/ml。按照前列腺素e1临床用量折算，0.5μg/kg耳缘静脉缓慢滴注，对侧耳缘静脉静注同样体积的生理盐水，每天1次，连续滴注7天。末次给药后2小时目视评价血管刺激程度，所有动物处死后取注射部位做组织病理学检查，结果如下表2和表3所示。

表2、血管刺激性试验大体检查表

结果显示实施例组基本无刺激性(p>0.05)，优帝尔组出现了明显的血管刺激(p<0.05)。

表3

*p<0.05与本组对照耳对比；#p<0.05与实施例组给药耳对比

实验例6

制剂稳定性试验

实施例3～18，对比例1、2所制备的样品外观以及粒径检测如下表4所示：

表4

采用pss公司的380zls粒度仪(动态光散射法)测定平均粒径，采用pss公司的accusizer780仪器(光阻法)测定大粒径乳滴，计算大于5um乳滴的百分比。结果显示，实施例3～18所制备样品冻干后外观良好，复溶后平均粒径明显小于对比例1，且大乳滴(>5um)占百分比远小于0.05％，对比例1大粒径(>5um)超标(>0.05％，usp标准)，而对比例2无法冻干成型。

取实施例3、5、8、15制备的样品进行24h长期稳定性试验(温度25℃±2℃，湿度60％±10％)，结果如下表5所示：

表5

结果显示，本发明实施例制备的前列腺素e1甲酯冻干剂在24个月长期稳定试验中产品质量稳定。

实验例7

实施例3、6、7、8和对比例1在大鼠体内药代动力学研究

药动学实验采用sd雄性大鼠每组12只，给药前禁食12h，自由饮水。分别按40μg/kg的剂量静脉给与两种制剂，给药后0.5min、1.25min、3min、5min、8min、12min、16min、20min、30min、45min眼眶采血，测定各时间点的血药浓度(前列腺素e1甲酯与前列腺素之和)如图4所示。

根据血药浓度曲线计算所得的两种制剂的药动学参数，实施例3给药后峰值血药浓度明显高于对比例1组，半衰期明显延长，生物利用度也明显提高(见表6)。

表6大鼠静脉注射40μg/kg实施例3、6-8和对比例1制剂的药代动力学参数

实施例3、6-8相比对比例1制剂体内药动学行为的明显改善，可能是抑制了药物在肺循环中的代谢灭活，而这种现象可能与药物的粒径有关。