一种具有肾脏靶向分布特性的大黄酸脂质囊纳米粒及应用的制作方法

本发明涉及一种具有肾脏靶向分布特性的大黄酸脂质囊纳米粒及其应用。

(二)

背景技术：

大黄酸(rhein，rh)为蓼科植物掌叶大黄(rheumpalmatuml.)、唐古特大黄(r.tanguticummaxim.exbalf.)等传统中药分离提取的有效成分，属于单蒽核类1,8-二羟基蒽醌衍生物，药理研究证实，rh可显著抑制肾小球系膜细胞的增生、肥大以及细胞外基质的产生，同时rh能抑制人肾小管上皮细胞tsp-1、tgf-β1的mrna转录和蛋白表达，保护肾脏固有功能，在对肾脏疾病的干预中发挥着多靶点多层次的治疗作用。但是，rh溶解性差、半衰期短、肾脏富集率低、生物利用度低、且具有一定的肝毒性，导致临床试验效果不佳，严重限制了其临床应用。

有研究者采用纳米粒作为药物载体，包载rh后进行递药输送，能够提高rh的水溶性、延长半衰期和赋予缓控释的特点。但是文献所报道的纳米粒仍未能有效提高rh的肾脏靶向分布，而且这些纳米粒经细胞摄取后会直接进入溶酶体，溶酶体作为细胞的“垃圾处理站”，其富含大量各类酸性水解酶，对进入其中的各类物质进行消化和分解，从而使药物丧失活性，极大降低了纳米递药系统的疗效。研究开发具备肾脏靶向分布功能和避免溶酶体降解特性的纳米制剂才能有效提高rh对肾脏疾病的治疗效果。

肾脏组织对不同粒径的纳米粒具有天然的选择性，根据文献报道，粒径小于10nm的纳米粒极容易经肾小球滤过而被清除，粒径大于100nm的纳米粒容易被肝脾截留而不易被分布到肾脏；肾小球系膜对粒径范围为75±25nm的纳米粒具有一定截留能力，该粒径范围内可以显著降低肝脏的相对截留率，减少药物的肝毒性，因此优化控制纳米粒的粒径能够实现纳米粒的肾脏靶向分布。但是，经肾脏截留的纳米粒如果不能快速被肾脏细胞摄取内吞仍然会被肾脏过滤清除，而不能有效提高药物疗效。因而，研究开发兼顾肾脏靶向分布和肾脏细胞快速摄取的纳米粒对促进rh的临床转化具有重要意义。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种具有肾脏靶向分布特性的大黄酸脂质囊纳米粒及其应用。

本发明采用的技术方案是：

一种具有肾脏靶向分布特性的大黄酸脂质囊纳米粒，所述大黄酸脂质囊纳米粒是以聚合物聚已内酯-聚乙烯亚胺(pcl-pei)为载体材料荷载药物大黄酸(rh)作为核，载体材料和大黄酸的质量比为20～30:1～3；以摩尔比例为1:6:2:2的肾脏靶向肽修饰的1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg-ktp)、二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、胆固醇琥珀酸单酯(chems)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)为脂质材料制备脂质囊；核为正电性，囊为负电性，两者通过正负静电相互作用，脂质囊包裹于核形成核壳结构的脂质囊纳米粒。

脂质囊纳米粒是一种脂质囊泡和纳米粒在水溶液中依靠静电、亲疏水等作用自组装形成的具有脂质外壳和纳米粒内核的新型“核壳型”组装体。脂质囊纳米粒结合了脂质囊泡与纳米粒的物理特性，覆盖在外层的脂质囊泡可以改善纳米颗粒的生物相容性；而内核的纳米粒赋予脂质囊泡一定的支撑骨架。这种独特的核壳型结构特征使其具有与传统纳米粒及脂质体所无法比拟的优势，如在温和的条件下可自发形成；粒径可控且结构稳定；表面可以修饰；载药量高；可同时包载两种以上药物等。最新研究发现，脂质囊能够与细胞膜发生膜融合作用，改变纳米粒的内吞途径，降低纳米粒进入溶酶体的概率，从而能够避免药物在溶酶体中的降解。同时，构成脂质囊的脂质材料容易进行靶向修饰。

肾脏靶向肽(kidneytargetingpeptide，ktp)是一类能够靶向肾脏细胞(肾小管细胞、内皮细胞、系膜细胞和足细胞)的小分子多肽，其中含有弹性蛋白样多肽序列csavplc的多肽被证实能够有效识别和促进肾脏细胞的内吞摄取。因此本发明采用脂质囊纳米粒为rh递送载体，通过控制粒径和经ktp修饰，以实现脂质囊纳米粒的肾靶向分布和促进肾脏细胞的摄取并逃避溶酶体的降解，提高rh对肾脏疾病的治疗作用。

本发明中，所述大黄酸脂质囊纳米粒平均粒径为(59.5±6.2)nm，zeta电位为(-3.7±4.3)mv，对rh药物的包封率为(90.22±4.26)％，载药量为(5.17±0.69)％。

所述肾脏靶向肽序列为含有半胱氨酸-丝氨酸-丙氨酸-缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸-半胱氨酸(csavplc)的多肽序列。

本发明中，所述肾脏靶向肽序列为赖氨酸-半胱氨酸-丝氨酸-丙氨酸-缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸-半胱氨酸(kcsavplc)，其中赖氨酸提供了末端游离氨基用于与脂质材料1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇-n-羟基丁二酰亚胺(dspe-peg-nhs)的偶联反应，合成肾脏靶向肽修饰的1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg-ktp)。

