治疗神经系统损伤的组合物和方法与流程

交叉引用

本申请要求2017年12月7日提交的第62/595,797号美国临时专利申请的权益，该申请通过引用而整体并入本申请中。

本发明大体上涉及分子医学和脑生物学领域，更具体地说，涉及选择性归巢到急性脑损伤部位并在所述部位产生治疗效果的分子。

背景技术：

急性脑损伤，例如，创伤性脑损伤(tbi)破坏大脑的正常功能，通常导致预后功能恢复和存活情况较差。tbi被称为“无声的流行病”，是年龄1岁至44岁的儿童、青少年和活跃的成年人死亡和发病的首要原因，美国每年发病率达250万人(coronadoetal.,j.safetyres.43:299-307(2012))。tbi会导致急性和潜在长期神经机能障碍，包括发展成慢性创伤性脑病变(cte)或甚至阿尔茨海默病(smithetal.,nat.rev.neurology9:211-221(2013))。大多数与打斗-有关的tbi因大脑穿透性损伤而变得格外复杂，穿透性损伤通常比非-穿透性损伤甚至更难处理(belletal.,j.trauma66:s104-111(2009))。尽管tbi对社会经济具有重大影响，但是，其治疗仅限于姑息治疗，并没有任何具有长期益处的特定治疗方法。

血脑屏障(bbb)被认为是系统治疗中枢神经系统(cns)疾病的主要障碍。因此，人们探索了脑内局部给药，但是，这种治疗在临床中具有局限性。在急性脑损伤和几种脑血管疾病中，包括中风、高血压和局部缺血，bbb被暂时破坏，允许大分子和神经保护药物从全身循环进入到血管外。事实上，人们通过脑实质内血清蛋白泄漏情况来测定bbb完整性(kuroiwaetal.,actaneuropathologica76:62-70(1988))。但是，损伤区域中被动积聚的蛋白质缺少特异性结合，会导致停留时间短，随后随着时间延长而被清除出去。由于这种清除性，全身给药的治疗效果受到极大的限制。

以前的研究采用体内噬菌体展示来原位探测特异性分子标签，发现归巢肽对不同的病理具有特异性，包括肿瘤、动脉粥样硬化斑块和创伤(ruoslahti,nat.rev.cancer2:83-90(2002)；ruoslahti,adv.mater.24:3747-3756(2012)；teesaluetal.,methodsenzymol.503:35-56(2012))。急性和复杂事件(如tbi)适合类似的方法，因为据报道，蛋白质表达中存在位点-特异性分子变化(nataleetal.,j.neurotrauma20:907-927(2003))。

目前治疗脑损伤的方法是侵入式的，增加了损伤的并发症。

本发明的目的是提供一种识别神经系统损伤部位特异性分子变化并在所述部位提供治疗效果的肽。

本发明的另一个目的是提供一种选择性归巢到神经系统损伤部位并在所述部位提供治疗效果的肽。

本发明的另一个目的是提供一种选择性归巢到神经系统损伤部位并在所述神经系统损伤部位提供治疗效果的组合物。

本发明的另一个目的是提供一种选择性靶向神经系统损伤部位的方法。

本发明的另一个目的是提供一种采用对神经系统损伤具有治疗效果的肽，选择性靶向神经系统损伤部位，从而治疗系统损伤的方法。

本说明书中包含的任何文献、方案、材料、设备或物品等的讨论，并不代表承认这些内容中的任意一部分或全部在本申请的各个权利要求的优先权日之前已经存在，而构成现有技术基础的一部分，或者对于本发明相关的领域是公知的常识。

在整个说明书中，词语“包括”，或其变化形式如“包含”或“含有”理解为指的是包括规定的元件、整体或步骤，或元件、整体或步骤组，但并不排除其它任何元件、整体或步骤，或元件、整体或步骤组。

技术实现要素：

本文提供的所述方法和组合物是基于这一发现：4-氨基酸肽(caqk)选择性识别脑损伤并积聚在损伤部位，而且其本身对脑损伤具有治疗效果。人们发现，包含caqk氨基酸序列的这种肽和其它肽对脑损伤具有治疗效果。所述肽的作用通过小鼠和人脑损伤中都表达的所述肽的归巢靶得到促进。

caqk肽的结合靶是cns损伤中过表达的富-硫酸软骨素蛋白多糖(cspg)的蛋白质-碳水化合物细胞外基质复合物，特别是由透明质酸、多功能蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、磷酸酶蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和透明质酸蛋白聚糖连接蛋白(hapln)组成。这种复合物过表达导致形成富-cspg胶质瘢痕，这种瘢痕是再生的主要障碍。这种富-cspg细胞外基质复合物还在中风和其它神经系统损伤中过表达。众所周知，这种复合物降解会改善中风的结果。在脑缺血导致的中风实验模型中，含caqk的肽亦表现出对损伤部位具有同样的效果。因此，所述发现的肽可以选择性靶向神经系统损伤部位，特别是那些过表达cspg的部位。

公开了选择性靶向和治疗神经系统损伤(如脑损伤和中风损伤、胶质瘢痕形成部位及透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln沉积部位)的肽、组合物及方法。所述公开的肽、组合物和方法用于选择性靶向和治疗急性神经系统损伤，如创伤性脑损伤和中风损伤。

我们发现了一种特异性归巢到神经系统损伤部位并且对神经系统损伤具有治疗效果的肽序列。不管是否存在血脑屏障，含有所述序列的肽都可以归巢到脑内神经系统损伤部位并且具有治疗效果。这可能是由于破坏了神经系统损伤中的血脑屏障。这种靶向和选择性归巢是由于神经系统损伤部位存在所述肽序列能够结合的分子。

公开了包含氨基酸序列caqk(seqidno:4)的肽。在一些形式中，所述肽对神经系统损伤具有治疗效果，并且具有下述性质中的任何一种性质或它们的组合：选择性归巢到神经系统损伤部位；选择性归巢到急性神经系统损伤部位；选择性归巢到脑损伤部位；选择性归巢到急性脑损伤部位；选择性归巢到中风损伤部位；选择性归巢到急性中风损伤部位；与多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln中的一种或多种特异性结合；选择性归巢到胶质瘢痕形成部位；选择性归巢到其中透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln沉积的部位；及选择性归巢到富-cspg细胞外基质复合物。

在一些形式中，所述肽的长度是100个或100个以下氨基酸，50个或50个以下氨基酸，30个或30个以下氨基酸，20个或20个以下氨基酸，15个或15个以下氨基酸，10个或10个以下氨基酸，8个或8个以下氨基酸，6个或6个以下氨基酸，5个或5个以下氨基酸，或4个氨基酸。在一些形式中，所述肽是线性。在一些形式中，所述肽是环状。

在所述肽的一些形式中，所述氨基酸序列caqk(seqidno:4)位于所述肽的c末端。在一些形式中，所述肽由所述氨基酸序列caqk(seqidno:4)组成。在一些形式中，所述肽是修饰肽。在一些形式中，所述肽是甲基化肽。在一些形式中，所述肽包括甲基化氨基酸片段。在一些形式中，所述肽至少一个位置是n-或c-甲基化。

公开了包括所述公开肽的组合物。一般说来，所述组合物并不包括货物组合物或货物分子。公开了包括一种肽的组合物，其中所述肽由所述氨基酸序列caqk(seqidno:4)组成。

在一些形式中，所述组合物选择性归巢到急性脑损伤部位。在一些形式中，所述组合物与多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln中的一种或多种特异性结合。在一些形式中，所述组合物选择性归巢到胶质瘢痕形成部位。在一些形式中，所述组合物选择性归巢到其中透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln沉积的部位。在一些形式中，所述组合物选择性归巢到富-cspg细胞外基质复合物。在一些形式中，所述组合物选择性归巢到急性脑损伤部位；与多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln中的一种或多种特异性结合；选择性归巢到胶质瘢痕形成部位；选择性归巢到其中透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln沉积的部位；及选择性归巢到富-cspg细胞外基质复合物，或它们的组合。

所述公开的肽和组合物用于选择性靶向和治疗神经系统损伤，如脑损伤和中风损伤、胶质瘢痕形成部位，透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln沉积的部位，及富-cspg细胞外基质复合物。例如，所述公开的肽和组合物用于选择性靶向和治疗急性神经系统损伤，如创伤性脑损伤和中风损伤。因此，公开了将所述公开肽和组合物选择性靶向受试者急性神经系统损伤部位的方法。

在一些形式中，所述方法涉及将所述公开组合物向具有急性神经系统损伤的受试者施用。所述组合物选择性归巢到受试者的神经系统损伤部位，从而将所述组合物的肽选择性靶向所述神经系统损伤部位。

在一些形式中，所述神经系统损伤包括脑损伤。在一些形式中，所述肽选择性归巢到脑损伤部位。在一些形式中，所述脑损伤包括创伤性脑损伤、中风损伤或它们两者。在一些形式中，所述肽与多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln中的一种或多种特异性结合。在一些形式中，所述肽选择性归巢到胶质瘢痕形成部位。在一些形式中，所述肽选择性归巢到其中透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln沉积的部位。在一些形式中，所述肽选择性归巢到富-cspg细胞外基质复合物。

