类维生素A与水飞蓟提取物的组合的制作方法

本发明涉及类维生素a与水飞蓟提取物的组合，以及含有该组合的皮肤病学或皮肤美容学组合物(compositiondermatologiqueoudermo-cosmétique)，优选局部用组合物，特别用于治疗痤疮(l’acné)、皮脂溢(séborrhée)、酒渣鼻(rosacée)和/或脂溢性皮炎(dermiteséborrhéique)。
背景技术：
：科学名称水飞蓟(silybummarianum(l.)gaertn.)指属于菊科的植物，一年生或两年生，茎粗壮，可以达到一米以上的高度。它的大的、光滑的、互生的、无托叶的叶子呈斑驳的白色，边缘有坚硬的尖刺。花分生在顶生花序中，通常单生。它们周围有大的尖端非常尖锐的带刺的苞叶。5瓣的管状花的颜色是略带紫色的紫色。果实是光滑的、黑色或黄色大理石纹的瘦果(akène)，顶端在基部上有齿状刚毛环。这种植物的本地名字叫奶草蓟(chardon-marie)。水飞蓟的瘦果(在文献中通常被错误地称为种子)及其制剂传统上是口服使用，用于对归因于肝源的消化功能障碍的对症治疗。在文献中，水飞蓟瘦果的主要活性成分是水飞蓟素，几种黄铜木脂素(主要是水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟亭和水飞蓟宁(silydianine))的混合物。瘦果含有高达3重量％的水飞蓟素。它们还含有油(20-30重量％)、粘液和蛋白质。此外，痤疮患者的皮肤中显示出维生素a缺乏(o.和vahlquist,a.(1985).vitaminainskinandserum—studiesofacnevulgaris,atopicdermatitis,ichthyosisvulgarisandlichenplanus.br.j.dermatol.113(4),405-413)并且毛囊皮质腺上皮细胞中描述了其代谢不足(everts,h.b.(2012).endogenousretinoidsinthehairfollicleandsebaceousgland.biochim.biophys.acta1821(1),222-229)。局部应用的视黄醛可以在人体皮肤中递送维生素a的不同成分(sorg,o.和saurat,j.h.(2014).topicalretinoidsinskinageing:afocusedupdatewithreferencetosuninducedepidermalvitaminadeficiency.dermatology228(4),314-325)，这种特性已被用于预防和治疗易长痤疮的皮肤。技术实现要素：在本文中，本申请人令人惊讶地证明，类维生素a例如视黄醛(rétinaldéhyde)(也称为视黄醛(rétinal))与水飞蓟提取物的组合显示出改善的治疗痤疮、皮脂溢、酒渣鼻或脂溢性皮炎的特性。特别地，获得的研究结果表明，在皮肤细胞产生视黄酸方面视黄醛与水飞蓟提取物的组合具有协同作用。因此，本发明的一个主题涉及一种包含类维生素a和水飞蓟提取物的组合。本发明的另一个主题涉及一种包含类维生素a和水飞蓟提取物的组合，其用作药品的用途。本发明的另一个主题涉及一种包含类维生素a和水飞蓟提取物的组合，其用作治疗痤疮、皮脂溢、酒渣鼻和/或脂溢性皮炎的用途。本发明的另一个主题涉及包含类维生素a和水飞蓟提取物的组合在制备用于治疗痤疮、皮脂溢、酒渣鼻和/或脂溢性皮炎的药品中的用途。本发明的另一个主题涉及包含类维生素a和水飞蓟提取物的组合治疗痤疮、皮脂溢、酒渣鼻和/或脂溢性皮炎的用途。