本发明还涉及所述的大黄酸脂质囊纳米粒在制备防治糖尿病肾病的药物中的应用。

具体的，所述药物为降低血尿素氮和血肌酐水平，减低肾指数，同时提高尿肌酐水平和肌酐清除率的药物。

具体的，所述药物为抑制tgf-β1蛋白的表白和稳定信号通路传递蛋白smad2/3，阻止smad2/3的磷酸化的药物。

本发明设计合成了聚已内酯-聚乙烯亚胺聚合物(polycaprolactone-co-polyethyleneimine,pcl-pei)，以pcl-pei为载体材料，制备包载rh的pcl-pei纳米粒(pcl-peinanoparticleloadingrhein，ppr)；利用肾脏靶向肽修饰的脂质dspe-peg-ktp为脂质囊材，通过正-负静电作用，包裹ppr后制备肾脏靶向肽修饰的核壳结构大黄酸脂质囊纳米粒(kidneytargetingpeptidemodifiedliposomalpcl-peinanoparticleloadingrhein,klppr)。以包封率、载药量和粒径为主要指标，设计筛选klppr的制备方法，并进行药剂学特性评价；透析法考察其体外释药特性、mtt法评价其对hk-2细胞的生物安全性、流式细胞仪考察其摄取内吞效率、共聚焦显微镜考察其细胞分布特性，以链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病小鼠为病理模型，考察klppr的肾靶向分布和药效学特性，通过h&e、pas和ich染色以及westernblot蛋白分析方法探索klppr对糖尿病肾病的治疗效果和治疗机制，为rh及同类药物的新型纳米制剂研究提供参考和指导。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种具有肾脏靶向分布特性的大黄酸脂质囊纳米粒(klppr)，该脂质囊纳米粒对rh具有较高的包封率和载药量，粒径分布均匀，体外释药具有缓释特性，细胞摄取迅速，具备不进入溶酶体的特性，具有良好的生物安全性；在链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病小鼠模型中，klppr具备良好的肾脏靶向分布特性，能够显著改善糖尿病肾病小鼠多项病理指标，缓解和逆转糖尿病肾病的病程恶化，有效提高rh对糖尿病肾病的治疗作用。本发明为靶向治疗糖尿病肾病提供了一种全新的策略，将进一步促进rh药物的临床转化，为rh及同类药物新型纳米制剂的研究提供重要参考。

(四)附图说明

图1为聚合物的合成路线(a)和各聚合物的¹h-nmr图谱(b)。

图2为聚合物分子量分布曲线(a)，(b)荧光探针cy5标记的聚合物荧光扫描图谱(b)，不同浓度聚合物溶液中芘的荧光扫描图谱(c)和不同浓度聚合物溶液中芘在i338/i333荧光强度比值及浓度对数值的趋势线(d)。

图3为dspe-peg-ktp的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图谱。

图4为纳米粒透射电镜图片和对应的粒径分布图。(a,a)ppr纳米粒，(b,b)空壳脂质囊，(c,c)klppr脂质囊纳米粒，右上角的放大图可清晰显示核壳结构。标尺为50nm。

图5为纳米粒制剂体外释药曲线。

图6为纳米粒的红细胞溶血现象(a)，未载药的纳米粒对hk-2的细胞毒性(b)，载药的纳米粒对hk-2的细胞毒性(c)，hk-2细胞对纳米粒的在不同时间的摄取效率(d)，不同ktp浓度对细胞摄取纳米粒的影响(e)，细胞内吞抑制剂和低温对细胞摄取摄取纳米粒的影响(f)。

图7为激光共聚焦显微镜观察各纳米粒经细胞摄取入胞过程及胞内分布，(a)ppcy5r，(b)klppcy5r，蓝色为hoechst33342染色的细胞核，绿色为greendnd26染色的溶酶体，红色为荧光探针cy5标记的纳米粒，三色为叠加图，标尺50μm。

图8为尾静脉注射lppcy5r和klppcy5r在dn小鼠的组织分布。(a)小鼠全身、尿液和脏器的荧光分布图，(b)小鼠尿液中荧光强度定量分析，(c)小鼠脏器中荧光强度定量分析，*p<0.05，**p<0.01。

图9为纳米粒对糖尿病肾病小鼠的治疗效果。给药治疗期间，各组小鼠(a)空腹血糖和(b)体重变化趋势。给药治疗结束后，各组小鼠(c)尿肌酐、(d)尿蛋白、(e)血尿素氮、(f)血肌酐、(g)肌酐清除率和(h)肾指数的测定值。与dn组相比较，*p<0.05，**p<0.01；与rh-sol组相比较，#p<0.05，##p<0.01。

图10为纳米粒对糖尿病肾病小鼠的治疗后对肾脏的病理学分析。(a)各组肾脏的h&e染色、pas染色和黏连蛋白免疫组化染色，(b)对pas染色的定量分析，(c)对黏连蛋白免疫组化染色的定量分析，(d，f)western-blot测定分析tgf-β1蛋白表达，(e，g)western-blot测定分析smad2/3蛋白的表达。与dn组相比较，*p<0.05，**p<0.01；与rh-sol组相比较，#p<0.05，##p<0.01。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1材料和仪器

肾脏靶向肽kcsavplc(kidneytargetingpeptide，ktp，委托上海强耀生物科技有限公司合成，纯度≥95％)；rh原料药(南京泽朗医药科技有限公司，纯度≥98％，批号201307)；rh对照品(中国食品药品检定研究院，批号110757200206)；二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)、胆固醇琥珀酸单酯(chems)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg)(上海艾韦特医药科技有限公司)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-聚乙二醇2000-n-羟基丁二酰亚胺(dspe-peg-nhs)(美国nanosoftpolymers公司)；2-甲基-2-恶唑啉、对甲苯磺酸甲酯、1-3′-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)(安耐吉化学-萨恩化学技术有限公司)；端羧基聚己内酯(pcl，分子量3.7kd，济南岱罡生物工程有限公司)；噻唑蓝(mtt)(上海阿拉丁试剂有限公司)；甘精胰岛素(lantus，法国sanofi-aventis公司)；cy5-n-羟基琥珀酰亚胺酯(cy5-nhs)(杭州墨丘利生物医药科技有限公司)；dmem培养基(添加有4.5g·l^-1葡萄糖、3.7g/l碳酸氢钠、10wt％胎牛血清、1wt％非必需氨基酸、1wt％谷氨酰胺、100μg·ml^-1青霉素和100μg·ml^-1链霉素)、0.25wt％胰蛋白酶溶液(美国gibco公司)；细胞核染料hoechst33342、溶酶体绿色染料greendnd26(美国thermofisherscientific公司)；anti-tgf-β1单克隆抗体和anti-smad2/3单克隆抗体(英国abcam公司)；anti-fibronectin单克隆抗体(美国proteintech公司)；anti-napdh单克隆抗体(碧云天生物技术有限公司)；蛋白定量、尿素氮、肌酐等测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；链脲佐菌素(stz)(sigma公司)；n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、乙腈、甲醇等均为国产分析纯。

brukeravance-400型核磁共振仪(德国bruker公司)；nano-zs90激光粒度分析仪(英国malvern公司)；agilent-l200高效液相色谱仪(美国agilent公司)；jem-1200ex透射电镜(日本电子株式会社)；waters1515型凝胶色谱仪(美国waters公司)；spectramaxm5多功能酶标仪(美国moleculardevices公司)；st16r台式离心机(美国thermofisherscientific公司)；mill-q超纯水仪(美国millpore公司)；thermoscientificformaiico2培养箱(美国thermo公司)；ivisluminaiii小动物活体成像仪(美国perkinelmer公司)；dzf-6020真空干燥箱(广州康恒仪器有限公司)；cp225d电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司)；等。