在一些形式中，所述神经系统损伤包括脑损伤。在一些形式中，所述肽选择性归巢到脑损伤部位，并对脑损伤部位具有治疗效果。在一些形式中，所述脑损伤包括创伤性脑损伤、中风损伤或它们两者。在一些形式中，所述肽与多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln中的一种或多种特异性结合，并具有治疗效果。在一些形式中，所述肽选择性归巢到胶质瘢痕形成部位，并对其具有治疗效果。在一些形式中，所述肽选择性归巢到其中透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln沉积的部位，并对其具有治疗效果。在一些形式中，所述肽选择性归巢到富-cspg细胞外基质复合物，并对其具有治疗效果。

所述组合物可以采用任何合适的路径施用。在一些形式中，所述组合物采用静脉注射施用。在一些形式中，所述组合物全身施用。在一些形式中，所述组合物局部施用。

所述公开的肽和组合物尤其用于靶向急性神经系统损伤。因此，在一些形式中，所述组合物可以在损伤时间附近施用或在损伤急性期施用。在一些形式中，所述组合物在神经系统损伤开始的10天内施用。在一些形式中，所述组合物在神经系统损伤开始的5天内施用。在一些形式中，所述组合物在神经系统损伤开始的24小时内施用。

特别公开了将所述公开的肽选择性靶向受试者的急性神经系统损伤部位的方法，其中所述方法涉及将所述组合物向具有急性神经系统损伤的受试者施用，其中所述组合物包括肽，其中所述肽由氨基酸序列caqk(seqidno:4)组成。所述组合物选择性归巢到受试者的神经系统损伤部位，从而将所述组合物的肽选择性靶向所述神经系统损伤部位。

此外，还公开了选择性靶向富-cspg细胞外基质复合物的方法(包含透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln的细胞外基质，其中示例有培养的u251星形细胞瘤细胞基质)。所述方法涉及向受试者施用一种组合物，其中所述组合物包括治疗归巢分子和药学上可接受的载体。所述组合物选择性归巢到富-cspg细胞外基质复合物，从而选择性靶向和治疗富-cspg细胞外基质复合物。

在所述方法的一些形式中，所述治疗归巢分子与多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln中的一种或多种特异性结合。在所述方法的一些形式中，所述治疗归巢分子选择性归巢到其中透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln沉积的部位。在所述方法的一些形式中，所述治疗归巢分子选择性归巢到富-cspg细胞外基质复合物。在所述方法的一些形式中，所述组合物静脉注射施用。在所述方法的一些形式中，所述组合物全身施用。

此外还公开了选择性归巢到富-cspg细胞外基质复合物，并对神经系统损伤具有治疗效果的治疗归巢分子。在一些形式中，所述治疗归巢分子可以这样鉴定：使其与试验分子和多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln或它们的组合接触，并对所述治疗归巢分子是否与多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln或它们的组合特异性结合进行评价，然后鉴定所述试验分子是否对神经系统损伤具有治疗效果。对所述治疗归巢分子进行鉴定，鉴定其是否与多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln或它们的组合特异性结合，并对神经系统损伤具有治疗效果。在一些形式中，所述治疗归巢分子可以这样鉴定：将所述治疗归巢分子和富-cspg细胞外基质复合物接触，并对治疗归巢分子是否与富-cspg细胞外基质复合物特异性结合进行评价。对所述治疗归巢分子进行鉴定，鉴定其是否与富-cspg细胞外基质复合物特异性结合，并对神经系统损伤具有治疗效果。在一些形式中，所述富-cspg细胞外基质复合物可以是u251星形细胞瘤细胞产生的基质。

所述公开方法和组合物的其它优点将部分在后面的描述中提出，部分将从描述中了解，或可以通过实践所述公开的方法和组合物而了解。所述公开方法和组合物的优点将通过特别是所附权利要求书中指出的元素和组合实现。应该了解的是，前面的一般说明及后面的详细说明都仅仅是示例性的和解释性的，并不限制本发明。

附图说明

附图包括在说明书中并构成说明书的一部分，阐明了所述公开方法和组合物的几个实施例，并且与说明一起用于解释所述公开方法和组合物的原理。

图1a示出了pbi小鼠模型示意图，其中在右侧顶颞皮层开展5mm颅骨切开术，并按照所示网格施加九针穿刺。图1b是大脑内caqk噬菌体频率图，以占总修复噬菌体的百分数表示。相比pbi，caqk在受伤小鼠对侧半球中的百分含量更低，而在健康的对照小鼠中则没有。图1c是pbi6小时后注射fam-标记肽的小鼠的定量荧光脑图像。采用illumatoolsystem(绿通道)，对大脑灌注、分离和成像。(*p<0.05,anova分析，n＝6)；平均值±sem。图1d是表明合成fam-caqk肽选择性归巢到损伤大脑的示意图。该图通过对来自fam免疫组织化学染色的信号进行定量和绘图编辑得到。图1e是pbi中caqk积聚的时间进程图。图1f是pbi中血脑屏障泄漏图。对pbi后不同时间点从小鼠分离的大脑进行小鼠igg染色。对总荧光密度进行定量和绘图。平均值±sem,n＝3。

图2是pbi大脑内pnn组分的蛋白质表达。对pbi6小时后的灌注小鼠大脑冷冻切片进行免疫染色，并采用共聚焦显微镜开展分析。该图表明了pbi大脑中损伤半球和对侧半球中多功能蛋白聚糖、hapln4和肌腱蛋白-r的免疫荧光定量情况。信号强度通过考虑三个图像中红色通道的积分像素强度进行定量。平均值±sem。

图3a-3c是表明pbi中caqk和硫酸软骨素共定位的图。图3a表明了噬菌体与u251细胞形成的细胞外基质结合的情况。所述细胞被轻柔地分离和清除，剩余ecm采用噬菌体室温培养1小时，并遵照elisa协议检测噬菌体结合情况。结果表明，caqk噬菌体与ecm的结合比对照噬菌体要高。图3b表明通过游离caqk肽，caqk噬菌体与ecm的结合受到抑制。图3c表明，采用软骨素酶abc或透明质酸酶对ecm酶消化后，噬菌体与ecm的结合减少。平均值±sem。图3a、3b和3c的代表性数据来源于三次重复实验，每次重复实验采用三个重复样品。图3d是表明u251细胞内多功能蛋白聚糖表达的图。将以汇合单层生长的u251细胞染色用于多功能蛋白聚糖表达，采用透明质酸酶(50u/ml)或软骨素酶abc(3u/ml)在37℃处理1小时后或不进行处理后，采用免疫荧光法进行分析。细胞采用dapi复染。对多功能蛋白聚糖进行定量，并绘制在柱状图中。示出了三次实验的代表性数据。

图4a是表明caqk-介导递送银纳米颗粒至pbi的图。pbi6小时后，静脉注射与caqk(caqk-np)结合或与对照肽(对照-np)结合的银纳米颗粒，并在灌注之前循环2小时(n＝3)。图4b-4d是表明psinp特征的图。图4b和4c采用动态光散射测定的粒径分布(图4b)；和psinp和caqk-psinp的光致发光光谱(图4c；caqk-psinp峰值在～530nm，而psinp不是这样)表征caqk肽-结合的多孔硅纳米颗粒(caqk-psinp)。肽上的fam标记出现在发射光谱图中～530nm处，并且包括在此用于估算与psinp的结合效率，如方法一节中所述。图4d表明了不同时间点从psinp释放sirna的情况。将dy677-标记的sirna载入到psinp内，并在37℃pbs中培养。从不同时间点的上清液得到释放的sirna。

图5a-5c示出了采用caqk-结合的psinp在pbi中递送sirna。图5a是sirna递送的实验设计示意图。图5b是表明如所述方法所述，每个小鼠组织中肽-结合的psinp(相对pbs对照)的计算信噪比(snr)图。caqk-psinp表明，pbi大脑中snr远高于对照肽-结合组(平均值±sd,*p<0.05，双尾学生t试验；n.s.–不显著，n＝3)。图5c是表明gfp/dapi表达百分数的图。将损伤半球中平均gfp强度归一化到相应的对侧半球，并以gfp表达百分数(y-轴)绘图(*p<0.05；anova分析，n＝3)。dapi信号(绘制的)表明与总细胞数类似。平均值±sem，n.s.，不显著。

图6a-6e是表明caqk与损伤人脑结合的图。图6a和6b表明caqk-np与人脑胼胝体切片结合(图6a)及与皮层切片结合(图6b)。将肽-结合纳米颗粒采用损伤和正常大脑的福尔马林固定冷冻切片培养，开展体外结合。切片采用核固红复染，对每帧中颗粒的数量进行计数，并绘制在图中。图6c表明了人脑中的多功能蛋白聚糖表达。图6d和6e表明了人脑中胼胝体(图6d)和皮层(图6e)的hapln4表达。对阳性免疫组织化学染色进行定量和绘图。平均值±sem,(anova分析；*p<0.05,**p<0.005,***p<0.0005)。