本发明的另一个主题涉及一种治疗痤疮、皮脂溢、酒渣鼻和/或脂溢性皮炎的方法，其包含向需要其的人施用有效量的包含类维生素a和水飞蓟提取物的组合。本发明的另一个主题涉及一种皮肤病学或皮肤美容学组合物，优选局部用组合物，其包含类维生素a和水飞蓟提取物以及至少一种皮肤病学或皮肤美容学上可接受的赋形剂。本发明的另一个主题涉及一种皮肤病学或皮肤美容学组合物，优选局部用组合物，其用于治疗痤疮、皮脂溢、酒渣鼻和/或脂溢性皮炎的用途，所述组合物包含类维生素a和水飞蓟提取物以及至少一种皮肤病学或皮肤美容学上可接受的赋形剂。本发明的另一个主题涉及皮肤病学或皮肤美容学组合物，优选局部用组合物治疗痤疮、皮脂溢、酒渣鼻和/或脂溢性皮炎的用途，所述组合物包含类维生素a和水飞蓟提取物以及至少一种皮肤病学或皮肤美容学上可接受的赋形剂。本发明的另一个主题涉及一种治疗痤疮、皮脂溢、酒渣鼻和/或脂溢性皮炎的方法，其包含向需要其的人施用，优选局部施用有效量的皮肤病学或皮肤美容学组合物，所述组合物包含类维生素a和水飞蓟提取物以及至少一种皮肤病学或皮肤美容学上可接受的赋形剂。本发明的另一个主题涉及一种皮肤病学或皮肤美容学组合物，优选局部用组合物，其包含：(i)类维生素a，和(ii)水飞蓟提取物，作为组合产品，用于同时、分别或依次使用。本发明的另一个主题涉及一种皮肤病学或皮肤美容学组合物，优选局部用组合物，其包含：(i)类维生素a，和(ii)水飞蓟提取物，作为组合产品，用于在治疗痤疮、皮脂溢、酒渣鼻和/或脂溢性皮炎中同时、分别或依次使用。本发明的另一个主题涉及在治疗痤疮、皮脂溢、酒渣鼻和/或脂溢性皮炎中同时、分别或依次使用类维生素a和水飞蓟提取物。本发明的另一个主题涉及一种治疗痤疮、皮脂溢、酒渣鼻和/或脂溢性皮炎的方法，其包含向需要其的人同时、分别或依次施用有效量的类维生素a和有效量的水飞蓟提取物。详细说明定义在本说明书中，植物水飞蓟(silybummarianum(l.)gaertn.)可以缩写为水飞蓟(silybummarianum)，而视黄醛可以缩写为ral。用于本发明的目的，“脂肪酸”指羧酸r1co2h，其链r1为直链或支链烃链，饱和的或含有c＝c双键，所述羧酸包含16至22个碳原子(包括羧酸官能团的碳原子)。用于本发明的目的，“游离”脂肪酸(包括亚油酸)”指未键合至其它分子(例如键合至甘油或其衍生物得到甘油酯或键合至醇得到脂肪酯)的脂肪酸。用于本发明的目的，“c1至c3醇”指醇r2oh，其链r2为饱和的直链或支链烃链，其包含1至3个碳原子。其可以是甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇，特别是甲醇、乙醇或异丙醇。优选其为异丙醇。“皮肤病学或皮肤美容学上可接受的”在本发明中指对于制备皮肤病学或皮肤美容学组合物是有用的，通常是安全的、无毒的和即无生物学上也无其它不需要的，并且对于特别地通过局部应用的治疗用途或化妆品用途是可接受的。在本说明书中，“约”指所涉及的值可以比所指定的值低或高10％，特别地5％或1％。用于本发明的目的，“干提取物”指不含提取溶剂的提取物或仅含有微不足道的痕量的提取溶剂的提取物。因此，该干提取物仅含有衍生自水飞蓟的材料。其还可以含有微不足道的痕量的提取溶剂。用于本发明的目的，“异水飞蓟宾(isosilybine)”指两种非对映异构体异水飞蓟宾a和异水飞蓟宾b。术语“水飞蓟宾(silybine)”，也称为“水飞蓟宾(silibinine)”，在本发明的含义中指四种非对映异构体水飞蓟宾a、异水飞蓟宾b、2,3-顺式-水飞蓟宾a和2,3-顺式-水飞蓟宾b。用于本发明的目的，“水飞蓟亭(silychristine)”指两种非对映异构体异水飞蓟亭a和水飞蓟亭b。