雄性c57bl/6小鼠、兔红细胞(浙江中医药大学实验动物中心提供)；hk-2细胞(源于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)。

2方法

2.1载体材料的合成与表征

2.1.1聚已内酯-聚乙烯亚胺聚合物(pcl-pei)的合成

采用阳离子开环聚合反应合成聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，pei)，取2-甲基-2-恶唑啉(2ml，23.5mmol)和对甲苯磺酸甲酯(0.186g，1mmol)溶于10ml干燥除水乙腈中，氮气鼓泡除氧气后，于75℃搅拌反应24h，然后加入乙二胺(0.5ml，8mmol)继续反应6h。将反应液滴入冰乙醚中沉淀3次得到乙酰化的pei(acetylatedpolyethyleneimine，apei)。将apei溶于100ml质量分数15％的盐酸溶液，于110℃回流12h，脱除乙酰基，冷却后用naoh溶液调节ph至8.5，用透析袋(截留分子量1kd)置于纯水中透析24h，冻干后得到pei(约0.53g，产率26.6％)。核磁共振仪测定pei的¹h-nmr图谱(d2o，400hz，δ)：3.46(ch3nhch2-，3.0h)，2.95(-nhch2ch2-，83.6h)，根据核磁图谱计算理论分子量为0.9kd(83.6/4＝21即pei有21个重复单元，每个重复单元分子量为43，得出理论分子量为0.903kd)；通过凝胶渗透色谱仪测定pei分子量约为0.82kd，理论分子量与gpc测定得到的分子量基本一致。核磁图谱中δ位移1.85峰为未脱除干净的ch3co-，pei的21个重复单元中约含有1个ch3co-，脱除率大于95％，满足化合物纯度要求标准。

取羧基封端聚已内酯(0.37g，0.1mmol)，dcc(0.042g，0.2mmol)和nhs(0.023g，0.2mmol)溶于10ml乙腈中，室温搅拌反应4h后，加入pei(0.11g，1.2mmol)，于45℃反应12h后，用透析袋(截留分子量3.5kd)置于甲醇中透析24h，旋蒸抽干即得到pcl-pei(约0.41g，产率89.2％)。核磁共振仪测定pcl-pei的¹h-nmr图谱(cd3od，400hz，δ)：1.40(-coch2ch2ch2ch2ch2o-，73.8h)，1.63(-coch2ch2ch2ch2ch2o-，122.1h)，2.30(-coch2-，63.1h)，2.91(-nhch2ch2-，60.3h)，4.06(-ch2o-，64.0h)，根据核磁图谱计算理论分子量为4.35kd，通过凝胶渗透色谱仪测定pcl-pei分子量约为4.6kd，理论分子量与gpc测定得到的分子量基本一致。

2.1.2荧光标记pcl-pei的合成

称取pcl-pei100mg，溶于5ml的dmf中，加入荧光染料cy5-nhs0.5mg，避光室温搅拌反应12h，将反应液倒入透析袋(截留分子量3.5kd)置于甲醇中透析24h，旋蒸抽干溶剂后得到cy5标记的pcl-pei(pcl-peicy5)。经酶标仪扫描荧光波谱强度，pcl-peicy5荧光摩尔结合率约为2.2％。

2.1.3肾脏靶向磷脂材料(dspe-peg-ktp)的合成

称取dspe-peg-nhs(150mg，0.05mmol)和ktp(82mg，0.1mmol)溶于5mldmf中，于45℃搅拌反应12h，将反应液倒入透析袋(截留分子量3.5kd)置于甲醇中透析24h，旋蒸抽干溶剂后得到dspe-peg-ktp(约144mg，产率75.4％)。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)验证dspe-peg-ktp的偶联纯度。

2.1.4pcl-pei临界胶束浓度(cmc)表征

以芘为荧光探针，采用荧光法测定cmc：将芘溶于丙酮配制20μg·ml^-1母液，取离心管，每管加入100μl母液，自然挥干丙酮后，加入1ml一系列浓度的聚合物混悬液，最终芘浓度为2μg·ml^-1，室温置于摇床中摇动过夜，酶标仪测定聚合物混悬液中芘的荧光光谱，固定最大发射波长为390nm，扫描芘在300～360nm激发光谱图，计算各浓度下激发光谱图338nm和333nm荧光强度的比值(i338/i333)，绘制聚合物浓度与i338/i333曲线，计算曲线拐点处浓度为聚合物cmc。

2.2药物测定方法的建立

精密配制浓度为0.10mg·ml^-1的rh对照品母液，稀释至浓度为0.1、0.5、1、5、10、20、40、80μg·ml^-1系列溶液，采用hplc进行测定。色谱柱：platisilods型(150×4.6mm，5μm)，流动相：甲醇∶0.1％磷酸(75∶25)，流速：1.0ml·min^-1；柱温：25℃，检测波长：254nm，以峰面积a为纵坐标，浓度c为横坐标拟合标准曲线。取1、10、40μg·ml^-1的3种浓度rh溶液，分别在日内测定5次并且连续测定3d，计算rh的日内、日间精密度。按处方量的80、100、120％精密称取rh，分别加入处方比例的辅料，搅拌混合，用甲醇溶解定容后，经0.22μm微孔滤膜过滤后测定药物浓度，计算rh回收率。

