一种多肽在制备预防和治疗人乳头瘤病毒感染制剂的应用的制作方法

本发明涉及一种医药
技术领域：
的新型抗病毒多肽，具体是涉及一种多肽用于预防和控制人乳头瘤病毒感染的用途。
背景技术：
：人乳头瘤病毒(hpv)属于乳头瘤病毒科(papillomaviridae)，是一类嗜上皮性无被膜双链dna病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖，表现为寻常疣、生殖器疣(尖锐湿疣)等症状。随着性病中尖锐湿疣的发病率急速上升和宫颈癌、肛门癌等的增多，hpv感染越来越引起人们的关注。hpv的亚型很多，在人体的皮肤及粘膜组织中分离出的hpv被划分为100多个亚型，又可根据其致癌性可分为“低危”型和“高危”型，低危型(如6，11型)主要与生殖器疣和低度的宫颈上皮坏死有关，高危型的代表如第16，18型，其长期感染是引发组织恶性肿瘤尤其是宫颈癌的主要原因。目前，在国际上能有效预防和控制hpv病毒感染的药物还相对缺乏，药物治疗宫颈hpv感染常用干扰素如辛复宁(重组人干扰素ɑ2b阴道泡腾胶囊)，通过诱导靶细胞内产生有酶活性的抗病毒蛋白，抑制病毒核酸的复制和转录，但其疗效和毒副作用仍存在争议。预防型的hpv疫苗能帮助女性预防大多数常见宫颈癌相关的hpv亚型，但并不能预防所有类型病毒株的感染，且疫苗价格高昂，此外，其对已感染相关型别的女性没有治疗作用。因此，急需研发新型预防与控制hpv的药物制剂。抗菌肽是一类碱性多肽，一般由12～50个左右氨基酸组成，具有广谱抗菌性。除抗菌作用，不同种类的抗菌肽还具有抗病毒、抗原虫、抗癌细胞、炎症调节、促进伤口愈合、免疫调节等作用。hpv为无被膜病毒，由于抗菌肽一般通过细胞膜对微生物起到抗抑作用，因此，最初，人们认为抗菌肽对hpv没有抑制作用。然而，后期的发现表明某些抗菌肽对无被膜病毒是有作用的，其对无胞膜病毒的抗病毒机理可能不同于有胞膜病毒。但即使如此，相同来源不同序列的抗菌肽对hpv的作用也可能是不同的。hd5与hd6同属人α-防御素，是由位于小肠内壁褶皱上的专门的分泌细胞潘氏细胞分泌的。一项研究发现，hd5可阻止hpv病毒颗粒脱离内吞囊泡，进而抑制hpv活性，而hd6在最高细胞毒性剂量下对hpv仍无抑制活性(buckcb,daypm,etal.humanalpha-defensinsblockpapillomavirusinfection.procnatlacadsciusa.2006；103(5):1516–21.)。申请人在研究中发现了本发明所述多肽，该多肽为一种抗菌肽，现有技术未见其具有抑制hpv活性的报道，申请人经过实验检测该多肽对hpv的感染具有显著的抑制作用。技术实现要素：申请人发现本发明所述多肽对人乳头瘤病毒具显著抑制作用，针对现有技术的缺陷，本发明的首要目的是提供一种多肽在制备预防和治疗hpv感染制剂的应用，本发明的第二个目的是提供一种预防和治疗hpv感染的多肽制剂，所述多肽制剂是以有效剂量的所述的多肽为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制成的多肽制剂。本发明的第三个目的是提供一种预防和治疗hpv感染的方法。本发明所述多肽的氨基酸序列为seqid:no.1。本发明中的含量，无特殊说明下均为质量百分数。在一个实施方式中，本发明提供一种多肽在制备预防和治疗hpv感染制剂的应用，所述多肽浓度为0.01％-1％。在一个实施方式中，本发明提供一种多肽在制备预防和治疗hpv感染制剂的应用，所述多肽浓度为0.02％-0.2％。在一个实施方式中，本发明提供一种预防和治疗hpv感染的多肽制剂，其特征在于：该组合物是以有效剂量的所述多肽为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制成的多肽制剂。在一个实施方式中，本发明所述的多肽制剂可以以任何适宜的形式施用，例如局部施用，所述多肽制剂可为液体制剂、乳剂(水包油油包水，气雾剂或泡沫剂)、软膏、糊剂、洗剂、粉末、涂沫剂、凝胶、水凝胶、水胶体和乳膏，可以制备成含有脂质体、胶束和/或微球。在一个实施方式中，适于供阴道施用的多肽制剂可以是阴道栓剂、软胶囊、泡腾片、凝胶剂、软膏剂、阴道片、膜剂或泡沫剂。在一个实施方式中，本发明提供一种预防和治疗hpv感染的多肽制剂，所述多肽浓度为0.01％-1％。在一个实施方式中，本发明提供一种预防和治疗hpv感染的多肽制剂，所述多肽浓度为0.02％-0.2％。