用于本发明的目的，“水飞蓟素(silymarine)”指水飞蓟的瘦果的纯化提取物，其主要包含(至少95重量％)如下四种黄酮木脂素：水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟亭和水飞蓟宁(kuki等人2012)。因此，少于0.2重量％的水飞蓟素含量指水飞蓟素构成成分的总量少于0.2重量％。可以通过如下确定该含量：特别地通过高效液相色谱法(hplc)或超高效液相色谱法(uplc)，通过计算对应于所有水飞蓟素构成成分的峰的总面积，特别地通过使用水飞蓟素参考样品(其可以例如从sigmaaldrich获得)来确定这些峰的位置。用于本发明的目的，“与衍生自水飞蓟瘦果的油不相溶的有机溶剂”指一种有机溶剂，其不能够与获得自水飞蓟瘦果的油混合或仅能部分混合，以使得所述有机溶剂与所述衍生自水飞蓟瘦果的油的混合物提供不均一的混合物，其中可以观察到至少两个不同的相。用于本发明的目的，“甾醇”指具有甾烷母核的分子，其碳3携带羟基oh，所述甾烷母核具有以下结构：用于本发明的目的，“生育酚”指α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚。类维生素a在本发明的文本中使用的类维生素a可以选自各种异构体形式(特别地全反式、13-顺式和9-顺式)的视黄醇(rétinol)、视黄醛和视黄酸(l’acide)。有利地，类维生素a为视黄醇或视黄醛。优选地，类维生素a为视黄醛。水飞蓟提取物在本发明的文本中使用的提取物是水飞蓟的提取物，特别是水飞蓟的瘦果提取物。根据一个特别的实施方案，根据本发明的提取物含有基于干提取物的重量少于0.2重量％，优选少于0.1重量％的水飞蓟素。根据一个特别的实施方案，根据本发明的提取物含有基于干提取物的重量至少0.5重量％，优选至少0.1重量％的β-谷甾醇。特别地，根据本发明的提取物含有基于干提取物的重量0.5重量％至2.5重量％，特别地1.0重量％至2.0重量％，例如约1.5重量％的β-谷甾醇。有利地，根据本发明的提取物含有基于干提取物的重量少于0.2重量％，优选少于0.1重量％的水飞蓟素。根据本发明的提取物的水飞蓟素/β-谷甾醇的重量比可以少于0.4，特别地少于0.07。根据本发明的提取物还可以包含基于干提取物的重量2至7重量％，特别地3至6重量％，例如3至5重量％的甾醇。根据另一个特别的实施方案，根据本发明的提取物含有基于干提取物的重量至少3重量％，优选至少4重量％的游离亚油酸。特别地，根据本发明的提取物含有基于干提取物的重量3重量％至15重量％，特别地4重量％至10重量％，特别地4重量％至6重量％，例如约5重量％的游离亚油酸。有利地，根据本发明的提取物含有基于干提取物的重量少于0.2重量％，优选少于0.1重量％的水飞蓟素。根据本发明的提取物还可以包含基于干提取物的重量10重量％至70重量％，特别地10重量％至30重量％，特别地15重量％至25重量％的游离脂肪酸。根据另一个特别的实施方案，根据本发明的提取物含有基于干提取物的重量至少0.5重量％至2.5重量％，特别地1.0重量％至2.0重量％，例如约1.5重量％的β-谷甾醇，和基于干提取物的重量3重量％至15重量％，特别地4重量％至10重量％，特别地4重量％至6重量％，例如约5重量％的游离亚油酸。有利地，根据本发明的提取物含有基于干提取物的重量少于0.2重量％，优选少于0.1重量％的水飞蓟素。根据本发明的提取物的水飞蓟素/β-谷甾醇的重量比可以小于0.4，特别地小于0.07。