2.3纳米粒的制备和表征

结合纳米沉淀法和薄膜水化法制备肾脏靶向肽修饰的核壳结构大黄酸脂质囊纳米粒(kidneytargetingpeptidemodifiedliposomalpcl-peinanoparticleloadingrhein,klppr)。称取适量rh和30mgpcl-pei溶于3ml体积比为2/1的乙腈/甲醇的有机混合溶剂中，500r·min^-1搅拌下将混合溶剂滴加到10ml去离子水(ph＝6)中，滴毕，继续搅拌20min，减压蒸出有机溶剂，得到包载大黄酸的pcl-pei纳米粒(pcl-peinanoparticleloadingrhein,ppr)混悬液；称取chems(0.98mg，2μmol)、dope(4.46mg，6μmol)、dspe-peg(5.6mg，2μmol)、dspe-peg-ktp(3.7mg，1μmol)溶于1ml氯仿中，充分超声溶解后，置于茄形烧瓶中旋蒸除尽氯仿后制成脂质膜，将ppr混悬液加入茄形烧瓶中，超声水化后即得到klppr。采用同样的制备方法，以荧光标记的pcl-peicy5为载体材料，制备得到荧光标记的klppr(klppcy5r)；未加入肾脏靶向肽脂质dspe-peg-ktp情况下，制备得到未经肾脏靶向肽修饰的对照大黄酸纳米脂质囊(lppr)和荧光标记的未经肾脏靶向肽修饰的对照大黄酸纳米脂质囊(lppcy5r)。

取少量klppr混悬液、ppr混悬液和空白脂质体混悬液，蒸馏水稀释后经粒径仪测定其平均粒径及zeta电位；置于铜网上，透射电子显微镜观察其微观形貌特征。取1mlklppr混悬液置于离心管中，于20000r·min^-1离心30min，取溶液上清经hplc测定游离的rh浓度，计算包封率和载药量。

2.4体外释药特性考察

以含2wt％吐温80和1wt％甘油的ph7.4pbs溶液作为释放介质，透析法考察klppr释药特性：分别取klppr混悬液、ppr混悬液和rh溶液(rh-sol)加入透析袋内，用透析夹封口后置于500ml释放介质中，放于37℃恒温摇床(60r·min^-1)，分别于不同时间点(0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48h)取释放介质1ml并补加等量空白释放介质，试样经处理后于hplc测定rh含量，计算累积释放百分率(q)，绘制并拟合体外释药曲线。

2.5体外溶血实验

取抗凝后的新鲜兔血液，2000r·min^-1离心5min去除上层血清和蛋白后，用ph7.4的pbs溶液重悬冲洗离心3次，pbs溶液稀释配制浓度约为10⁸个/ml红细胞储备液。在离心管中加入klppr混悬液和ppr混悬液，pbs溶液稀释至系列梯度浓度，体积为0.9ml，最后加入0.1ml的红细胞储备液。将离心管置于37℃恒温摇床中(60r·min^-1)，孵育2h后于2000r·min^-1离心5min分离出未破裂的红细胞，取上清液0.2ml，酶标仪测定其在540nm处的吸光度(a)。以相应pbs溶液作为阴性对照，纯水溶液作为阳性对照，计算溶血率(hemolysisratio)，hemolysisratio＝(a样-a阴)/(a阳-a阴)*100％。

2.6细胞毒性实验

取对数生长期hk-2细胞，0.25％胰蛋白酶消化、收集、离心后，用dmem培养基稀释细胞至密度为5×10⁴个/ml，取96孔板，每孔加入180μl，稳定12h后，实验组分别加入系列梯度浓度的纳米制剂混悬液20μl，对照组加入等量的pbs，各组平行6孔。48h后每孔加入20μl的5mg·ml^-1mtt溶液，继续孵育4h，离心弃上清后加入200μl二甲亚砜，置于振荡器上振荡1min，以570nm为检测波长和以620nm为校正波长，用酶标仪测定的吸光度值(a)，计算细胞的存活率(cellviability)，cellviability＝a实验组/a对照组×100％。

2.7细胞摄取效率考察

将对数生长期的hk-2细胞用dmem培养基稀释至密度为1×10⁵个/ml的细胞悬液，取12孔板，每孔加入1ml细胞悬液，稳定培养12h。加入100μl等量荧光强度的klppcy5rh或lppcy5r或ppcy5r，使其孵育0、0.25、0.5、1、1.5、2、3h，吸弃培养基，pbs冲洗三遍，胰酶消化，收集细胞，采用流式细胞仪测定hk-2细胞在不同孵育时间摄取各纳米制剂的平均荧光强度，绘制摄取速率曲线，评价hk-2对各纳米制剂的摄取效率。同时，以不同浓度的ktp预孵育1后，加入100μl等量荧光强度的klppcy5rh或lppcy5r或ppcy5r，使其孵育0.5h，相同方法测定细胞摄取各纳米制剂的平均荧光强度，考察ktp对纳米粒摄取的影响。

2.8细胞内吞机制考察

将hk-2细胞以5×10⁵/孔的细胞密度培养于12孔板中，每孔含有1ml培养基，并在恒温培养箱中培养12h。将每孔分别加入氯丙嗪(chlorpromazine，50μm，为网格蛋白介导的内吞作用抑制剂，引起网格蛋白网络在内涵体膜上的组装并阻止细胞表面上的被膜小窝组装)、非律平(filipiniii，7.5μm，为胞膜窖介导的内吞作用抑制剂，与膜上的胆固醇结合并形成超微结构聚集与复合)、渥曼青霉素(wortmannin，5μm，为巨胞饮抑制剂，抑制磷脂酰肌醇-3激酶活性)和细胞松弛素d(cytochalasind，5μm，结合于肌动蛋白核和f-肌动蛋白的生长端，从而抑制聚合反应，诱导肌动蛋白解聚)以及低温4℃条件，孵育2h后，加入100μl等量荧光强度的klppcy5rh或lppcy5r或ppcy5r混悬液，继续培养2h。吸弃培养基，用2mg/ml的肝素钠溶液洗涤1次，再用0.25wt％胰酶(含0.02wt％edta)溶液将细胞消化收集到流式管中，离心，pbs溶液清洗1次，最后将细胞吹散悬浮于0.5mlpbs溶液中，采用流式细胞仪检测细胞阳性率。