图7a表明了穿透性脑损伤后caqk治疗对损伤体积的影响。脑切片甲酚紫染色皮层损伤体积定量表明，caqk(seqidno:4)中损伤区明显小于cggk(seqidno:6)和盐水对照组。数据以平均值±sem过表达。图7b示出了tbi1周后小鼠分离大脑皮层切片采用甲酚紫对所有细胞染色后的情况。图7c示出了tbi1周后小鼠分离大脑皮层切片采用gfap和iba1染色，分析大脑中的神经炎症的情况。

具体实施方式

通过参考下述特定实施例的详细说明及此处包括的实例、附图及它们的上述和下述说明，可以更容易地了解所述公开的方法和组合物。

我们发现了一种选择性识别脑损伤并在损伤部位积聚的4-氨基酸肽(caqk)。含有这种序列的肽促进全身施用的肽发生积聚。重要的是，这种递送系统的靶在小鼠和人脑损伤中都得到了表达。不管血脑屏障是否存在，含有所述序列的肽都能够将所述肽归巢到和递送到脑内神经系统损伤部位。这可能是由于破坏了神经系统损伤中的血脑屏障。这种靶向和选择性归巢是由于神经系统损伤部位存在所述肽序列能够结合的分子。更重要的是，我们已经发现，所述肽对其归巢的神经系统损伤部位具有治疗效果。

caqk肽的结合靶是cns损伤中过表达的富硫酸软骨素蛋白多糖(cspg)的蛋白质-碳水化合物细胞外基质复合物，特别是由透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和透明质酸蛋白聚糖连接蛋白(hapln)组成。所述靶向富-cspg细胞外基质复合物通常是包含透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln的细胞外基质，其中示例有培养的u251星形细胞瘤细胞基质。这种复合物过表达导致形成富-cspg胶质瘢痕，这种瘢痕是再生的主要障碍。这种富-cspg细胞外基质复合物还在中风和其它神经系统损伤中过表达。众所周知，这种复合物降解会改善中风的结果。在脑缺血导致的中风实验模型中，含caqk的肽亦表现出对损伤部位具有同样的效果。因此，所述发现的肽可以选择性靶向神经系统损伤部位，特别是那些过表达cspg的部位，并对它们具有治疗效果。

公开了选择性靶向和治疗神经系统损伤(如脑损伤和中风损伤、胶质瘢痕形成部位及透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln沉积的部位，及富-cspg细胞外基质复合物)的肽、组合物及方法。所述公开的肽、组合物和方法用于选择性靶向和治疗急性神经系统损伤，如创伤性脑损伤和中风损伤。

公开了包含氨基酸序列caqk(seqidno:4)的肽。在一些形式中，所述肽对神经系统损伤具有治疗效果，并且具有下述性质中的任何一种性质或它们的组合：选择性归巢到神经系统损伤部位；选择性归巢到急性神经系统损伤部位；选择性归巢到脑损伤部位；选择性归巢到急性脑损伤部位；选择性归巢到中风损伤部位；选择性归巢到急性中风损伤部位；与多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln中的一种或多种特异性结合；选择性归巢到胶质瘢痕形成部位；选择性归巢到其中透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln沉积的部位；及选择性归巢到富-cspg细胞外基质复合物。

公开了包括所述公开肽的组合物。一般说来，所述组合物包括所述公开的肽，但并不包括货物组合物或货物分子。

公开的肽和组合物用于选择性靶向和治疗神经系统损伤(如脑损伤和中风损伤、胶质瘢痕形成部位及透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln沉积的部位，及富-cspg细胞外基质复合物)。例如，所述公开的肽和组合物用于选择性靶向和治疗急性神经系统损伤，如创伤性脑损伤和中风损伤。因此，公开了将所述肽选择性靶向受试者急性神经系统损伤部位的方法。

在一些形式中，所述方法涉及将所述公开组合物向具有急性神经系统损伤的受试者施用。所述组合物选择性归巢到受试者的神经系统损伤部位，从而将所述组合物的肽选择性靶向所述神经系统损伤部位。

应该了解的是，除非另外规定，所述公开的方法和组合物并不限于特定的合成方法、特定的分析方法，或特定的试剂，因此，它们可以改变。还应该了解的是，此处使用的词语仅仅是为了描述特定实施例，而并非用于限制。

材料

公开了所述公开方法和组合物可以使用的、可以一起使用的材料、组合物和组分，可用于制备所述组合物的材料、组合物和组分，或所述公开方法和组合物的产品的材料、组合物和组分。这些材料和其它材料在此处公开，并且应该理解的是，当公开了这些材料的组合、子集、相互作用、分组等时，虽然可能并未明确公开这些化合物每个不同个体的和集体的组合和排列，但是，本发明中对每一种都特别考虑并进行了描述。例如，除非另外表明相反，否则，如果公开和讨论了一种肽，则讨论了对包含所述肽的许多分子可以进行的多种修饰，特别考虑了肽和修饰可能存在的每种组合和排列。因此，如果公开了一类分子a、b和c以及一类分子d、e和f，及组合分子的实例，公开了a-d，则即使每个分子并未单独说明，都设想了每个分子单独或集体的情况。因此，实例是，a-e、a-f、b-d、b-e、b-f、c-d、c-e和c-f中的每个组合都是特别设想的，应视为从a、b和c；d、e和f；及实例组合a-d中进行了公开。同样，也特别设想和公开了这些公开的任何子集或组合。因此，例如，特别设想了a-e、b-f和c-e子集，并且应认为是从a、b和c；d、e和f；及实例组合a-d公开中进行了公开；此外，上述设想和公开的这些材料、组合物、组分等中的每一种，还可以是特别地和独立地包括在所述材料的任何组、子组、名单、集合等之内或排除在它们之外。这些概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备所述公开组合物的方法的步骤及使用所述公开组合物。因此，如果可以执行多种其它步骤，应该理解的是，在所述公开方法的任何特定实施例或实施例组合中，可以执行这些其它步骤中的每个步骤，，并且特别设想和视为公开了每个所述组合。

a.caqk组合物

公开了包括所述公开肽的组合物。一般说来，所述组合物包括所述公开的肽，但并不包括货物组合物或货物分子。在一些形式中，所述组合物包括多个caqk肽。

在一些形式中，所述组合物包括一个或多个所述肽拷贝。在一些形式中，所述组合物包括至少5个所述肽拷贝。在一些形式中，所述组合物包括至少10个所述肽拷贝。在一些形式中，所述组合物包括至少100个所述肽拷贝。在一些形式中，所述组合物包括至少1000个所述肽拷贝。在一些形式中，所述组合物包括至少10,000个所述肽拷贝。

在一些形式中，所述公开组合物具有治疗效果。在一些形式中，所述治疗效果可以减少神经系统损伤的损害。在一些形式中，所述治疗效果可以在神经系统损伤后，增加神经系统功能的保留时间。在一些形式中，所述治疗效果可以减少神经系统损伤部位的组织损失。在一些形式中，所述治疗效果可以减少神经系统损伤部位的神经元变性。在一些形式中，与对照治疗相比，所述治疗效果可以减少神经系统损伤的损害。在一些形式中，与对照治疗相比，所述治疗效果可以在神经系统损伤后，增加神经系统功能的保留时间。在一些形式中，与对照治疗相比，所述治疗效果可以减少神经系统损伤部位的组织损失。在一些形式中，与对照治疗相比，所述治疗效果可以减少神经系统损伤部位的神经元变性。在一些形式中，所述受试者可以具有一个或多个靶向位点，其中所述组合物归巢到一个或多个靶向位点。在一些形式中，所述受试者可以具有一个神经损伤部位，其中所述组合物对所述神经系统损伤部位具有治疗效果。

b.caqk肽

公开了特异性归巢到神经系统损伤部位的肽。这些肽包括氨基酸序列caqk，并且caqk序列是归巢的唯一决定子。这些肽可以称为caqk肽。不管血脑屏障是否存在，含有所述序列的肽都可以将所述肽归巢到和递送到脑内神经系统损伤部位。这可能是由于破坏了神经系统损伤中的血脑屏障。这种靶向和选择性归巢是由于神经系统损伤部位存在所述肽序列能够结合的分子。更重要的是，我们已经发现，所述肽对其归巢的神经系统损伤部位具有治疗效果。

通常，所述caqk肽对神经系统损伤具有治疗效果，并且具有下述性质中的任何一种性质或它们的组合：选择性归巢到神经系统损伤部位；选择性归巢到急性神经系统损伤部位；选择性归巢到脑损伤部位；选择性归巢到急性脑损伤部位；选择性归巢到中风损伤部位；选择性归巢到急性中风损伤部位；与多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln中的一种或多种特异性结合；选择性归巢到胶质瘢痕形成部位；选择性归巢到其中透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln沉积的部位；及选择性归巢到富-cspg细胞外基质复合物。

神经系统损伤可以是中枢神经系统损伤、周围神经系统损伤、脑损伤、脊髓损伤、神经损伤、神经元损伤、分布神经系统损伤、自身免疫性疾病引起和或有关的神经系统损伤、急性神经系统损伤及慢性神经系统损伤。

治疗效果可以是下述效果中的任何一种或它们的组合：减少神经系统损伤的损害；神经系统损伤后，增加神经系统功能的保留时间；减少神经系统损伤部位的组织损失；及减少神经系统损伤部位的神经元变性。