根据本发明的提取物还可以包含基于干提取物的重量2至7重量％，特别地3至6重量％，例如3至5重量％的甾醇，和基于干提取物的重量10重量％至50重量％，特别地10重量％至30重量％，特别地15重量％至25重量％的游离脂肪酸。根据本发明的提取物含有基于干提取物的重量至少0.01重量％，特别地至少0.05重量％的生育酚。特别地，根据本发明的提取物含有基于干提取物的重量0.01重量％至0.5重量％，特别地0.05重量％至0.2重量％，例如约0.1重量％的生育酚。有利地，根据本发明的提取物含有基于干提取物的重量少于0.2重量％，优选少于0.1重量％的水飞蓟素。根据本发明的提取物水飞蓟素/生育酚重量比可以小于1，特别地小于0.1。根据另一个特别的实施方案，根据本发明的提取物含有基于干提取物的重量少于0.2重量％，优选少于0.1重量％的水飞蓟素；基于干提取物的重量0.5重量％至2.5重量％，特别地1.0重量％至2.0重量％，例如约1.5重量％的β-谷甾醇；基于干提取物的重量3重量％至15重量％，特别地4重量％至10重量％，特别地4重量％至6重量％，例如约5重量％的游离亚油酸；和基于干提取物的重量0.01重量％至0.5重量％，特别地0.05重量％至0.2重量％，例如约0.1重量％的生育酚。根据本发明的提取物还可以包含基于干提取物的重量2至7重量％，特别地3至6重量％，例如3至5重量％的甾醇和基于干提取物的重量10重量％至50重量％，特别地10重量％至30重量％，特别地15重量％至25重量％的游离脂肪酸。根据本发明的提取物的水飞蓟素/β-谷甾醇重量比可以特别地小于0.4，特别地小于0.07。根据本发明的提取物的水飞蓟素/生育酚重量比可以特别地小于1，特别地小于0.1。优选地，根据本发明的提取物为干提取物。根据本发明的提取物可以通过提取溶剂提取衍生自水飞蓟瘦果的油获得，所述提取溶剂包含，特别地由以下组成：水溶性溶液、亚临界水或与衍生自水飞蓟瘦果的油不相混溶、任选与水混合的有机溶剂；特别地与衍生自水飞蓟瘦果的油不相混溶、任选与水混合的有机溶剂，例如c1至c3醇。特别地，所述提取溶剂包含，特别地由以下组成：任选与水混合的甲醇、乙醇或异丙醇，特别地有机溶剂/水体积比为80/20至100/0，特别地85/15至95/5,特别地约90/10。有利地，所述提取溶剂为异丙醇/水混合物，特别地体积比为约90/10。有利地，可以通过提取水飞蓟瘦果(瘦果可以为整个的或碎块的)，特别地通过压榨，有利地通过冷压榨(即，在室温，无加热)获得来自水飞蓟瘦果的油。可以通过将油与提取溶剂混合1至12小时，特别地在15至25℃，特别地约20℃的温度来进行来自水飞蓟瘦果的油的提取步骤。对于1g油，用于进行该提取的提取溶剂的量有利地为0.5至3g，特别地1至3g。然后，将由此获得的提取相与脂质相分离，然后特别地在真空下，进行部分或全部干燥或蒸发以基本消除提取溶剂，并在溶剂完全消除的情况下获得干提取物，或者获得稀释在残留溶剂中的浓缩提取物。根据本发明的组合根据本发明的组合包含如上所定义的类维生素a和如上所定义的水飞蓟提取物。根据本发明的组合优选为作为类维生素a的视黄醛与水飞蓟提取物特别地水飞蓟瘦果提取物的组合，其基本不含水飞蓟素，即包含基于干提取物的重量少于0.2重量％，优选少于0.1重量％的水飞蓟素。根据本发明的皮肤病学和皮肤美容学组合物本发明的主题还为一种皮肤病学或皮肤美容学组合物，其包含至少一种如上所定义的组合以及至少一种皮肤病学或皮肤美容学上可接受的赋形剂，特别旨在局部应用，特别地应用于皮肤。根据本发明的皮肤病学和皮肤美容学组合物能够以用于局部施用的通常已知的形式存在，即，特别地洗剂、泡沫剂、凝胶剂、分散剂、乳剂、喷雾剂、精华液、面膜或霜剂，所述组合物具有特别地允许皮肤渗透以改善活性成分的性能和可及性的赋形剂。