2.9亚细胞分布考察

将对数生长期的hk-2细胞用dmem培养基稀释至密度为1×10⁵个/ml的细胞悬液，取规格为35mm的玻底培养皿，每皿加入1ml细胞悬液，稳定培养24h。采用激光共聚焦显微镜观察klppcy5r和ppcy5r的细胞摄取过程及胞内分布：首先按照hoechst33342试剂盒和greendnd26试剂盒操作指南，每皿加入0.2μlgreendnd26标准液，20min后每皿滴加2滴hoechst33342标准液，孵育30min后，吸取培养基，pbs冲洗一遍，加入新鲜无血清dmem培养基，然后加入100μlklppcy5r或ppcy5r混悬液，分别于孵育15min、1h和3h观察，激光共聚焦显微镜分别选取dapi通道、488nm通道和640nm通道三个光源，考察纳米制剂的细胞摄取过程及胞内分布情况。

2.10糖尿病肾病小鼠模型的构建

雄性c57bl/6小鼠禁食过夜后，一次性腹腔注射200mg/kg链脲佐菌素(stz，溶于100mmph4.5柠檬酸盐缓冲液，即用即配)，正常对照组(healthycontrol，hc)腹腔注射柠檬酸盐缓冲液。造模后以10％蔗糖水喂养，3d后将10％蔗糖水换成普通纯净水。造模一周后，禁食过夜，剪尾尖采血，血糖仪检测空腹血糖(fastingbloodglucose，fbg)浓度，以fbg>15mmol/l为糖尿病模型造模成功。继续饲养5周，每周称重并检测fbg，使糖尿病模型病程恶化发展成为糖尿病肾病模型(diabeticnephropathy，dn)。

2.11小动物活体成像考察pppr-nps在dn小鼠的体内分布

选取造模成功的dn小鼠8只，随机分成2组，称重，分别按照200μl/20g尾静脉注射lppcy5r和klppcy5r混悬液。用脱毛膏将小鼠胸腹部脱毛，并置于代谢笼中收集尿液，于8h时采用小动物活体成像仪(ivisluminaiii，perkinelmer)荧光模式观察纳米粒在dn小鼠体内和尿液分布情况。颈椎脱臼处死小鼠，解剖取出心肝脾肺肾肠等脏器组织，用生理盐水中清洗，滤纸吸干水分，称重，置于黑色背景塑料板上，采用小动物活体成像仪拍摄并测定各脏器组织的总荧光强度，计算各脏器组织的总荧光强度/脏器重量值(totalfluorescenceintensity/tissueweight)。

2.12klppr对dn小鼠治疗作用

选取造模成功小鼠随机分为5组，每组6只，分别为模型对照组即dn组、阳性药物对照组即lantus组、rh-sol组、lpppr组和klpppr，隔日给药，连续给药10次。lantus经皮下注射(0.5u/mouse)，rh-sol组、lpppr组和klpppr尾静脉注射(折合rh量为5mg/kg)。同时，随机选取6只健康小鼠作为健康对照hc组，hc和dn对照组给予尾静脉注射生理盐水。隔日称量测定并记录小鼠的fbg和体重。

给药结束时，将小鼠置于代谢笼中，收集24h尿液，记录尿量体积(24-hoururinaryvolume，24h-uv)并测定各组尿蛋白量(24-hoururinaryproteinexcretion，24h-upe)和尿肌酐(urinarycreatinine，ucr)。腹腔注射戊巴比妥钠麻醉所有小鼠摘眼球取血，一部分全血置于edta抗凝处理的离心管，离心后取血清用于检测血尿素氮(bloodureanitrogen，bun)、血清肌酐(serumcreatinine，scr)，计算内生肌酐清除率(creatinineclearancerate，ccr)。颈椎脱臼处死小鼠后，迅速取出肾脏称重，计算肾指数(kidneyindex，即双肾重量/体重)。一侧肾脏浸泡于4％多聚甲醛中固定，石蜡包埋后用于苏木精-伊红(hematoxylinandeeosinstaining，h&e)染色和过碘酸-雪夫染色(periodicacid-schiffstaining，pas)在光学显微镜下观察肾脏病变情况并对病理形态进行定量分析；免疫组化分析肾脏组织中粘连蛋白(fibronectin，fn)的表达情况；另一侧肾脏冻存于-80℃冰箱，用于破碎匀浆后提取蛋白，westernblotting分析肾脏中纤维化相关基因tgf-β1和smad2/3的表达情况。内生肌酐清除率(ccr)计算公式如下：

3实验结果和讨论

3.1载体材料的合成与表征

聚合物pcl-pei的合成路线如图1a所示，首先2-甲基-2-恶唑啉经阳离子开环聚合反应得到乙酰化的pei(apei)，经盐酸回流脱掉乙酰基后得到pei，然后羧基封端的pcl与pei酯化反应得到pcl-pei。经核磁共振仪测定(图1b)，pei的¹h-nmr图谱(d2o，400hz，δ)：3.46(ch3nhch2-，3.0h)，2.95(-nhch2ch2-，83.6h)。核磁图谱中δ位移1.85峰为未脱除干净的ch3co-，pei的每21个重复单元中约含有1个ch3co-，脱除率大于95％，满足化合物纯度要求标准。pcl-pei的¹h-nmr图谱(cd3od，400hz，δ)：1.40(-coch2ch2ch2ch2ch2o-，73.8h)，1.63(-coch2ch2ch2ch2ch2o-，122.1h)，2.30(-coch2-，63.1h)，2.91(-nhch2ch2-，60.3h)，4.06(-ch2o-，64.0h)，通过凝胶渗透色谱仪测定(图2a)，pcl-pei分子量约为4.6kd，理论分子量与gpc测定得到的分子量基本一致，分子量分布系数为1.24，分布范围窄，分子量分布较为均一，验证成功合成了聚合物pei-pcl。