在一些形式中，所述肽的长度是100个或100个以下氨基酸，50个或50个以下氨基酸，30个或30个以下氨基酸，20个或20个以下氨基酸，15个或15个以下氨基酸，10个或10个以下氨基酸，8个或8个以下氨基酸，6个或6个以下氨基酸，5个或5个以下氨基酸，或4个氨基酸。在一些形式中，所述肽是线性。在一些形式中，所述肽是环状。

在所述肽的一些形式中，所述氨基酸序列caqk(seqidno:4)位于所述肽的c末端。在一些形式中，所述肽由所述氨基酸序列caqk(seqidno:4)组成。在一些形式中，所述肽是修饰肽。在一些形式中，所述肽是甲基化肽。在一些形式中，所述肽包括甲基化氨基酸片段。在一些形式中，所述肽至少一个位置是n-或c-甲基化。

公开了包含氨基酸序列caqk(seqidno:4)的肽。在一些形式中，所述肽是修饰肽。在一些形式中，所述肽是甲基化肽。在一些形式中，所述一种或多种甲基化肽可以包括甲基化氨基酸片段。在一些形式中，所述肽至少一个位置是n-或c-甲基化。

caqk肽是包含氨基酸序列caqk(seqidno:4)的肽。caqk肽可以由具有标准肽键的标准氨基酸组成或可以包括在非标准氨基酸和/或非标准肽键中。caqk肽可以包括所述肽、氨基酸和/或键的修饰。合适的修饰实例是本领域技术人员熟悉的，并且在本说明书其它地方进行说明。

公开的肽，包括caqk肽，其长度是不超过10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、400、500、1000或2000个残基。在一些形式中，所述肽的长度是至少7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或200个残基。在一些形式中，所述肽的长度是7至200个残基，7至100个残基，7至90个残基，7至80个残基，7至70个残基，7至60个残基，7至50个残基，7至40个残基，7至30个残基，7至20个残基，7至15个残基，7至10个残基，8至200个残基，8至100个残基，8至90个残基，8至80个残基，8至70个残基，8至60个残基，8至50个残基，8至40个残基，8至30个残基，8至20个残基，8至15个残基，8至10个残基，9至200个残基，9至100个残基，9至90个残基，9至80个残基，9至70个残基，9至60个残基，9至50个残基，9至40个残基，9至30个残基，9至20个残基，9至15个残基，9至10个残基，10至200个残基，10至100个残基，10至90个残基，10至80个残基，10至70个残基，10至60个残基，10至50个残基，10至40个残基，10至30个残基，10至20个残基，10至15个残基，15至200个残基，15至100个残基，15至90个残基，15至80个残基，15至70个残基，15至60个残基，15至50个残基，15至40个残基，15至30个残基，15至20个残基，20至200个残基，20至100个残基，20至90个残基，20至80个残基，20至70个残基，20至60个残基，20至50个残基，20至40个残基或20至30个残基。此处所述词语“残基”指的是氨基酸或氨基酸类似物。

caqk肽可以由，例如，氨基酸、氨基酸类似物、肽类似物、氨基酸模拟物、肽模拟物等组成。虽然为了方便起见，此处从氨基酸和由氨基酸组成的肽方面对caqk肽的结构、设计等进行了描述，但是，应该了解的是，类似的氨基酸和肽的类似物、模拟物、修饰形式等也可以作为caqk肽，并以类似的原理设计。

可以减少或消除键处蛋白酶切割的氨基酸的键合和修饰是人们熟悉的，并且可以在公开的肽，包括caqk肽中使用。例如，肽的稳定性和活性可以通过n-甲基化或c-甲基化保护某些肽键而增加。甲基化肽是包含非-天然甲基的肽。肽可以是在氮(n-甲基化肽)、碳(c-甲基化肽)和硫(s-甲基化肽)处甲基化。当一部分肽甲基化时，所述甲基化部分可以称为甲基化氨基酸片段。

多种化学修饰方法和单元在，例如，美国专利nos.5,554,728,6,869,932,6,828,401,6,673,580,6,552,170,6,420,339,美国专利公开2006/0210526和国际专利申请wo2006/136586中进行了描述。所述修饰的一些实例包括肽键替代物，如cudicandstawikowski,peptidomimetics:fmocsolid-phasepseudopeptidesynthesis,inmethodsinmolecularbiology,vol.294,223-246(2008)中描述的那些替代物，及化学修饰，如马来酰亚胺加帽、聚乙二醇(peg)连接、马来酸化、酰化、烷基化、酯化和酰胺化，从而产生所述肽的结构类似物。

所述公开的肽可以以稳定化肽的形式制备和/或配制为长-循环形式。例如，可以采用聚乙二醇结合物。所述公开的肽还可以在一段时间内施用。例如，肽可以采用渗透泵递送。这样可以延长靶细胞和组织的渗透性。可以采用肽的修饰形式。例如，肽可以是甲基化肽(可以稳定肽，防止蛋白质水解)。

应该了解的是，所述公开的肽中包括许多种氨基酸和肽类似物。例如，可以采用许多d氨基酸或其它非天然氨基酸。公开了和天然肽相反的立体异构物，以及肽类似物的立体异构物。这些氨基酸很容易通过化学合成包括到多肽链内或通过选择的氨基酸和工程基因构建体装载trna分子，所述工程基因构建体利用，例如，琥珀密码子，以位点特异性方式将类似氨基酸插入到肽链内((albericio,f.(2000).solid-phasesynthesis:apracticalguide(1ed.).bocaraton:crcpress；nilssonbl,soellnermb,rainesrt(2005)."chemicalsynthesisofproteins".annu.rev.biophys.biomol.struct.34:91–118；thorsonetal.,methodsinmolec.biol.77:43-73(1991),zoller,currentopinioninbiotechnology,3:348-354(1992)；ibba,biotechnology&geneticengineeringreviews13:197-216(1995),cahilletal.,tibs,14(10):400-403(1989)；benner,tibtech,12:158-163(1994)；ibbaandhennecke,bio/technology,12:678-682(1994)，通过引用，这些文献至少有关氨基酸类似物的材料都纳入本申请中。

可以制备类似肽，但不通过天然肽键连接的肽。例如，氨基酸或氨基酸类似物的键可以包括ch2nh-、-ch2s-、-ch2-ch2-、-ch＝ch-(顺式和反式)、-coch2-、-ch(oh)ch2-和-chh2so。这些和其它见spatola,a.f.inchemistryandbiochemistryofaminoacids,peptides,andproteins,b.weinstein,eds.,marceldekker,newyork,p.267(1983)；spatola,a.f.,vegadata(march1983),vol.1,issue3,peptidebackbonemodifications(generalreview)；morley,trendspharmsci(1980)pp.463-468；hudson,d.etal.,intjpeptprotres14:177-185(1979)(-ch2nh-,ch2ch2-)；spatolaetal.lifesci38:1243-1249(1986)(--chh2--s)；hannj.chem.socperkintrans.i307-314(1982)(-ch-ch-,cisandtrans)；almquistetal.j.med.chem.23:1392-1398(1980)(-coch2-)；jennings-whiteetal.tetrahedronlett23:2533(1982)(-coch2-)；szelkeetal.europeanappln,ep45665ca(1982):97:39405(1982)(-ch(oh)ch2-)；holladayetal.tetrahedron.lett24:4401-4404(1983)(-c(oh)ch2-)；andhrubylifesci31:189-199(1982)(-ch2-s-)；通过引用，以上每篇文献都纳入本申请中。特别有用的非-肽键是-ch2nh-。应该了解的是，肽类似物在键合原子之间可以具有不止一个原子，例如，b-丙氨酸、g-氨基丁酸等。

氨基酸类似物和肽类似物通常具有增强或期望的性质，例如，生产更经济、化学稳定性更好、药物学性质增强(半衰期、吸附、效力、功效等)、特异性改变(例如，广谱生物活性)、抗原性降低等。

由于d-氨基酸未被肽酶等识别，因此，d-氨基酸可用于产生更稳定的肽。可以采用同一类型d-氨基酸系统替换共有序列一个或多个氨基酸(例如，d-赖氨酸替换l-赖氨酸)来产生更稳定的肽，只要活性得到保留的话。半胱氨酸残基可用于将两个或多个肽环化或连接在一起。这样有益于将肽限制在特定的构象中(rizoandgieraschann.rev.biochem.61:387(1992),incorporatedhereinbyreference)。

所述公开的组合物可以包括或采用各种形式的所述公开的caqk肽，包括公开的肽和拟肽。为了表达方便，在本发明中的许多地方将叙述使用或包括肽。应该了解的是，在这些情况下，我们认为，使用或包括各种形式的caqk肽的方式与谈到肽时描述的方式相同或类似，而且从而特别设想和公开了所述使用和包括。