有利地，其是霜剂。这些组合物除了根据本发明的组合的成分外通常含有生理学上可接受的介质，通常为基于水或基于溶剂的，例如醇、醚或二醇。其还可以含有表面活性剂、络合剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、增稠剂、胶凝剂、湿润剂、润肤剂、微量元素、精油、香料、染料、控油剂、化学或矿物过滤剂、保湿剂、温泉水等。这些组合物还可以含有产生补充或可能协同的作用的其它活性成分。有利地，根据本发明的组合物包含相对于所述组合物的总重量(优选以干提取物的重量计)0.01至10重量％，优选0.05至5重量％的根据本发明的水飞蓟提取物。有利地，根据本发明的组合物包含相对于所述组合物的总重量0.001至5重量％，优选0.01至1重量％的类维生素a。治疗应用根据本发明的组合以及根据本发明的皮肤病学或皮肤美容学组合物可用于治疗痤疮(例如青少年痤疮(acnéjuvénile)，也称为青春期痤疮(acnédel’adolescent)，或晚期痤疮(acnétardive)，其可能是囊性的)、皮脂溢、脂溢性皮炎和/或酒渣鼻,优选通过局部应用，特别地应用于皮肤。通过以下非限定性实例说明本发明。附图说明图1显示根据方案1获得的水飞蓟提取物i的uplc色谱图。图2a、2b和2c分别代表根据方案2获得的水飞蓟提取物m、提取物e和提取物i的uplc色谱图。图3a、3b和3c分别代表根据方案3获得的水飞蓟提取物e、提取物m和提取物i的gc/ms色谱图的10-22min区域(对应于脂肪酸区域)。图4a、4b和4c分别代表根据方案3获得的水飞蓟提取物e、提取物m和提取物i的gc/ms色谱图的22-28min区域(对应于甾醇区域)。图5代表皮肤细胞产生的总类维生素a的量随着所接受的治疗而变化，所述治疗即单独的载体(etoh)，2μm视黄醛(2μmral)，50μg/ml水飞蓟提取物(50μg/mlsyl)或2μm视黄醛和50μg/ml水飞蓟提取物的组合(ral+syl)。图6代表皮肤细胞产生的总类维生素a的量随着所接受的治疗而变化，所述治疗即单独的载体(etoh)，2μm视黄醇(2μmrol)，50μg/ml水飞蓟提取物(50μg/mlsyl)或2μm视黄醇和50μg/ml水飞蓟提取物的组合(rol+syl)。具体实施方式实施例i-根据本发明的提取物的制备例通过以下过程获得异丙醇提取物90(提取物i)：·冷压榨水飞蓟瘦果以获得来自水飞蓟瘦果的油，·在20℃，通过异丙醇/水混合物(90/10v/v)提取来自水飞蓟瘦果的油2小时，每克油使用1克异丙醇/水混合物，·回收异丙醇相，和·蒸发溶剂。甲醇(提取物m)和乙醇90(提取物e)的提取物以类似的方式获得，分别用甲醇和乙醇/水混合物(90/10v/v)代替异丙醇/水混合物(90/10v/v)。在20℃，对1体积的油分别用3体积的甲醇和3体积的乙醇/水混合物(90/10v/v)提取来自水飞蓟瘦果的油2小时。根据下面详述的方案，通过超高效液相色谱法(uplc)或气相色谱与质谱联用(gc-ms)对这些不同的提取物进行表征。评价获得的提取物的方案：1.方案1：通过uplc评价水飞蓟素含量o样品和对照品的制备：-水飞蓟素对照品：在10ml甲醇/水混合物(60:40)(v/v)中制备5mg水飞蓟素溶液。-样品：·提取物a：在10ml甲醇/二氯甲烷混合物(70:30)(v/v)中制备100mg待分析的提取物的溶液·提取物m、e、i：搅拌下将待分析的干提取物加热至35℃直至获得均质澄清的溶液。