选用荧光探针cy5对pcl-pei进行荧光标记，经酶标仪扫描荧光波谱强度(图2b)，按摩尔比计算，pcl-peicy5荧光接枝率约为2.2％。pcl-pei聚合物中pei为亲水链而pcl为疏水链，其能在水溶液中自组装形成胶束。选用芘荧光探针测定pcl-pei的临界胶束浓度(cmc)，以338nm和333nm荧光强度的比值(i338/i333)与聚合物浓度拟合曲线，曲线拐点处浓度为聚合物cmc。由图2c所示，随着聚合物浓度的逐渐增大，芘的激发光强度迅速增大，最大激发波长逐渐由333nm红移至338nm，pcl-pei在浓度为0.1～0.2nmol·l^-1附近开始出现荧光强度的突变。通过对i338/i333与聚合物浓度拟合曲线，计算拐点处的浓度pcl-pei的cmc值分别为0.113nmol·l^-1(图2d)。该cmc值要小于同分子量聚己内酯-聚乙二醇聚合物的cmc值，原因主要由于pei的亲水性弱于聚乙二醇，pei更能促成自组装形成胶束结构。

脂质材料dspe-peg-nhs和肾脏靶向肽序列nh2-kcsavplc-cooh进行偶联反应，脂质材料中的活性酯与多肽序列中的氨基极易发生偶联反应，反应效率高，是多肽或抗体修饰中最常用的反应类型。经透析纯化后即可得到dspe-peg-ktp(约144mg，产率75.4％)。商品化的dspe-peg-nhs的质荷比分布在2300～3300m/z范围内，多肽序列nh2-kcsavplc-cooh的质荷比为820m/z，两者偶联时需要脱去活性酯n-羟基琥珀酰亚胺(115m/z)，因此dspe-peg-ktp理论质荷比分布位于3000～3900范围内，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)验证，成功合成了肾脏靶向肽修饰的脂质材料dspe-peg-ktp(图3)。

3.2药物测定方法

经hplc测定，以峰面积a为纵坐标，浓度c为横坐标拟合标准曲线，rh在0.5～40μg·ml^-1范围内呈良好的线性关系，回归方程：a＝71.272c-12.817，r²＝0.9998。低中高浓度rh溶液的日内和日间精密度rsd分别为0.54％、0.47％、0.58％和1.05％、0.86％、0.72％，均小于2％。按处方量的80、100、120％加入rh后，回收率分别为96.63±2.38、97.01±0.75、97.27±1.56％，均符合方法学要求。

3.3纳米粒的制备和表征

制备得到的ppr混悬液呈浅黄色、乳光明显，经荧光探针cy5标记后ppcy5r呈现一定的淡蓝色，平均粒径为(36.4±4.7)nm，zeta电位为(20.9±5.6)mv，呈圆球颗粒，大小均匀，分布良好，粒子之间未见明显粘连及团聚现象(图4a和a)。制备的空壳脂质囊，在透射电镜下观察呈现油滴态不规则形状，平均粒径为(87.3±6.6)nm，zeta电位为(-12.4±2.8)mv(图4b和b)。制备得到的klppr脂质囊纳米粒具备明显的核壳结构，内核为正电性的ppr，外壳为负电性的脂质囊，两者通过正-负静电相互作用，脂质囊包裹于ppr上构成核壳结构klppr，其大小均匀，分布良好，平均粒径为(59.5±6.2)nm，zeta电位为(-3.7±4.3)mv(图4c和c)。采用同样的制备方法，以荧光标记的pcl-peicy5为载体材料，制备得到荧光标记的klppr(klppcy5r)；未加入肾脏靶向肽脂质dspe-peg-ktp情况下，制备得到未经肾脏靶向肽修饰的对照大黄酸纳米脂质囊(lppr)和荧光标记的未经肾脏靶向肽修饰的对照大黄酸纳米脂质囊(lppcy5r)，制备得到的这些纳米粒粒径均分布在60±10nm、zeta电位为(-5±5)mv、pdi在0.1～0.2之间范围内，与klppr基本保持一致。采用高速离心法考察纳米粒的包封率和载药量，经hplc测定，klppr包封率为(90.22±4.26)％，载药量为(5.17±0.69)％，聚合物中pei链的氨基重复单元可以与rh的羧酸根和酚羟基形成酸碱离子对，能够显著提高rh的包封率和载药量。

3.4体外释药考察

rh原药溶液(rh-sol)、ppr和klppr的体外释药曲线如图5所示，rh-sol在释放介质中释药很快，4h内时药物累计释放率接近90％。ppr释药行为可以分为突释和缓释两相，开始时释放较快，2h时内药物的累积释放百分率约为40％，随后释药曲线渐趋平稳，缓慢释药，于48h时累积释放百分率为74.3％。klppr释药曲线更加平稳，具有明显的缓控释特性，3h内药物的累积释放百分率约为25％，没有显著的突释现象，于48h内累积释放百分率为61.8％。在ppr中，rh除了以疏水作用的物理包埋方式荷载于纳米粒，其次rh的羧酸根以及酚羟基能与聚合物pei链的氨基形成酸碱离子结合，以离子对的形式吸附荷载于纳米粒外层，释药过程中外层的药物较容易释放，因而出现突释问题。经过脂质囊包裹后，吸附荷载于纳米粒外层的药物也一并被包裹于内核中，因此klppr没有突释现象，始终能够缓慢平稳的释放药物。

采用经典的零级动力学模型、一级动力学模型、higuchi模型对klppr体外释药特性进行方程拟合，如表1所示，klppr在pbs缓冲液中的释药曲线符合higuchi模型方程，为q＝0.979t^1/2+0.0648(r²＝0.8655)，证明为缓释制剂。

表1klppr体外释药曲线方程拟合

3.5细胞溶血和细胞毒性考察

采用兔红细胞考察ppr和klppp细胞溶血现象，如图6a所示，随着聚合物浓度的增加，ppr和klppp均出现溶血现象，ppr的红细胞溶血率高于klppr，但在低于0.5mmol·l^-1时两者的红细胞溶血率均小于5％，具有良好的溶血耐受性。采用mtt法分别测定了未载药时空白纳米粒的细胞毒性和载药后纳米粒的细胞毒性，如图6b和c所示，空白纳米粒对hk-2细胞具有良好的生物安全性，在聚合物浓度达到0.5mmol·l^-1时，hk-2细胞的生活率仍然保持在90％以上。包载rh后，由于rh本身具有抑制细胞生长的药理作用，因此随着聚合物浓度的增加，ppr和klppp对hk-2细胞具有一定的细胞毒性，并且klppp的效果要优于ppr，间接表明klppp可以促进细胞的摄取内吞。