此处所述词语“肽”为广义使用，指的是肽、蛋白质、蛋白质片段等。肽是由化学上结合在一起的氨基酸组成的一类化合物。一般说来，所述氨基酸通过肽中的酰胺键(conh)化学上结合在一起。所述词语“拟肽”指的是以结构为基础，具有肽的活性的类似肽的分子。所述拟肽包括化学上修饰的肽、含非天然氨基酸的类肽分子，及类肽，并且具有，例如，衍生拟肽的肽的活性(参见，例如，goodmanandro,peptidomimeticsfordrugdesign,in"burger'smedicinalchemistryanddrugdiscovery"vol.1(ed.m.e.wolff；johnwiley&sons1995),pages803-861)。正如本领域所熟悉的那样，在拟肽的一些形式中，氨基酸可以通过化学键而不是酰胺键结合在一起。例如，所述氨基酸可以通过胺键结合。肽的c-末端指的是具有肽的末端羧基的肽末端。从所述肽的n至c方向考虑时，这是所述肽的最后一个氨基酸。caqk肽在此处别的地方进一步描述和定义。

此处所述词语“非天然氨基酸”指的是结构与天然氨基酸类似，从而模拟天然氨基酸的结构和反应性的有机化合物。当采用所述非天然氨基酸替代天然氨基酸或包括到肽中时，此处定义的非天然氨基酸通常增加或增强肽的性能(例如，选择性、稳定性)。

此处所述词语“归巢分子”指的是优先于正常组织而体内选择性归巢到特异性细胞或特异性组织的任何分子。同样，此处所述词语“归巢肽”或“归巢拟肽”指的是优先于正常组织而体内选择性归巢到特异性细胞或特异性组织的肽。应该了解的是，归巢分子体内选择性归巢到特异性细胞或特异性组织，或者优先归巢到特异性细胞或特异性组织。caqk肽是归巢分子的一个实例。

此处所述词语“治疗归巢分子”指的是本身对其归巢部位具有治疗效果的归巢分子。也就是说，所述归巢分子的治疗效果超过组合物中任何其它分子或其它分子没有效果及超过仅所述分子归巢的效果。caqk肽是治疗归巢分子的一个实例。

此处所述“选择性归巢”指的是与非靶相比，所述归巢分子在体内优先与靶结合。例如，相对于正常或未损伤组织，所述归巢分子可以优先与神经系统损伤部位的靶点结合。例如，选择性归巢到神经系统损伤部位通常通过与几种非神经系统组织类型或非损伤神经系统组织相比，神经系统损伤部位至少大两倍的定位表征。归巢分子的特征在于，例如，相比一个或多个非靶点，5-倍、10-倍、20-倍或更多倍优先定位到靶点。例如，归巢分子的特征在于，例如，与几种非神经系统组织类型或非损伤神经系统组织相比，或与大多数或所有非-神经系统组织相比，5-倍、10-倍、20-倍或更多倍优先定位至神经系统损伤部位。因此，应该了解的是，在一些情况下，归巢分子，如caqk肽，除归巢到靶组织外，还部分归巢到一个或多个正常器官或一个或多个正常组织。选择性归巢亦可以称为靶向。归巢分子靶向的分子、蛋白质、细胞、组织等可以称为靶、靶分子、蛋白质、细胞、组织等。

c.货物组合物

货物组合物是分子或组合物，如果它们与组合物中的所述公开肽结合，则将被靶向和归巢到所述肽的靶(例如，神经系统损伤部位)。所述货物组合物可以是或可以包含可以被期望被靶向至神经系统损伤部位的货物。货物分子是任何分子，如果它们与组合物中的所述公开肽结合，则将被靶向和归巢到所述肽的靶(例如，神经系统损伤部位)。所述结合(如果存在的话)，可以是直接或间接结合及共价或非共价结合。通常，货物组分子是可以被期望被靶向至神经系统损伤部位的货物。

在发现所述公开肽本身具有治疗效果(以及能够靶向和归巢到神经系统损伤部位)之前，人们认为，为了达到将所述肽归巢到神经系统损伤部位的目的，所述与公开肽结合的货物组合物和货物分子非常重要。一旦发现所述公开肽本身对神经系统损伤具有治疗效果，我们马上认识到所述货物组合物可以省略。因此，在优选形式中，所述公开组合物并不包括或包含货物组合物或货物分子。在此上下文中，所述货物组合物和货物分子是可以被期望靶向神经系统损伤部位的任何组合物或分子。

特别是，不包括在所述公开组合物中的货物组合物和货物分子包括治疗剂和标记。更特别地说，不包括在所述公开组合物中的货物组合物和货物分子包括将靶向神经系统损伤部位，具有对神经系统损伤的特有的治疗效果的组合物和分子。例如，在所述公开组合物的一些形式中，所述肽是所述组合物中的唯一活性成分，所述组合物将缺少体内检测所述组合物的标记。

方法

a.制备方法

所述公开组合物的所述公开肽和其它组分通常可以采用人们熟悉的方法合成和制备，其中一些方法在本发明的其它地方描述。例如，肽合成的方法是人们熟悉的，可用于制备所述公开的肽。

所述组合物中caqk肽的数量和组成的充分性通过评估非人类动物中所述肽归巢到靶点和有效递送而确定。所述组合物可以包括数量和组成足够的caqk肽，从而所述组合物归巢到靶点，并有效递送caqk肽。在一个实例中，修饰和/或未修饰caqk肽的数量和组成的充分性可以通过评估肽递送和/或对靶点的治疗效果进行确定。

此处提到组分(如肽和载体)时称“非共价耦合”指的是所述组分并非通过共价键连接(例如，所述肽和载体不通过共价键连接)。也就是说，例如，所述肽和载体之间并没有共价键连续链。相反，此处提到组分(如肽和载体)时称“共价耦合”指的是所述组分通过共价键连接(例如，所述肽和载体通过共价键连接)。也就是说，例如，所述肽和载体之间存在共价键连续链。各组分可以直接或间接共价耦合。直接共价耦合指的是每个组分的原子之间存在共价键。间接共价耦合指的是每个组分的原子之间缺少共价键。也就是说，在组分的原子之间插入了一些不属于任何耦合组分的其它原子。直接和间接共价耦合都涉及共价键连续链。

非-共价结合指的是组分通过非共价键和相互作用结合。非共价结合可以是直接或间接结合。直接非共价结合指的是非共价键，涉及其中每个原子分别通过共价键链与组分连接的原子。因此，在直接非共价结合中，结合的组分之间不插入其它任何分子。间接非共价结合指的是与组分连接的任何分子链和键，其中所述组分是非共价耦合的(也就是说，在组分之间通过非共价键插入至少一个除组分以外的其它独立分子)。

谈到组分(如肽和载体)为“非共价结合”时，指的是组分之间不存在任何直接或间接非共价结合。也就是说，例如，在与载体共价耦合的原子的非共价键中，不涉及任何原子和肽共价耦合。在此意义中，肽和载体可以都在一个组合物中，其中它们通过多个插入的非共价键间接结合，而不是如此处定义的词语那样的非-共价结合。例如，肽和载体可以在载体中混合在一起，其中它们并非直接非-共价结合。被称为非间接非共价结合的肽和载体不能在连续组合物中混合在一起。谈到组分(如肽和载体)为并非“直接非共价结合”时，指的是组分之间不存在任何直接非共价结合(可能存在间接非-共价结合)。谈到组分(如肽和载体)为并非“间接非共价结合”时，指的是组分之间不存在任何直接或间接非共价结合。

应该了解的是，各组分可以通过多条链和路径非共价结合，包括直接和间接非-共价结合。在这些定义中，单个直接非共价结合的存在使结合直接非共价结合，即使还存在间接非-共价结合。同样，组分之间存在共价连接指的是组分共价结合，即使还有非共价结合存在。还应该了解的是，彼此恰巧缺少任何非-共价结合的共价结合组分并不被认为属于不是非-共价结合的组分的定义范畴。

b.靶向和治疗方法

公开的的肽和组合物用于选择性靶向和治疗神经系统损伤(如脑损伤和中风损伤、胶质瘢痕形成部位及透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln沉积的部位，及富-cspg细胞外基质复合物)。例如，所述公开的肽和组合物用于选择性靶向和治疗急性神经系统损伤，如创伤性脑损伤和中风损伤。因此，公开了将所述公开肽选择性靶向受试者急性神经系统损伤部位的方法。

在一些形式中，所述方法涉及将所述公开组合物向具有急性神经系统损伤的受试者施用。所述组合物选择性归巢到受试者的神经系统损伤部位，从而将所述组合物的肽选择性靶向所述神经系统损伤部位。

在一些形式中，所述神经系统损伤包括脑损伤。在一些形式中，所述肽选择性归巢到脑损伤部位。在一些形式中，所述脑损伤包括创伤性脑损伤、中风损伤或它们两者。在一些形式中，所述肽与多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln中的一种或多种特异性结合。在一些形式中，所述肽选择性归巢到胶质瘢痕形成部位。在一些形式中，所述肽选择性归巢到其中透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln沉积的部位。在一些形式中，所述肽选择性归巢到富-cspg细胞外基质复合物。

所述公开的肽和组合物尤其用于靶向急性神经系统损伤。因此，在一些形式中，所述组合物可以在损伤时间附近施用或在损伤急性期施用。在一些形式中，所述组合物在神经系统损伤开始的10天内施用。在一些形式中，所述组合物在神经系统损伤开始的5天内施用。在一些形式中，所述组合物在神经系统损伤开始的24小时内施用。

