一种刚毛藻粗多糖的抗病毒用途的制作方法

本发明涉及医药技术领域，具体涉及刚毛藻粗多糖在制备和抑制呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytialvirus，rsv）、肠道病毒71型（humanenterovirus71，ev71）和单纯疱疹病毒1型（herpessimplexvirus1，hsv-1）药物中的应用。

背景技术：

刚毛藻（cladophora）绿藻纲，刚毛藻科，一年或多年生，藻体为多细胞分支或不分支丝状体，分支为互生、对生型，细胞长筒形，幼体为一个网状叶绿体，成体为多个颗粒状，淀粉核多个，细胞核多个，细胞壁厚，具纹层，最外层为几丁质，顶端生长或间生长，或兼有两者，可无性生殖或产生游孢子，有性生殖为同配接合，生活史为同型世代交替，约160种。刚毛藻是属于相当高等的藻类，其体内所含有的叶绿素与高等植物是一样的，都是叶绿素a与b。刚毛藻对於低co2的适应能力很强，当水中co2不足时，很快就能利用hco3^-来当成碳元素的来源，而不像其他水草还需要一段的时间来适应。所以与其说刚毛藻被视为低co2的指标，不如说刚毛藻对低co2环境适应比一般水草还要快，因此而广布于淡水、半咸水及海水中。

目前我国131个主要湖泊中，已达富营养程度的湖泊有67个，对湖泊富营养化的防治应着眼于中性的回复湖泊原有的以水生高等植物为主的生态系统，在进行生态恢复的实践过程中，随着水质的好转，丝状绿藻大量生长。刚毛藻是一种大型丝状绿藻，能在沿岸水域大量生长，在沿岸带组成了一个复杂的附生群落。刚毛藻不仅是初级生产力的重要组成部分，还能够使沿岸带的功能性表面积增加，改善水质，在生态系统中有着重要的作用跟功能。

目前国内对于刚毛藻的研究停留在初级阶段，主要研究了刚毛藻的生长条件（郭亮亮,周维成,周起超,李根保.光照强度和磷浓度对寡枝刚毛藻生长的影响[j].中国环境科学,2015,35(07):2153-2159.）；对磷的去除情况（张新龙,孙力平,钟远.刚毛藻对不同形态磷的去除[j].环境工程学报,2017,11(05):2743-2747.）；对水中氮磷的控制情况（叶碧碧,曹德菊,张良昆,彭娟,杨旻.刚毛藻对水中n、p的控制及其环境条件研究[j].安徽农业大学学报,2011,38(04):575-578.）；对水质的治理情况（况琪军,凌晓欢,马沛明,胡征宇.着生刚毛藻处理富营养化湖泊水[j].武汉大学学报(理学版),2007(02):213-218.）等等。刚毛藻主要成分为多糖类物质，但现有技术中没有检索到对刚毛藻中有效成分的研究状况，本研究着重设计了刚毛藻中的粗多糖的分离纯化工艺以及粗多糖的药理研究，从更深更广的层次上利用刚毛藻，使其变废为宝。

rsv是一种rna病毒，属副粘液病毒科。该病经空气飞沫和密切接触传播。多见于新生儿和6个月以内的婴儿。成人和年长儿童感染后，主要表现为上呼吸道感染。ev71主要引起手足口病，还可引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等多种神经系统疾病。手足口病和中枢神经系统感染是ev71感染而引起的两大常见临床症状。现已成为世界范围内的公共卫生问题。hsv-1是一种由单纯疱疹病毒所致的病毒性皮肤病，中医称为热疮。

现有技术刚毛藻应用于活藻体净化水体氮、磷等物质的报道，未发现有关刚毛藻粗多糖用途的技术，更未见报道其抗病毒用途。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种刚毛藻粗多糖的用途。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种刚毛藻粗多糖的抗病毒用途，所述刚毛藻粗多糖具有抗病毒活性，所述刚毛藻粗多糖的应用是指具有抗病毒活性的所述刚毛藻粗多糖为制备抗rsv或ev71或hsv-1病毒药物中的应用。

进一步，所述刚毛藻粗多糖用于制备治疗呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytialvirus，rsv）的药物、肠道病毒71型（humanenterovirus71，ev71）的药物和单纯疱疹病毒1型（herpessimplexvirus1，hsv-1）的药物的用途。

上述刚毛藻粗多糖的制备方法，步骤如下：

1）将刚毛藻干燥后磨粉制备刚毛藻粉末，将制备的刚毛藻粉末与蒸馏水混合后100℃下水煮12~16h，其中，所述刚毛藻粉末与蒸馏水的质量比为1:100，然后将煮好后的料液倒出放置10min后将上清液与残渣分离，

然后，将上清液在离心速度3000r/min下离心20min去除沉淀后，再将离心后的上清液旋转浓缩至粘稠状态；

2）三氯乙酸饱和溶液和粘稠的上清液按照体积比为15:（70~100）的比例混合后放置冰箱内冷冻4h后，在离心速度3000r/min下离心15min除去蛋白质，然后将离心处理后的溶液透析后冷冻；

3）取出冷冻后的溶液，用流水透析2天、用去离子水透析3天除掉盐以及小分子物质后倒出，向透析后的液体中加入95%乙醇至乙醇体积分数达到总体积的80%，静置后产生白色絮状物过滤得到沉淀，将沉淀在烘箱内烘干即为刚毛藻粗多糖成品。