3.6细胞摄取效率和摄取机制考察

纳米粒在不同时间点的细胞摄取情况如图6d所示，各纳米粒随着孵育时间的延长不断被摄取进入细胞中，荧光强度不断增加。lppcy5r摄取较为缓慢，在120min时能够达到被完全摄取，而细胞对klppcy5r和ppcy5r摄取迅速，30min内超过60％的纳米粒被摄取进入细胞，60min基本达到完全摄取，具有较高的摄取效率。由于细胞膜表面分布各类的蛋白和磷脂，为负电特性，ppcy5r有较强的正电，能够与带负电的细胞膜相互吸引，促进摄取内吞进入细胞，提高摄取效率；而经过肾靶向肽修饰的klppcy5r在ktp的导引下，能够主动识别hk-2细胞，从而促进细胞摄取，其摄取效率明显高于lppcy5r。虽然荷正电的ppcy5r也具有较高的细胞摄取效率，但是正电性在生理环境下极容易吸附蛋白，导致纳米粒不稳定，而且带正电性的纳米粒在体内会快速经网状内皮系统吞噬而被代谢消除，不能应用于静脉注射给药。

随后进一步考察了肾脏靶向肽ktp对纳米粒摄取效率的影响，如图6e所示，随着细胞培养液中提前孵育的ktp浓度的增加，klppcy5r的摄取效率逐渐降低，在1μmol·l^-1的ktp情况下，klppcy5r降低至与lppcy5r摄取效率基本一致，而ktp对ppcy5r和lppcy5r的摄取效率没有影响，验证ktp修饰能够提高klppcy5r的细胞摄取效率。

实验中选用氯丙嗪(50μm)、非律平iii(7.5μm)、渥曼青霉素(5μm)和细胞松弛素d(5μm)以及低温4℃条件进行预孵育处理细胞。经流式细胞仪测定发现(图6f)，氯丙嗪和低温都能够显著抑制ppcy5r的内吞摄取效率，细胞阳性率由95％降低到35％和48％，而非律平iii、渥曼青霉素和细胞松弛素d对ppcy5r细胞内吞没有影响，细胞阳性均大于85％，表明ppcy5r是以能量依赖的网格蛋白介导内吞途径进行摄取。然而，四种内吞抑制剂对klppcy5r和lppcy5r的细胞阳性率均有一定的影响，但都不显著。正常摄取时两者的细胞阳性率分别为96％和95％，氯丙嗪预孵育后，两者的阳性率分别为70％和74％；其他三种内吞抑制剂于处理后，klppcy5r和lppcy5r的细胞摄取阳性率仍然高于80％；只有低温使klppcy5r和lppcy5r的细胞摄取阳性率降低到51％和58％，因此表明脂质囊包裹改变了纳米粒的细胞摄取途径，klppcy5r和lppcy5r主要不是通过网格蛋白介的内吞途径摄取进入细胞，而是通过多种混合途径包括网格蛋白介导的内吞的内吞途径、胞膜窖介导的内吞途径、巨胞饮内吞途径和膜融合途径摄取进入细胞，并且膜融合途径可能占主导地位。

3.7纳米粒的细胞内分布考察

激光共聚焦显微镜观察ppcy5r和klppcy5r摄取入胞过程，如图7所示，ppcy5r和klppcy5r均能够迅速被摄取入胞，15min纳米粒多分布于细胞周围，ppcy5r由于正电性而促进其与细胞膜的粘附作用，而klppcy5r由于表面修饰的肾脏靶向肽可促进并引导其与细胞膜的接触。1h时ppcy5r和klppcy5r均大部分摄取进入细胞，摄取入胞的ppcy5r完全进入了溶酶体(红色与绿色重合显黄色)，而klppcy5r则没有进入溶酶体(红色与绿色不重合)。3h时ppcy5r仍然大部分困陷于溶酶体中，少部分从溶酶体逃逸出来，而klppcy5r仍然没有困陷于溶酶体中，在细胞质内各处分布，甚至细胞核内也有分布，显示出避开溶酶体分布的特性。如果药物无法从溶酶体中尽快逃逸释放进入细胞质中，可能会被逐渐分解变质而丧失活性，而klppcy5r能够逃避溶酶体“陷阱”，为药物发乎药效提供了有利条件，同时再次验证其摄取途径是以膜融合途径为主导的多种混合途径摄取入胞。

3.8糖尿病肾病小鼠模型的构建

一次性高剂量腹腔注射链脲佐菌素(200mg/kg)用于快速损伤破坏胰岛细胞是制造1型糖尿病模型的经典方法，通过监测小鼠空腹血糖和体重变化来判断是否造模成功。健康对照小鼠(hc)空腹血糖能够维持在6.3±0.9mmol/l，注射链脲佐菌素3d后，小鼠空腹血糖上升至18.5±2.2mmol/l，当空腹血糖≥15mmol/l则为糖尿病模型。随着时间延续和病程加重，注射链脲佐菌素的小鼠空腹血糖继续增高并最终维持在23.9±1.7mmol/l，此时大量葡萄糖和蛋白质经肾脏流失，引起小鼠体重明显下降，5周后体重降至17.5±1.2g(hc组体重为24.5±1.6g)，此时小鼠病程由初期的糖尿病模型恶化进展为dn模型。

3.9纳米粒在糖尿病肾病小鼠的体内分布

小鼠尾静脉注射lppcy5r和klppcy5r后随即全身分布，随着时间进行，血液中的lppcy5r和klppcy5r开始富集到各脏器组织和代谢清除。由图8a所示，lppcy5r和klppcy5r均主要分布于小鼠胸腹部，并且lppcy5r膀胱部位呈现较强的荧光。取尿液观察并进行荧光定量分析(图8b)，注射lppcy5r小鼠的尿液荧光强度显著高于klppcy5r小鼠，约为2.4倍，表明lppcy5r容易经尿液清除而不能有效被肾脏组织截留和肾脏细胞摄取。将小鼠解剖后准确观察lppcy5r和klppcy5r在各脏器组织分布特点并进行荧光定量分析，lppcy5r组小鼠的肝肺荧光强度最高，其次肾肠，心脾脑较弱，而klppcy5r组小鼠的肾荧光强度最高，肝肺肠其次，心脾脑最弱。klppcy5r组小鼠肾脏的荧光强度约是lppcy5r组的2.6倍，而且klppcy5r组小鼠肾脏荧光强度是肝肺肠的2～4倍、是心脾脑的7～20倍，表明klppcy5r具备优异的肾脏靶向分布特性，其能有效的实现肾脏组织截留和肾脏细胞摄取，为治疗肾脏疾病提供了有利保障。