特别公开了将所述公开的肽选择性靶向受试者的急性神经系统损伤部位的方法，其中所述方法涉及将所述组合物向具有急性神经系统损伤的受试者施用，其中所述组合物包括肽，其中所述肽由氨基酸序列caqk(seqidno:4)组成。所述组合物选择性归巢到受试者的神经系统损伤部位，从而将所述组合物的肽选择性靶向所述神经系统损伤部位。

研究表明，不同正常组织内循环的血液可以接近的分子靶具有广泛的分子异质性。此外，病理变化，如肿瘤和损伤位置，亦会将其本身的变化施加到这些可以接近的分子靶上。靶向这些可以接近的分子靶使坞基(“突触”)靶向选择性递送诊断和治疗药物到特定组织。这种方法可以提供更好的效果和消除副作用。已经建立了这种靶向递送原理，特别是在癌症中。人们已经认识到，将药物递送靶向到循环血液可以接近的分子靶，因为其容易接近，因此，可能更有效。当某些所述靶向诊断和治疗药物渗透到脉管系统外存在问题时，存在出现caqk肽靶的损伤为所述公开的靶向肽和组合物提供了进入点和通道。。

归巢分子识别和/或与其靶结合中的结合指的是共价和非共价结合，例如，其中靶向分子可以通过共价和/或非共价结合与其靶结合、连接或耦合。结合可以是高亲和力或低亲和力结合，优选高亲和力结合。有用的结合力实例包括但不限于共价键、偶极相互作用、静电力、氢键、疏水作用、离子键和/或范德华力。除与所述公开靶向肽和组合物发生的结合外，可以发生这种结合。

此外，还公开了选择性靶向富-cspg细胞外基质复合物的方法(包含透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln的细胞外基质，其中示例有培养的u251星形细胞瘤细胞基质)。所述方法涉及向受试者施用一种组合物，其中所述组合物包括治疗归巢分子和药学上可接受的载体。所述组合物选择性归巢到富-cspg细胞外基质复合物，从而选择性靶向富-cspg细胞外基质复合物。

在所述方法的一些形式中，所述治疗归巢分子与多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln中的一种或多种特异性结合。在所述方法的一些形式中，所述治疗归巢分子选择性归巢到其中透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln沉积的部位。在所述方法的一些形式中，所述组合物静脉注射施用。在所述方法的一些形式中，所述组合物全身施用。

1.靶和受试者

所述公开组合物可以靶向，并归巢到神经系统损伤部位。此处所述“神经系统损伤”指的是神经系统任何部分的损伤或损害。神经系统的不同部分可以受到损伤，所述损伤可以按其神经系统损伤部位命名。因此，例如，中枢神经系统损伤、周围神经系统损伤、脑损伤、脊髓损伤、神经损伤和神经元损伤分别指的是中枢神经系统、周围神经系统、脑、脊髓、神经和神经元的损伤。有些神经系统损伤可以是分布式的，例如，神经退行性疾病(如阿尔茨海默病和帕金森氏症)、脱髓鞘病(如多发性硬化症)及影响神经或神经系统部分或组分的自身免疫性疾病。神经系统损伤可以是急性的或慢性的。

神经系统损伤可以是许多原因引起的，包括事故和疾病。所述公开的肽、组合物和方法大多数用于急性神经系统损伤，它们可以是相同原因引发的。所述急性损伤指的是突然事件或状况变化引起的损伤。例如，交通事故、枪击、摔跤、中风和心脏病发作都可以是急性损伤，包括急性神经系统损伤的原因。例如，急性脑损伤可以由，例如，开放性脑损伤、闭合性脑损伤、减速伤、缺氧和中风引发。

开放性脑损伤可以是由枪伤、压伤、贯通伤等引起的。伤害倾向于局灶性及涉及颅骨贯穿。闭合性脑损伤可以是由摔倒、机动车撞击等引起的。伤害可以是局灶性的和弥漫性的，影响倾向于广泛且弥漫。闭合性脑损伤不存在任何颅骨穿透。减速伤倾向于造成弥漫性轴索损伤。减速伤倾向于因头部受到撞击时，颅骨和脑部运动差异而引发。这样会因弥漫性轴索剪切、挫伤和脑肿胀而导致直接脑损伤。当脑部颅骨内来回猛击，由于凝胶稠度而交替压缩和拉伸时，发生弥漫性轴索剪切。如果冲击足够强烈，轴索会被拉长，直到它们被撕破，导致轴索剪切。脑组织缺氧可以由血液中氧含量降低而引发。缺氧可以由，例如，心脏病发作、呼吸衰竭、血压下降及低氧环境引发。脑组织中风可以由脑部或部分脑部血流中断引发或，例如，由血管堵塞或出血引发。

胶质瘢痕形成(神经胶质增生)是涉及星形胶质细胞增生的反应性细胞过程，星形胶质细胞增生在中枢神经系统损伤后出现。人们已经表明，在神经退行性疾病中，胶质瘢痕形成既有有益作用亦有有害作用。特别是，瘢痕内细胞分泌许多神经发育抑制剂分子，阻碍损伤后或患病后中枢神经系统的体能和机能完全恢复。另一方面，胶质瘢痕缺失与血脑屏障修复损害有关。胶质瘢痕由几种成分组成：反应性星形胶质细胞、小胶质细胞、内皮细胞、成纤维细胞和基膜组成。相对所述公开的肽、组合物和方法，所述基膜是最重要的，因为构成基膜的组织病理学细胞外基质包括caqk肽的靶。

所述公开肽和组合物的主要靶是富-cspg蛋白质-碳水化合物细胞外基质复合物，也就是说富硫酸软骨素蛋白多糖(cspg)，并且它是在神经系统损伤中产生的。这些富-cspg细胞外基质复合物(在此亦称为cr-ecm和富-cspg复合物)是所述公开caqk肽的结合和归巢靶。在此方面，所述富-cspg复合物包含与所述公开caqk肽结合的分子/结构。所述富-cspg细胞外基质复合物包括定义所述复合物的多种蛋白质和碳水化合物聚合物。虽然不同的ecm具有共同的组分和特征，但是，不同形式的ecm的特征在于特异性蛋白质和碳水化合物聚合物。神经系统损伤中产生的富-cspg细胞外基质复合物包括透明质酸等组分，cspg围绕其组装。在神经系统损伤中产生的富-cspg细胞外基质复合物中，重要的cspg包括磷酸蛋白聚糖、神经元-胶质细胞抗原2(ng2)及cspg凝集蛋白聚糖家族的成员：聚集蛋白聚糖、短蛋白聚糖、神经蛋白聚糖和多功能蛋白聚糖。神经系统损伤中产生的富-cspg细胞外基质复合物中还存在糖蛋白，如肌腱蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白，及蛋白质，如透明质酸蛋白聚糖连接蛋白(hapln)。所述富-cspg细胞外基质复合物有用的参考形式是培养的u251星形细胞瘤细胞产生的基质。除非上下文另外说明，“富-cspg细胞外基质复合物”、“cr-ecm”和“富-cspg复合物”指的是此段表征的细胞外基质，并以培养的u251星形细胞瘤细胞产生的基质示例，不应认为仅仅是富含cspg或cspg含量高的任何细胞外基质复合物。

透明质酸(ha；亦称为透明质酸)是结缔组织、上皮组织和神经组织中广泛分布的阴离子非硫酸化糖胺聚糖。在糖胺聚糖中，它的独特性在于其是非硫酸化的，在质膜而非高尔基体中形成，可以非常大，分子量通常达到数百万(fraseretal.,j.intern.med.242(1):27-33(1997))。透明质酸是细胞外基质的主要组分之一。

多功能蛋白聚糖是许多人类组织中存在的大型细胞外基质蛋白聚糖。它由vcan基因编码(iozzoetal.,genomics14(4):845–51(1992))。多功能蛋白聚糖是大型硫酸软骨素蛋白多糖，表观分子量大于1000kda。1989年，zimmermann和ruoslahti对成纤维细胞硫酸软骨素蛋白多糖的核心蛋白进行了克隆和测序(zimmermannandruoslahti,emboj.8(10):2975–81(1989)。他们按照其多样化的模块结构而将其命名为多功能蛋白聚糖。多功能蛋白聚糖属于凝集蛋白聚糖家族，其它成员是聚集蛋白聚糖(软骨中含量丰富)、短蛋白聚糖和神经蛋白聚糖(神经系统蛋白聚糖)。多功能蛋白聚糖亦称为硫酸软骨素蛋白多糖核心蛋白2或硫酸软骨素蛋白多糖2(cspg2)和pg-m。

磷酸蛋白聚糖是中枢神经系统细胞外基质中主要的蛋白聚糖之一，与神经元分化和髓鞘形成有关的神经元-神经胶质相互作用关系密切。虽然磷酸蛋白聚糖在cns中以大型cspg(>800kda)出现(faissneretal.,j.cellbiol.126:783-799(1994))；但是，实际上，它是甚至更大的跨膜受体蛋白酪氨酸磷酸酶(rptp)、rptp-β的分泌剪接变异体，亦称为ptp-ζ)。因此，磷酸蛋白聚糖与长rptp-β受体整个细胞外部分对应。这些蛋白质的特征在于其细胞外n末端的碳酸酐酶-类(ca)域。