准确称取200mg(pe)提取物，将其溶解在10ml甲醇/二氯甲烷混合物中，使得提取物完全溶解并使溶液均质化。该混合物从甲醇/二氯甲烷比(1:1)(v/v)至纯的甲醇变化。o分析条件：-柱：acquitybehshieldc18150mm×2.1mm-1.7μm(waters)-流动相：oa：水+0.1％甲酸ob：乙腈+0.1％甲酸-梯度：t(min)a(％)b(％)0901015604020010039.50100409010459010-柱温：40℃-流速：0.4ml/min-检测：287nm-进样体积：1μl2.方案2：通过uplc评价亚油酸含量o样品和对照品的制备：-亚油酸对照品：在10ml1:1(v/v)甲醇/二氯甲烷混合物中制备10mg亚油酸溶液。-样品：·提取物m、e、i：搅拌下将待分析的干提取物加热至35℃直至获得均质澄清的溶液。准确称取50mg(pe)提取物，将其溶解在1ml甲醇/二氯甲烷混合物中，使得提取物完全溶解并使溶液均质化。该混合物从甲醇/二氯甲烷比(1:1)(v/v)至纯的甲醇变化。o分析条件：-柱：acquitybehshieldc18150mm×2.1mm-1.7μm(waters)-流动相：oa：水+0.1％甲酸ob：乙腈+0.1％甲酸-梯度：t(min)a(％)b(％)050501505010010015010015.55050205050-柱温：40℃-流速：0.4ml/min-检测：215nm-进样体积：1μl3.方案3：通过gc-ms评价脂肪酸和甾醇含量o样品的制备-搅拌下将待分析的干提取物加热至35℃直至获得澄清均质的液体。-将20mg提取物溶解在800μl甲醇/二氯甲烷(1:1)(v/v)混合物中-加入200μl衍生化试剂n,o-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(bstfa)+三甲基氯硅烷(tmcs)(99:1)(supelco–sigmaaldrich)-涡旋1分钟o气相色谱(cpg)条件-柱：db-5ms(agilenttechnologies)；30m×0.25mm；0.25μm-进样：t＝300℃；模式＝分流(split)；分流比＝100:1-炉：温度梯度(℃)：o初始温度＝150℃o梯度＝7℃/分升至最终温度＝340℃o在340℃维持10分钟-载气流速：1ml/min-检测：ms–ei；t＝300℃；扫描时间＝0.2秒；全扫描起始质量＝40；全扫描结束质量＝600-进样体积：1μl结果：提取物i主要包含每个uplc保留时间在13至30分钟之间的物质(见图1)。其具有以下特点：水飞蓟的3种提取物(提取物i、m和e)的uplc和gc/ms色谱图相似(见图2和3)。ii–根据本发明的包含类维生素a和/或水飞蓟提取物的组合物的实施例基于视黄醛的组合物1(霜剂)＝ral1基于视黄醛的组合物2(霜剂)＝ral2inci名称重量百分比水osp100％山梨酸钾0.3乙醇3乙醇酸6鲸蜡硬脂醇聚醚33&鲸蜡硬脂醇3聚山梨醇酯606鲸蜡醇11丁基羟基甲苯0.01环戊硅氧烷10氢氧化钠qs视黄醛0.1十一烷基鼠李糖苷0.2基于视黄醛的组合物3(霜剂)＝ral3基于视黄醛的组合物4(霜剂)＝ral4在包含以下的混合物中以0.1％(p/p)配制视黄醛：5％甘油1.5％胶凝剂1％二氧化硅qs水。基于水飞蓟提取物的组合物5(霜剂)＝syl1在异丙醇/peg300(1:1)(p/p)中以7％(p/p)配制实施例1中制得的提取物i。基于水飞蓟提取物的组合物6(霜剂)＝syl2(p/p百分比)25％syl15％甘油1.5％胶凝剂1％二氧化硅qs水。