3.10纳米粒对糖尿病肾病小鼠治疗作用

随着对dn小鼠的给药治疗，lantus组小鼠血糖迅速下降，空腹血糖维持在9～12mmol/l，小鼠体重逐渐增加。rh-sol、lppr和klppr组小鼠血糖逐渐降低，最终空腹血糖降至17～21mmol/l范围内，略小于dn组的24mmol/l，与正常组hc仍有较大差距(图9a)；lantus、lppr和klppr组小鼠体重逐渐增加，显著大于dn组小鼠，而rh-sol组小鼠在给药5次后体重才开始出现一定的增加。实验结束时lantus和klppr组均较好的改善小鼠的血糖和体重指标，而rh-sol和lppr治疗效果较为微弱(图9b)。治疗终止时，测定各组小鼠的血液和尿液生化指标，与dn组相比，klppr和lppr组均能够显著降低小鼠的尿蛋白、血尿素氮和血肌酐水平，减低肾指数，同时提高尿肌酐水平和肌酐清除率，并且klppr组要优于lppr组；与rh-sol相比，klppr能够显著性的提高rh的治疗效果(图9c-h)。lantus和rh-sol各生化参数相近，两者治疗效果基本相当，均弱于klppr和lppr组。klppr能够有效改善患病小鼠的肾脏功能损伤和提高肾脏机能，klppr将尿肌酐和肌酐清除率提高到2.79±0.17mmol/l和1.90±0.12ml/min·kg(dn组为1.22±0.15mmol/l和0.93±0.07ml/min·kg)，将尿蛋白、血尿素氮、血肌酐和肾指数水平降低至1.23±0.18mg/24h、9.5±1.43mmol/l、42±7.6μmol/l和1.33±0.14(dn组为3.45±0.46mg/24h、17.6±3.24mmol/l、108.7±12.5μmol/l和1.96±0.13)。

肾脏h&e染色和pas染色显示dn组小鼠表现出糖尿病肾病并发症特征，肾小球增大并硬化，膜基质扩张，系膜区增宽，基底膜增厚，肾小管及血管丛损伤严重；pas染色dn组肾脏，其肾小球基底膜和系膜基质呈现浓重的紫红色，并且浸润扩展至整个肾小囊腔室，表明肾小球基底膜增厚严重，系膜基质大量增生和积聚。粘连蛋白是糖尿病肾病病程恶化中一种典型的细胞外基质蛋白组分，参与构成肾小球基底膜和系膜基质，在肾纤维化和肾小球硬化中发挥重要作用，免疫组化染色后dn组肾小球呈现深棕色阳性，表明造模后的肾小球粘连蛋白分泌激增，沉积聚集在肾小球内呈现伴随肾小球基底膜的增厚和系膜基质的积聚。给予lantus、rh-sol、lppr和klppr组治疗后，各给药组病程均有所改善，h&e染色和pas染色显示lantus、lppr和klppr组能够显著抑制肾小球增大，改善肾小球脉管循环，减少管腔容积，抑制系膜基质增生和肾小球基底膜增厚，并且klppr组要优于lantus和lppr组(图10a和b)。免疫组化染色显示，lantus和rh-sol对减少粘连蛋白的分泌和积聚疗效较弱，lppr和klppr组能够显著抑制粘连蛋白分泌和积聚，阻止糖尿病肾病的恶化，并且klppr组要优于lppr组(图10a和c)。

tgf-β1和smad2/3是肾功能损伤中的代表性蛋白，该类蛋白构建的信号通路是高血糖、细胞因子等多种生化因素引起肾损伤的共同重要中介，与糖尿病肾病细胞增殖、肾小球肥大及糖尿病肾肾病细胞外基质蛋白积聚密切相关，也与肾间质纤维化、肾小球滤过屏障的损伤密切相关。通过western-blot分析各实验组肾组织中tgf-β1和smad2/3蛋白的表达，与dn组相比，lppr和klppr组能够显著低肾脏组织tgf-β1的表达水平和提高smad2/3的表达水平以阻止炎症通路的发展，lantus和rh-sol只对smad2/3表达具有显著性影响而对tgf-β1的表达影响较弱；与rh-sol组相比，klppr能够显著的提高rh的药理疗效(图10d-g)。rh对治疗糖尿病肾病可作用于tgf-β和smad2/3信号通路：抑制肾脏细胞tgf-β1的mrna转录表达，保护肾脏固有功能；直接干扰smad2/3的磷酸化，阻止病程恶化信号通路的传导；rh对治疗糖尿病肾病的干预中发挥着多靶点多层次的治疗作用。通过klppr对rh的包载和递送，赋予rh肾靶向分布的特性，从而实现了对糖尿病肾病的有效治疗。

4.结论

本发明成功合成了聚合物pcl-pei和肾靶向肽修饰的脂质材料dspe-peg-ktp，制备了肾脏靶向肽修饰的核壳结构大黄酸脂质囊纳米粒(klppr),该脂质囊纳米粒对rh具有较高的包封率和载药量，粒径分布均匀，体外释药具有缓释特性，细胞摄取迅速，具备不进入溶酶体的特性，具有良好的生物安全性；在链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病小鼠模型中，klppr具备良好的肾脏靶向分布特性，能够显著改善糖尿病肾病小鼠多项病理指标，缓解和逆转糖尿病肾病的病程恶化，有效提高rh对糖尿病肾病的治疗作用。本发明为靶向治疗糖尿病肾病提供了一种全新的策略，将进一步促进rh药物的临床转化，为rh及同类药物新型纳米制剂的研究提供重要参考。