在一个实施方式中，本发明涉及一种预防和治疗hpv感染的方法，可用于预防和治疗hpv引起的寻常疣、生殖器疣(尖锐湿疣)、扁平疣、跖疣、外阴癌、阴茎癌、前列腺癌、口腔癌等疾病。本发明所述多肽对hpv有较好的抑制作用，向hpv感染部位施用本发明所述多肽制剂，可起到预防与治疗hpv感染的作用。在一个实施方式中，本发明所述的用于预防和治疗hpv感染的多肽制剂可以制成清洁液供男士和女士使用，分别清除男性和女性的hpv感染，切断hpv通过性接触等途径的传染。本发明提供了一种多肽用于制备预防和治疗hpv感染制剂的新用途，除具有hpv抑制作用外，所述可能还具有调节免疫系统、促进破溃愈合的作用。与现有技术相比，该多肽制剂治疗hpv感染效果较好，且对女性生殖道益生菌无抑制作用；本发明所述多肽安全性高，最终降解产物为氨基酸，无不良反应。附图说明图1为所述多肽与hpv16-l1的蛋白互作传感图，图中0n、3.125n、6.25n、12.5n、25.0n、50.0n、100n代表所述多肽浓度分别为：0mg/l、3.125mg/l、6.25mg/l、12.5mg/l、25.0mg/l、50.0mg/l、100mg/l；图2为所述多肽对大肠杆菌的抑菌试验结果；图3为所述多肽对乳酸杆菌的抑菌试验结果；具体实施方式本发明提供了一种多肽用于制备预防和治疗hpv感染制剂的用途，所述多肽无特殊说明均为氨基酸序列为seqid:no.1。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中，加入的各原料除特别说明外，均为市售。本发明所述多肽为一种抗菌肽，已有数据只披露了所述多肽具抗菌功效。申请人在研究过程中，意外的发现本发明所述多肽具有抑制hpv的作用。本发明提供一种预防和治疗hpv感染的多肽制剂，其特征在于：该组合物是以有效剂量的所述多肽为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制成的制剂。本发明所述“有效剂量”是指对使用含本发明所述多肽的制剂的疾病表现出预防或治疗效果的活性成分的量，有效剂量可根据患者的年龄、性别、应用部位、给药次数、给药时间、剂型、辅助剂的种类发生改变。本领域的技术人员能够理解“有效剂量”可以随着给药的方式、载体的使用以及可能和其他治疗剂合用等而有所不同。该剂量可以容易地由本领域的一般技术人员通过进行有限量的剂量应答实验来确定，例如将一系列浓度的给定配方施用于身体的特定位置。“药学上可接受的辅料或辅助性成分”不会破坏本发明所述多肽的抗hpv活性，同时其发挥药物辅料或辅助作用时的用量对人体无毒无害。所述多肽制剂可以包含任何适当的载体、稀释剂或赋形剂。这些包括所有常用的溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、抗真菌和抗菌剂、粘度增强剂、成膜剂、真皮渗透剂、表面活性剂、等张剂和吸收剂等等。本发明中适于供阴道施用的多肽制剂可以是阴道栓剂、洗液、软胶囊、泡腾片、凝胶剂、软膏剂、阴道片、膜剂或泡沫剂。将有效的化学或生物成分添加辅料、载体或辅助性成分制成不同制剂的知识是本领域技术人员熟知的现有技术，具体可参考《药剂学》、《药物结构与制剂》、《药物制剂化学》、《生物药剂学和药物动力学》等。因此，本发明实施例中将仅列举部分剂型产品的配方与生产工艺。本发明所述多肽可通过化学合成，也可以通过基因工程技术表达、分离纯化得到(具体方法可参见sambrooketal.，molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，ny，1989)。本部分实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。本发明首次公开了以所述多肽为药物活性成份在制备治疗与预防hpv感染的应用，因此，以本发明所述多肽单独或与其他物质组合作为药物活性成份与辅料组合制成药剂，只要是该药剂用于治疗与预防hpv感染时，均属于本发明的保护范围。实施例1多肽阴道凝胶的制备(1)配方如下：所述多肽0.04％羟丙基甲基纤维素2％乙基己基甘油0.3％纯化水余量(2)工艺流程将羟丙基甲基纤维素溶胀，再加热复溶至溶液状基材，基材在80度条件下，依次加入所述多肽、乙基己基甘油，充分搅拌混匀，调节ph值至5.5，制成多肽阴道凝胶。