本发明的有益效果是：

本发明建立了一种刚毛藻粗多糖组分的提取纯化体系，首次提出了所述刚毛藻粗多糖具有抗ev71、rsv、hsv-1病毒的功效，在治疗病毒感染性疾病领域存在潜在的应用价值。

附图说明

图1为实施例感染ev71病毒的显微镜照片的rd细胞出现cpe示意图（200）。

图2为实施例受到刚毛藻粗多糖保护的rd细胞显微镜图片（200）。

具体实施方式

实施例1刚毛藻粗多糖对病毒的作用研究

（1）制备刚毛藻粗多糖提取物：

取刚毛藻粉末中加入蒸馏水，料液比为1：100，在100℃的沸水中蒸煮12~16h，破碎细胞壁获取其中多糖等组分，将煮好后的料液倒出放置10min后将上清液倒出，残渣除去，将上清液在3000rpm的条件下离心20min进一步去除沉淀，将离心后的上清液旋转浓缩至粘稠状态，加入三氯乙酸饱和溶液和粘稠的上清液体积比为15:85后放置冰箱内冷冻4h后，离心处理除去蛋白质，然后将离心处理后的溶液透析后冷冻；取出后用流水透析2天、去离子水透析3天除掉盐以及小分子物质，向透析完的液体中加入95%乙醇至乙醇体积分数达到总体积的80%，静置后产生白色絮状物过滤得到沉淀，将沉淀在烘箱内烘干即为刚毛藻粗多糖成品。

（2）细胞株与病毒株：

ma104：恒河猴胚胎肾细胞，为ev71、coxa16敏感细胞；hep2：人喉癌上皮细胞，为rsv敏感细胞；mdck：狗肾细胞，为流感病毒敏感细胞；ev71：分离自济南市传染病医院手足口病患者粪便标本，基因测序鉴定为肠道病毒71型c4亚型，genbank登录号：hq825317，本单位保存；rsv：引自中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，本单位保存；hsv-1：引自山东大学医学院。

（3）细胞毒性测定：

将细胞培养瓶内细胞消化分散，分别以105/ml细胞浓度接种96孔板，5%co2、37℃培养，待长成单层，备用。将受试药物用细胞维持液从1﹕2开始做倍比系列稀释，接种于多孔板中已经长成单层的相应细胞上，每个稀释度设重复3孔，37℃、5%co2培养，每日镜下观察其cpe，连续3d观察药物毒性。cpe大于50%视为毒性。得到其半数中毒浓度(toxicconcentration50%,tc50)。

（4）抑毒实验：

将细胞培养瓶内细胞消化分散，分别接种96孔板，5%co2、37℃培养，待长成单层，备用。将受试药物用细胞维持液做2倍比稀释共12个浓度，依次加入96孔板内的单层细胞上(50μl/孔)，设细胞对照、病毒对照，每个稀释度设重复3孔。除细胞对照外，各孔加100个tcid50的病毒50μl。35℃、5%co2培养，每日显微镜下观察细胞病变，待病毒对照出现90%细胞病变后终止培养。镜下观察其cpe，病变率小于10%为“-”，病变率在10%-25%之间为“++”，在50%-75%之间判为“+++”，大于75%为“++++”。cpe发生50%的稀释度视为药物半数有效浓度(concentrationfor50%ofmaximaleffect,ec50)。

（5）计算抑毒指数(therapeuticindex,ti)：

根据上述药物半数中毒浓度(tc50)及药物半数有效浓度(ec50)，获得药物抑毒指数(ti)。

（6）结果如下表1所示：

表1抑制病毒效果

从图1、2显示，ev71病毒在rd细胞中cpe为细胞出现变圆、脱落、聚集等特征，刚毛藻多糖粗提物给药后，rd细胞受保护，表现出细胞完整、突触清晰、细胞质比较均匀、细胞贴壁生长，显示刚毛藻多糖粗提物对ev71病毒具有显著的抗病毒活性。

利巴韦林（ribavirin，俗称病毒唑）是一种广谱强效的抗病毒药物，对ev71、hsv和rsv等多种病毒都有抑制作用。λ-卡拉胶中主要功能单元是硫酸多糖，一般认为λ-卡拉胶的抗病毒活性在于硫酸多糖的作用。但从表1可以看出，λ-卡拉胶（功能成分为硫酸多糖）对ev71、hsv和rsv病毒抑制效果明显低于刚毛藻粗多糖效果（且只对ev71有抑制效果，对另外两种没抑制效果），相比于利巴韦林和λ-卡拉胶，刚毛藻多糖粗提取物对ev71、hsv和rsv均具有更好的抑制作用并且对ev71的抑制程度最为明显，ti高达1989.95。这一方面说明刚毛藻粗多糖对上述三种病毒活性的作用机理并不在于硫酸多糖，另一方面说明刚毛藻多糖粗提物质对ev71病毒感性疾病领域存在巨大的应用价值，对研制抗ev71病毒的药物提供了新的思路，具有重要的参考价值。

本例验证了刚毛藻多糖粗提取物对ev71、hsv和rsv均具有抑制作用。粗多糖中混有寡糖、低聚糖、糖蛋白以及不同分子量范围的多糖等成分，刚毛藻粗多糖的化学结构组成、功能团和结合形态等差异均可能对病毒起抑制作用，其作用机理需要进一步深入研究。本发明根据刚毛藻粗多糖的抗病毒性提供了刚毛藻粗多糖制备抗病毒药物的抗病毒应用，所述病毒为呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytialvirus，rsv）、肠道病毒71型（humanenterovirus71，ev71）和单纯疱疹病毒1型（herpessimplexvirus1，hsv-1）。