包含水飞蓟提取物和视黄醛的组合的组合物7(霜剂)＝asso1(p/p百分比)25％syl10.1％视黄醛5％甘油1.5％胶凝剂1％二氧化硅qs水。包含水飞蓟提取物和视黄醛的组合的组合物8(霜剂)＝asso2(p/p百分比)12.5％syl10.1％视黄醛5％甘油1.5％胶凝剂1％二氧化硅qs水。iii–临床研究通过轻柔按摩将不同的待测霜剂应用在面部(清洁的皮肤)上，除含ral的组合物仅晚上应用外，每天早晚应用2次。根据美国食品药品监督管理局(fda)接受的调查者全球评估(investigatorglobalassessment，iga)方法对获得的治疗效果进行分析(适用于痤疮并适用于酒渣鼻和脂溢性皮炎)，由临床皮肤科医生应用(寻常性痤疮的工业指南：开发用于治疗的药物(guidanceforindustryacnevulgaris:developingdrugsfortreatment))。使用这种方法，根据所观察到的痤疮的严重程度评定以下iga分级：各种分析的结果如下所示。分析1：治疗前对比无ral的水飞蓟提取物对比组合ral+水飞蓟提取物分析2：治疗前对比无水飞蓟提取物的ral对比组合ral+水飞蓟提取物结论在上述临床研究中，分别基于视黄醛和水飞蓟提取物的组合、单独的视黄醛或单独的水飞蓟提取物的不同治疗所获得的结果表明，视黄醛与水飞蓟提取物的组合可获得更好的临床效果。iv–体外研究：通过组合视黄醛(ral)或视黄醇(rol)+水飞蓟提取物(syl)评价维生素a缺乏症的矫正材料和方法：培养：·实验前3天，在2个6孔板中以每孔40,000细胞(每孔2ml)的密度培养a431表皮样癌细胞。细胞处理(每个条件3个孔，每个孔2ml；最终浓缩物)：·乙醇(溶剂)：1％乙醇；·rol：10μmrol在1％乙醇中；·ral：2μmral在1％乙醇中；·syl：50μg/ml水飞蓟提取物i在1％乙醇中；·rol+syl：10μmrol+50μg/ml水飞蓟提取物在1％乙醇中；·ral+syl：2μmral+50μg/ml水飞蓟提取物在1％乙醇中。孵育：1h细胞收集：·除去培养基，用pbs(磷酸盐缓冲液)洗涤两次；·每孔加入500μledta-naoh(0.02％乙二胺四乙酸(edta)+200μmnaoh)，静置10-15分钟，然后用橡皮刮刀分离细胞并转移至萃取玻璃管中；·加入10μl20mmhcl，短暂超声处理，然后将10μl悬浮液转移至1.5mleppendorf管中进行蛋白质测定；·向玻璃管中加入500μl200μm丁基化羟基甲苯(bht)/乙醇，20μl20μm乙酸视黄酯(内标)，然后加入4ml己烷；·剧烈涡旋30秒，然后将试管离心(900g，5min)；·将上清液转移到无盖的玻璃管中，在氮气氛下蒸发干燥；·用200μl甲醇重构，然后转移至高效液相色谱(hplc)小瓶中。通过hplc的视黄醛分析：·带四元泵和dad检测器的agilent1100hplc链·macherey-nagel色谱柱nucleodurc18pyramid3μm·流动相：o0-6min：100％甲醇o6-8min：线性梯度至甲醇/thf(4:1)o8-18min：甲醇/thf(4:1)o18-20min：线性梯度至100％甲醇o20-30min：100％甲醇·检测：325nm(视黄醇、视黄酯)；383nm(视黄醛)。结果：所获得的结果示于图5和图6。结论：单独的水飞蓟提取物不能诱导显著的类维生素a的产生。另一方面，在水飞蓟提取物与视黄醛或视黄醇的组合存在下，与在单独的视黄醛或视黄醇的存在下相比，皮肤细胞显著产生更多的类维生素a，证明了根据本发明的组合的协同作用。当前第1页12