实施例2多肽清洁液的制备(1)配方如下：所述多肽0.2％甘油0.5％尼泊金乙酯0.02％乙醇0.32％精氨酸0.6％赖氨酸5％纯化水余量(2)工艺流程将尼泊金乙酯用乙醇溶解待用，将甘油预混搅拌待用，将所述多肽、精氨酸、赖氨酸在纯化水中混合后，加入上一步的甘油溶液中，再加入尼泊金乙酯溶液，搅拌均匀，将ph值调至6.2，制成所述多肽清洁液。实施例3所述多肽与hpv抗原的蛋白质相互作用关系hpv的衣壳由结构蛋白l1和l2组成，单独的l1或l1与l2共表达后可组装成病毒样颗粒，l1蛋白在hpv所有类型中高度保守，参与hpv完整病毒颗粒的包装以及hpv与宿主细胞受体的结合。bia(biomolecularinteractionanalysis)是基于一种表面等离子共振(spr)的物理光学现象的生物传感分析技术，bia可提供实时观察生物分子间相互作用，通过它能观察两种分子结合的特异性，能知道两种分子的结合有多强，还能了解生物分子的结合过程共有多少个协同者和参与者。本实验将利用bia技术观察本发明所述多肽与hpv的l1蛋白之间是否存在互作关系，以探究所述多肽抑制hpv病毒的机理。1.实验试剂：ac4.0：10mm醋酸钠-醋酸缓冲液，ph4.0；2.偶联试剂(氨基偶联)：edc(cas：25952-53-8)：0.4m，750mg以10mlddh2o溶解即可，现配现用；nhs(cas：6066-82-6)：0.1m，115mg以10mlddh2o溶解即可，现配现用；乙醇胺盐酸盐：975.4mg以0.1m硼酸钠(ph8.5)溶解至终体积10ml；hbs-epbuffer：0.01mhepes(ph7.4),150mmnacl，3mmedta，0.05％(v/v)p20；renewbuffer：50mmnaoh；3.主要材料：偶联有重组表达hpv-16l1蛋白的cm5芯片。所述多肽。4.芯片制备：使用购买自abcam公司的hpv-16l1蛋白(货号ab119880)，冻干粉形式的蛋白使用少量运行缓冲液(hbs-ep)溶解。采用edc/nhs法完成偶联。hpv-16l1蛋白结合量约为5300ru。5.实验步骤(1)根据biacore3000使用手册完成仪器准备和预热；并结合cm5芯片的说明书完成芯片准备和溶液平衡。(2)将所购买的hpv-16l1protein冻干粉使用纯水稀释成1mg/ml的蛋白溶液；并使用ac4.0溶液将蛋白溶液稀释为终浓度0.05mg/ml的工作液；hpv-16l1protein作为偶联的目标蛋白。(3)使用biacore3000操作软件中的surfacepreparation/immotilzation指令，依据提示进行目标蛋白在cm5芯片上的偶联操作，偶联的方法为nhs/edc介导的氨基偶联反应。该反应是利用nhs/edc试剂对cm5芯片上的羧基进行活化，使其能够在常温条件下与氨基酸或蛋白的氨基端发生反应形成肽键。(4)通过步骤1-3，同理制备空白通道作为实验通道的对照。空白通道不适用氨基酸或蛋白质进行偶联，通道上原有的羧基基团最终与乙醇胺连接，转变为羟基。(5)软件自动计算偶联的效果。实验中，实验通道最终偶联约5300ru的hpv-16l1protein，其中单位ru为系统定义的偶联量单位。(6)使用运行缓冲液：hbs-epbuffer，对芯片和设备进行充分平衡。(7)将待测多肽以hbs-epbuffer配制成终浓度分别为：0mg/l、3.125mg/l、6.25mg/l、12.5mg/l、25.0mg/l、50.0mg/l、100mg/l的溶液用于进行后续的实验。实验操作中为简便操作，以“n”替代：“mg/l”进行标准。(8)依据平衡、测试、平衡、再生的步骤设计程序，对各个浓度的多肽溶液进行检测。检测程序简要如下：平衡120s、进样180s，平衡540s，renewbuffer再生60s，平衡60s；检测中，样品将依次通过空白通道、实验通道，检测数据采用“实验通道响应值-空白通道响应值”的差值结果。(9)将获得的数据，使用biacore3000的配套数据分析软件biaeval进行作图和数据分析，测试结果绘制成蛋白互作传感图，传感及计算结果见图1和表1。表1数据分析结果6.结果获得被测多肽与目标蛋白(hpv-16l1protein)的亲和力常数，所述多肽与hpv16l1蛋白发生结合的亲和力常数为7.82×10-10m。7.结论：参考已有的使用biacore方法分析抗hpv抗体与hpvl1protein动力学分析测定的亲和力常数，抗体和抗原的亲和力常数在10-10m量级时，即为高亲和力。