本发明涉及生物医学技术领域，具体为一种人脐带华通氏胶组织工程支架的制备方法。
背景技术：
组织工程皮肤以三维支架为载体，通过将细胞种植在支架上而获得，理想的人工皮肤支架应该同时满足材料和结构的要求，在材料上：1、允许细胞在其表面粘附，促进细胞增殖，保留分化细胞的功能；2、具备降解性，材料及降解产物均无细胞毒性，不会引起炎症；3、具有良好的生物相容性；4、来源广泛，价格低廉，无疾病传播风险等特点，在结构上：1、具备高孔隙率从而为细胞粘附、细胞外基质的再生及细胞扩散提供足够的空间，孔隙结构可以允许细胞在整个支架上分布，从而促进均质组织形成；2、应具有三维支架结构，为特定细胞提供结构支撑作用和模板作用，引导组织再生和控制组织结构。
目前常用作组织工程皮肤支架材料的天然高分子有甲壳素、壳聚糖、海藻酸盐、胶原蛋白、葡聚糖、透明质酸、明胶和琼脂，因为其本身具有相同或类似于细胞外基质的结构，可以促进细胞的黏附，增殖和分化，目前来看，天然材料来源较为广泛，制作简单，且价格低廉，但它也存在力学性能较差，抗原性消除不确定，降解速率不宜控制等问题，具有一定的机械强度。
此外聚合物有良好的生物相容性以及可控的降解速率，力学性能优良，因而被广泛用作制备组织工程支架材料，常用的有聚乳酸、聚氨酯、聚环氧乙烷等，目前的研究主要集中于通过对材料表面的改性而增强它对细胞的粘附性，以及材料的亲水性。
聚合物共混是一种为组织工程提供新型理想材料的有效方法，已成为目前组织工程生物材料研究的热点。近年来提出的复合材料有海藻酸钠/壳聚糖、胶原/壳聚糖、胶原/琼脂糖、壳聚糖/明胶、壳聚糖/聚己内酯、聚乳酸/聚乙二醇等体系。
组织工程是近年来兴起的修复缺损组织的方法，为治疗皮肤缺损带来了新的希望。组织工程包含三方面要素，即支架、种子细胞和细胞因子，目前架材料主要包括两大类，即合成材料和天然材料，天然材料成分接近天然皮肤，细胞毒性小，生物相容性好。脐带华通胶中无血管滋养管、神经和淋巴结构，结构特征也与软骨类似，同时因其属于分娩废弃物，不存在伦理问题，且来源丰富，基于上述特征，我们认为脐带华通胶可能是一种较好的软骨组织工程支架材料的来源。
技术实现要素：
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种人脐带华通氏胶组织工程支架的制备方法，解决了现有的支架存在力学性能较差，抗原性消除不确定和降解速率不宜控制的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种人脐带华通氏胶组织工程支架的制备方法，具体包括以下步骤：
s1、华通氏胶分离；将新鲜脐带去除血管，然后进行剪碎；
s2、机械粉碎：将s1剪碎的华通氏胶加入生理盐水，然后摇匀成浆；
s3、反复冻融：将s2匀浆液分装冻存管液氮冻存23-25小时，37摄氏度复温1-1.5小时，重复3次；
s4、差速离心：将s3冻融好的匀浆液1800g离心15-22分钟，保留上清液，加入0.8-1％tritinx-100、0.2-0.25％胰酶、tris-hcl缓冲液，在3-5摄氏度搅拌23-25小时，2500g离心25-33分钟，收集上清，加入dnase和rnase，并在37摄氏度消化15-18小时，4摄氏度3800g离心15-22分钟，调节ph至7.0，取上层匀浆4摄氏度10000g离心35-45分钟，收集沉淀；
s5、化学交联：将s4收集到的沉淀调整为3％(w/v)混悬液，充分搅拌均匀，注入聚乙烯模具中，在零下20摄氏度预冻25-35min，放入冷冻干燥机中进行冻干，48h后形成三维多孔海绵支架，然后将支架置于258nm波长紫外线照射下交联6-10h，再于含20mmol/ln-羟基琥珀酰亚胺和50mmol/l乙基-二甲基胺-丙基碳化二亚胺的95％(v/v)乙醇溶液中，在4摄氏度下交联23-25h，之后在无菌pbs漂洗浸泡1-2h，三蒸水漂洗去除残余交剂，再次冻干，然后密封袋保存，并进行60co照射消毒，最后在4摄氏度条件下保存备用；
s6、工程支架的制备：将s5得到的华通氏胶组织接种于支架上，使细胞黏附于支架孔壁上，并使细胞正常生长，然后分泌基质，进行免疫试验。