肌腱蛋白-r(tnr)是主要在中枢神经系统中表达的细胞外基质蛋白质。它是肌腱蛋白(tn)基因家族的成员，该家族包括哺乳动物中的至少3个基因：tnc(或六臂体)、tnx(tnxb)和tnr(erickson,curr.opin.cellbiol.5(5):869-76(1993))。所述基因在胚胎发育期间的不同时间内在不同组织中表达，并且在成年组织中存在。

透明质酸蛋白聚糖连接蛋白(hapln)将透明质酸与多功能蛋白聚糖(及其它蛋白聚糖)连接。caqk肽的靶涉及的hapln似乎是hapln4(spiceretal.,jbiolchem278(23):21083-21093(2003))。

层粘连蛋白是细胞外基质的高分子量(～400kda)蛋白质。它们是基底层(基膜的其中一层)的主要成分，是大多数细胞和器官的蛋白质网络基础。层粘连蛋白是包含α-链、β-链和γ-链的异源三聚体蛋白质，分别在五个、四个和三个遗传变异体中发现。层粘连蛋白分子按照其链组成命名。糖蛋白的层粘连蛋白家族是生物几乎每个组织中结构脚手架必不可少的一部分。它们被分泌和包括到细胞-相关细胞外基质中。

纤连蛋白是细胞外基质的高分子量(～440kda)糖蛋白，与称为整合素的跨膜受体蛋白结合。与整合素类似，纤连蛋白与细胞外基质组分，如胶原蛋白、纤维蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白多糖(如多配体聚糖)结合。纤连蛋白以蛋白质二聚体存在，所述二聚体由两个通过一对二硫键连接的几乎相同的单体组成。不溶的细胞纤连蛋白是细胞外基质的主要组分。它由不同的细胞，主要是成纤维细胞分泌，作为可溶的蛋白质二聚体，然后，在复杂的细胞-介导过程中组装成不溶的基质。纤连蛋白在细胞粘附、生长、迁移和分化中起主要作用，它对伤口愈合和胚胎发育过程等也非常重要。

由于存在结合caqk肽的靶，因此，caqk肽靶向和归巢到神经系统损伤部位。所述靶位于产生神经细胞外基质的损伤部位，特别是，其中损伤后产生富-cspg细胞外基质(含透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln的细胞外基质，实例有培养的u251星形细胞瘤细胞基质)的损伤部位。因此，所述caqk肽可以被靶向，并将归巢到其中产生富-cspg细胞外基质复合物的部位。同样，所述caqk肽还可以被靶向，并将归巢到其中caqk肽特定靶、透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln沉积的部位。在此背景中，“沉积”指的是新的或更大数量的这些蛋白质，通常作为细胞外基质组分。

所述caqk肽可以选择性归巢到神经系统损伤部位。所述caqk肽可以选择性归巢到急性神经系统损伤部位。所述caqk肽可以选择性归巢到脑损伤部位。所述caqk肽可以选择性归巢到急性脑损伤部位。所述caqk肽可以选择性归巢到中风损伤部位。所述caqk肽可以选择性归巢到急性中风损伤部位。所述caqk肽与多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln中的一种或多种选择性结合。所述caqk肽可以选择性归巢到胶质瘢痕形成部位。所述caqk肽选择性归巢到其中透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln沉积的部位。所述caqk肽选择性归巢到富-cspg细胞外基质复合物。

所述组合物可以选择性归巢到神经系统损伤部位。所述组合物可以选择性归巢到急性神经系统损伤部位。所述组合物可以选择性归巢到脑损伤部位。所述组合物可以选择性归巢到急性脑损伤部位。所述组合物可以选择性归巢到中风损伤部位。所述组合物可以选择性归巢到急性中风损伤部位。所述组合物与多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln中的一种或多种选择性结合。所述组合物可以选择性归巢到胶质瘢痕形成部位。所述组合物可以选择性归巢到其中透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln沉积的部位。所述组合物选择性归巢到富-cspg细胞外基质复合物。

i.创伤性脑损伤(tbi)

tbi是世界上残疾和死亡的主要原因，是因中风、车祸、运动伤害、爆炸伤害、攻击和摔跤引起的。特别是，中风是大脑血流不畅导致细胞死亡而引发的疾病。中风有两种主要类型。出血性中风是由于动脉瘤或血管脆弱引发出血自发引起的。局部缺血是更常见的中风类型，是由于大脑缺血导致组织死亡而引发的。许多因素可以导致供血不足，如动脉粥样硬化、低血糖、心动过速、低血压、贫血、冻伤、肿瘤、止血带应用、过早停用任何口服抗凝药和镰状细胞贫血病。

tbi导致神经元损伤，是由一次损伤机制和二次损伤机制导致的。一次损伤机制涉及创伤发生时的机械冲击和惯性力，因剪切、撕裂或拉伸而导致细胞应变和损害神经元、轴索、胶质细胞和血管。二次损伤机制可以在数分钟内发生，但是也会在初次创伤性损伤后，因一次事件引发的延迟生化反应、代谢和细胞变化而在数天和甚至数月中演变。物理损害影响血脑屏障，导致炎症细胞因子和趋化因子浸润到脑实质内，引起发炎。在二次伤害期间，蛋白酶(如钙蛋白酶和半胱天冬酶)由于坏死或编程性细胞死亡而导致细胞死亡(loaneetal.,trendspharmacol.sci.31:596-604(2010)；schochetal.,neurotherapeutics9:323-337(2012))。人们认为，这些二次伤害级联负责tbi后许多神经系统问题的发展，它们的延迟性质表明存在一个药物或其它治疗的窗口，从而阻止进行性组织损伤和改善结果(loaneetal.,trendspharmacol.sci.31:596-604(2010))。

ii.胶质瘢痕形成

中枢神经系统(cns)的胶质细胞，包括星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞及它们的前体细胞，提供结构和生理支持，还对损伤或疾病有响应。cns损伤会导致胶质瘢痕形成，这是一个既具有有益影响又具有有害影响的过程。最终，瘢痕重建cns的物理和化学完整性，并且对于修复血脑屏障非常重要(faulkneretal.,j.neurosci.24:2143-2155(2004))。但是，胶质瘢痕还阻止神经元重新生长，从而对cns的物理和机能恢复非常不利(silveretal.,nat.rev.neurosci.5:146-156(2004))。

反应性星形胶质细胞是在称为星形胶质细胞增生的过程中产生的，是胶质瘢痕的主要细胞组分。星形胶质细胞经历形态变化，产生细胞外基质，例如，硫酸软骨素蛋白多糖(cspg)，在物理上和化学上抑制轴索生长。已经证明，抑制星形胶质细胞增生或阻止cspg合成或降解cspg这一策略可以消除轴索生长抑制和改善功能。

cspg通常由细胞分泌，并且是各种人类组织，包括软骨的结构组分。它们由核心蛋白和糖侧链组成。核心蛋白通常是糖蛋白，侧链是通过共价键连接的糖胺聚糖(gag)糖链。已经鉴定的cspg有聚集蛋白聚糖(cspg1)、多功能蛋白聚糖(cspg2)、神经蛋白聚糖(cspg3)、cspg4-6、短蛋白聚糖(cspg7)、cspg8和磷酸蛋白聚糖。神经蛋白聚糖、短蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖都共享类似的n-末端和c-末端域，构成蛋白聚糖的凝集蛋白聚糖家族。凝集蛋白聚糖和肌腱蛋白-r相互作用，形成三元复合物。聚集蛋白聚糖是软骨和关节功能细胞外基质的主要组分，而多功能蛋白聚糖在许多结缔组织(包括血管平滑肌中的那些结缔组织)、皮肤上皮细胞，及中枢和周围神经系统细胞中广泛表达。神经蛋白聚糖和短蛋白聚糖的表达很大程度上限于神经组织。

cspg在神经发育和胶质瘢痕形成中起关键作用。它们参与细胞过程，如细胞粘附、细胞生长、受体结合、细胞迁移及与其它细胞外基质组分相互作用。它们还与层粘连蛋白、纤连蛋白、肌腱蛋白和胶原蛋白相互作用。众所周知，cspg通过充当阻止轴索生长到损伤部位的屏障，抑制脊髓损伤后轴索再生。cspg在解释损伤后脊髓不会自我再生方面起着重要作用。

与受影响区域大脑功能恢复有关的塑性，对cspg下调有作用。能够从诱导中风中恢复的大鼠表现出几种cspg下调，包括聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖和磷酸蛋白聚糖下调(galtreyetal.,brainres.rev.54:1-18(2007))。未恢复任何大脑功能的大鼠并未出现明显的cspg下调。中风后有些大脑功能恢复的大鼠，其cspg减少，表明cspg含量越低，神经连接越多。能够下调cspg的药物可以帮助中风患者恢复更多大脑功能。

cspg还与阿尔茨海默病和癫痫联系密切。虽然阿尔茨海默病大多数的特征在于神经纤维缠结和衰老斑，但是，阿尔茨海默病患者死后，检查大脑的这些特征表明也存在cspg。cspg4和cspg6，都位于神经纤维缠结和衰老斑的周边，还发现在营养不良的神经元上存在。由于cspg的抑制效果，这些结果表明，cspg在阿尔茨海默病进展中起着十分重要的作用，可以负责促进神经纤维缠结和衰老斑周围神经元的回归。靶向神经纤维缠结和衰老斑内cspg的药物有助于减缓阿尔茨海默病的某些症状。