本实验中测定的所述多肽与hpv-16l1protein的亲和力常数同样高达10-10m量级，表明所测多肽对hpv16l1蛋白具有极强的亲和能力。由此，我们推论，所述多肽抑制hpv活性的机理可能是：所述多肽与hpv的l1外壳蛋白结合，一方面影响了hpv完整病毒颗粒的组装，另一方面，封闭了hpv与宿主细胞受体结合的位点，使hpv不能与宿主细胞结合，进而抑制hpv活性。实施例4所述多肽对hpv6、11的抑制作用实验材料：hpv6/11型病毒来源：hpv6、11型病毒取自未经治疗的尖锐湿疣病人的前列腺液标本，将标本转入1.5ml的离心管中，振荡混匀，12000r/min离心10min，弃上清液，留沉淀备用。受试物：所述多肽，溶解于生理盐水中，制备为0.01％、0.5％、1％的多肽溶液。主要仪器：abi7500型核酸检验仪。试剂盒：低危型(hpv6/11)，由中山大学达安基因股份有限公司生产。实验方法：在前列腺液沉淀中加入受试物10ul，对照管则加入生理盐水10ul，每次实验同时设阴性及阳性对照管，37℃孵育24小时。向样品中加入50μldna提取液混匀，100℃恒温裂解10min，12000r/min离心5min，待用。取核酸提取上清液5μl加入pcr反应体系中，8000r/min离心数秒，放入仪器样品槽中进行pcr实验。反应循环条件为93℃2min，93℃45s，55℃60s10个循环，93℃30s，55℃45s30个循环，分析结果，见表2：表2前列腺液中hpv6/11fq-pcr定量检测结果由表2的结果可见，尖锐湿疣患者的前列腺液在加入0.01％的所述多肽24小时后，hpv6/11已显著下降，0.1％的所述多肽将hpv病毒量降低至检测限以下，即为阴性，而空白对照管具有很高浓度的hpv病毒量，说明所述多肽可快速有效地抑制引起尖锐湿疣的hpv6/11病毒。实施例5含本发明所述多肽的组合物对各种hpv亚型感染的治疗效果选取宫颈高危感染患者76例，高危hpv亚型来自hpv16型、18型或52型，将所有患者随机分为对照组、观察组，每组各38例。纳入标准:①所有患者经薄层液基细胞学(tct)检测为阳性；②hpv测定为阳性；③无严重心、肝、肾等重要脏器性疾病。排除标准：①并发恶性肿瘤及全身免疫系统疾病患者；②有干扰素禁忌证；③生殖系统手术史；④认知功能障碍者；⑤妊娠期或哺乳期患者。方法：对照组于睡前清洁外阴后将1粒辛复宁置于后穹窿或阴道断端，每天1次，10天为一个疗程，共6个疗程。观察组使用本发明实施例1中所述多肽凝胶制剂，于睡前清洁外阴后将1支(5ml)推入后穹窿或阴道断端，每天1支，保持坐姿或躺姿5分钟后即可起身，经期停用，共使用60天。观察指标:治疗后高危hpv检测显示原亚型转阴为有效；高危hpv检测显示原亚型无转阴为无效。对照组与观察组治疗后结果见表3表3两组治疗结果转阴率比较组别例数(人)有效(人)无效(人)转阴率(％)对照组38261268.4观察组3834489.5表3的结果表明，使用含本发明所述多肽的凝胶制剂的观察组的转阴率高达89.5％，对照组转阴率为68.4％，差异有统计学意义(p＜0.05)。通过以上临床实验研究充分表明；含本发明所述多肽的组合物可有效治疗hpv的感染，进一步可以预防和治疗宫颈癌。实施例6所述多肽对阴道益生菌的作用本发明所述多肽对多种细菌有抗菌作用，但所述多肽对女性生殖道正常菌群如乳酸杆菌无抑制作用。图2中，0.1和0.5mg的所述多肽对大肠杆菌产生抑菌环的直径﹥7mm，具有抑菌作用，图3中，0.1和0.5mg的所述多肽对乳酸杆菌没有产生抑菌环，无抑菌作用。由此可见，所述多肽在对hpv抑制的同时，不影响阴道有益菌群的生长，能有效维持女性生殖道的益生菌微环境的平衡。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>江苏吉锐生物技术有限公司<120>一种多肽在制备预防和治疗人乳头瘤病毒感染制剂的应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>prt<213>人工序列(2ambystomalateralexambystomajeffersonianum)<400>1metglyargphelysargphearglyslysphelyslysleuphelys151015lysleuser当前第1页12