优选的，所述s1中的华通氏胶组织来源于新生儿脐带组织。
优选的，所述步骤s6制备的组织工程支架可用于医疗和美容等领域。
(三)有益效果
本发明提供了一种人脐带华通氏胶组织工程支架的制备方法。与现有技术相比具备以下有益效果：该人脐带华通氏胶组织工程支架的制备方法，具体包括以下步骤：s1、华通氏胶分离；将新鲜脐带去除血管，然后进行剪碎，s2、机械粉碎：将s1剪碎的华通氏胶加入生理盐水，然后摇匀成浆，s3、反复冻融：将s2匀浆液分装冻存管液氮冻存23-25小时，37摄氏度复温1-1.5小时，重复3次，s4、差速离心：将s3冻融好的匀浆液1800g离心15-22分钟，保留上清液，加入0.8-1％tritinx-100、0.2-0.25％胰酶、tris-hcl缓冲液，在3-5摄氏度搅拌23-25小时，2500g离心25-33分钟，收集上清，加入dnase和rnase，并在37摄氏度消化15-18小时，s5、化学交联：将s4收集到的沉淀调整为3％(w/v)混悬液，充分搅拌均匀，注入聚乙烯模具中，在零下20摄氏度预冻25-35min，放入冷冻干燥机中进行冻干，48h后形成三维多孔海绵支架，然后将支架置于258nm波长紫外线照射下交联6-10h，s6、工程支架的制备：将s5得到的华通氏胶组织接种于支架上，使细胞黏附于支架孔壁上，并使细胞正常生长，然后分泌基质，进行免疫试验，可实现通过采用去细胞、冻干及交联的方法，制备出去细胞人脐带华通胶组织工程用支架，制备的组织工程支架保留了华通氏胶中糖胺多糖和ii型胶原等成分，接种于支架上的细胞黏附于支架孔壁上，生长状态良好，分泌基质，体试验无免疫反应，产品具有很好的应用前景，从而大大提高了支架的力学性能，很好的消除了抗原性，达到了降解速率可控的目的。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供两种技术方案：一种人脐带华通氏胶组织工程支架的制备方法具体包括以下实施例：
实施例1
具体包括以下步骤：
s1、华通氏胶分离；将新鲜脐带去除血管，然后进行剪碎，华通氏胶组织来源于新生儿脐带组织；
s2、机械粉碎：将s1剪碎的华通氏胶加入生理盐水，然后摇匀成浆；
s3、反复冻融：将s2匀浆液分装冻存管液氮冻存24小时，37摄氏度复温1小时，重复3次；
s4、差速离心：将s3冻融好的匀浆液1800g离心20分钟，保留上清液，加入1％tritinx-100、0.25％胰酶、tris-hcl缓冲液，在4摄氏度搅拌24小时，2500g离心30分钟，收集上清，加入dnase和rnase，并在37摄氏度消化16小时，4摄氏度3800g离心20分钟，调节ph至7.0，取上层匀浆4摄氏度10000g离心40分钟，收集沉淀；
s5、化学交联：将s4收集到的沉淀调整为3％(w/v)混悬液，充分搅拌均匀，注入聚乙烯模具中，在零下20摄氏度预冻30min，放入冷冻干燥机中进行冻干，48h后形成三维多孔海绵支架，然后将支架置于258nm波长紫外线照射下交联8h，再于含20mmol/ln-羟基琥珀酰亚胺和50mmol/l乙基-二甲基胺-丙基碳化二亚胺的95％(v/v)乙醇溶液中，在4摄氏度下交联24h，之后在无菌pbs漂洗浸泡2h，三蒸水漂洗去除残余交剂，再次冻干，然后密封袋保存，并进行60co照射消毒，最后在4摄氏度条件下保存备用；
s6、工程支架的制备：将s5得到的华通氏胶组织接种于支架上，使细胞黏附于支架孔壁上，并使细胞正常生长，然后分泌基质，进行免疫试验，制备的组织工程支架可用于医疗和美容等领域。
实施例2
将支架于培养液中浸泡20min后置于6孔板中，人脐带间充质干细胞以1×107个/ml的密度接种至支架上，37摄氏度孵育2h，待细胞黏附于支架后，加入完全培养液2-3ml/孔，于37摄氏度、5％co2细胞培养箱内培养2-3d，电子显微镜观察细胞形态及黏附情况，电子显微镜下可见细胞生长状态良好，并有基质分泌。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。