癫痫是以癫痫发作为特征的一种疾病，是因大脑中神经活动过多引起的。研究人员已经观察到，癫痫患者大脑内cspg在某种程度上被清除。研究已经表明，癫痫患者颞叶和海马中的磷酸蛋白聚糖降低，表明cspg在控制轴索再生长方面起作用(galtreyetal.,brainres.rev.54:1-18(2007))。此外，已经表明，在动物模型中，癫痫发作引发海马内脑源性神经营养因子(bdnf)mrna和蛋白质上调。bdnf是主要位于cns内的一种蛋白质，在cns内，它作用于大脑和眼睛细胞，导致某种类型的神经细胞生存和生长。在周围神经系统中，bdnf促进感觉神经元和运动神经元生长。在大脑中，bdnf由神经细胞或支持细胞释放，如星形胶质细胞，然后，与附近神经细胞上的受体结合。这种结合导致产生能够被转运到接受神经细胞核的信号。在此处，它提高与神经细胞生存和功能有关的蛋白质产生量。在动物模型中，融合抗-bdnf剂或使用bdnf敲除的小鼠表现出癫痫发生(binderetal.,growthfactors22:123-131(2004))。

除上述疾病外，胶质瘢痕形成在许多涉及cns的疾病中发生，如科尔萨科夫综合征、多系统萎缩症、朊病毒病、多发性硬化症、艾滋病痴呆复合征、血管炎、帕金森氏症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(als)和亨廷顿氏舞蹈病(mcmillianetal.,trendsneurosci.17:138-142(1994))。在自身免疫性疾病，如多发性硬化症中，髓磷脂损害可能因星形胶质细胞和小胶质细胞产生的细胞因子而加重。这会改变血脑屏障渗透性，使淋巴细胞迁移到cns内，从而放大自身免疫性疾病的影响(barron,j.neurol.sci.134:57-68(1995))。已经表明，als涉及通过丧失其神经保护能力或通过获得神经毒性影响，从而涉及反应性星形胶质细胞。als后期还具有以下特征：退化区周围明显的星形细胞胶质化和星形胶质细胞增生(verkhratskyetal.,neurotherapeutics7:399-412(2010))。

2.治疗

所述公开的肽和组合物用于治疗神经系统损伤。通过选择性靶向神经系统损伤(如脑损伤和中风损伤)，胶质瘢痕形成部位，透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln沉积部位，及富-cspg细胞外基质复合物，所述公开组合物可以将所述治疗肽递送到其最有效的部位。所述组合物选择性归巢到受试者的神经系统损伤部位，从而将所述组合物的所述肽选择性靶向所述神经系统损伤部位，使所述组合物中的所述肽在神经系统损伤部位发挥作用。

在一些形式中，所述神经系统损伤包括脑损伤。在一些形式中，所述肽选择性归巢到脑损伤部位，并对脑损伤部位具有治疗效果。在一些形式中，所述脑损伤包括创伤性脑损伤、中风损伤或它们两者。在一些形式中，所述肽与多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln中的一种或多种特异性结合，并具有治疗效果。在一些形式中，所述肽选择性归巢到胶质瘢痕形成部位，并对其具有治疗效果。在一些形式中，所述肽选择性归巢到其中透明质酸、多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln沉积的部位，并对其具有治疗效果。在一些形式中，所述肽选择性归巢到富-cspg细胞外基质复合物，并对其具有治疗效果。

所述组合物可以采用任何合适的路径施用。在一些形式中，所述组合物采用静脉注射施用。在一些形式中，所述组合物全身施用。在一些形式中，所述组合物局部施用。

所述公开的肽和组合物尤其用于靶向急性神经系统损伤。因此，在一些形式中，所述组合物在神经系统损伤时间附近施用或在损伤急性期施用。在一些形式中，所述组合物在神经系统损伤开始的10天内施用。在一些形式中，所述组合物在神经系统损伤开始的5天内施用。在一些形式中，所述组合物在神经系统损伤开始的24小时内施用。

特别公开了将所述公开的肽选择性靶向受试者的急性神经系统损伤部位的方法，其中所述方法涉及将所述组合物向具有急性神经系统损伤的受试者施用，其中所述组合物包括肽，其中所述肽由氨基酸序列caqk(seqidno:4)组成。所述组合物选择性归巢到受试者的神经系统损伤部位，从而将所述组合物的肽选择性靶向所述神经系统损伤部位。

所述公开方法至少在神经系统损伤开始多天后，在神经系统损伤部位存在caqk肽的靶且该靶可以接近时最有效，。治疗剂对神经系统损伤的有效性通常还取决于其在神经系统损伤出现后立即使用。所述公开的治疗方法通常将作为与神经系统损伤原因有关的一组治疗的一部分。例如，创伤性脑损伤急救应在损伤后所谓“黄金时间”内开始。治疗取决于患者的恢复阶段。在急性期，医务人员的主要目的是稳定患者，重点是防止进一步损伤，因为几乎不可能逆转创伤导致的初始损伤。恢复的亚急性和慢性状态的主要治疗重点是康复治疗。

一方面，此处所述组合物可以向需要减轻或改善识别的医疗状况的受试者施用，包括人类和动物，动物包括但不限于老鼠、狗、猫、马、牛、羊等。

所述肽和组合物的剂量或用量足够大，从而产生所述方法期望的效果。所述剂量不应过大，从而导致不良副作用，如不想要的交叉反应、过敏性反应等。通常，所述剂量随受试者年龄、身体状况、性别和疾病程度而变化，可以由熟悉本领域的人员确定。所述剂量可以由医生根据受试者临床状况调节。所述剂量、剂量方案和施用路径可以变化。

按照此处所述方法施用特定剂量的的肽和组合物的效果可以通过评估病史、症状、体征的特定方面确定，及据知用于评估神经系统损伤或其它疾病和/或状况的受试者状态的客观实验室测试确定。这些症状、体征和客观实验室测试将根据治疗或预防的特定疾病或状况而变化，并且是治疗所述患者的任何医生或开展此领域实验的研究人员所熟悉的。例如，如果，根据与合适对照组比较和/或普通人群或特殊个体正常的疾病进程的了解：(1)受试者的身体状况表明得到改善(例如，肿瘤部分或完全消退)，(2)疾病或状况的进程表明得到稳定，或减慢或逆转，或(3)对治疗疾病或状况的其它药物的需求减少或消除，则认为某一治疗方案是有效的。

任何组合物可以用于治疗，并且可以包括或与药学上可接受的载体一起使用。此处所述的组合物可以方便地配制成药物组合物，由一种或多种组合物与药学上可接受的载体联合组成。参见，例如，《雷明顿药物科学》，最新版，e.w.martinmackpub.co.,easton,pa出版，该书公开了制备药物组合物的典型载体和传统方法，它们可以与此处所述的组合物制剂制备一起使用，通过引用，该书纳入本申请中。这些大多数是人类施用组合物的标准载体。一方面，人类和非人类，包括溶液，如无菌水、盐水和生理ph缓冲溶液。按照熟悉本领域的人员使用的标准程序，可以施用其它化合物。

除选择的分子外，此处所述的药物组合物可以包括但不限于，载体、增稠剂、稀释剂、缓冲溶液、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物还可以包括一种或多种活性成分，如抗微生物剂、抗炎药、麻醉剂等。在所述公开组合物的优选形式中，所述公开肽是所述组合物中唯一的活性成分。

所述公开组合物大多数用于全身递送，特别是静脉内施用。但是，所述公开组合物并不排除其它递送路径和方式。递送方式可以根据是否希望开展局部或全身治疗及治疗区域而变化。因此，例如，此处所述化合物或药物组合物可以作为滴眼液和/或眼睛表面油膏施用。此外，化合物或药物组合物可以经阴道、直肠、鼻内、口服、吸入或肠胃外施用给受试者，例如，通过皮内、皮下、肌肉内、腹膜内、直肠内、动脉内、淋巴管内、静脉内、鞘内和气管内路径施用。胃肠外施用(如果使用的话)，通常的特征是注射。注射液可以以传统形式制备，以液体溶液或悬浮液形式，以适合注射前配制为液体溶液或悬浮液的固体形式，或以乳液形式制备。另一种胃肠外施用的方法涉及使用缓释或持续释放系统，从而维持恒定的剂量。参见，例如，美国专利no.3,610,795，通过引用，该专利全文纳入本申请中。

在一些形式中，所述公开方法具有治疗效果。在一些形式中，所述治疗效果可以减少神经系统损伤的损害。在一些形式中，所述治疗效果可以在神经系统损伤后，增加神经系统功能的保留时间。在一些形式中，所述受试者可以具有一个或多个靶向位点，其中所述组合物归巢到一个或多个靶向位点。在一些形式中，所述受试者可以具有一个神经损伤部位，其中所述组合物对所述神经系统损伤部位具有治疗效果。

词语“高”、“更高”、“增加”或“提高”指的是例如，与对照相比，增加到基本水平以上。词语“低”、“更低”、“降低”或“下降”指的是例如，与对照相比，下降到基本水平以下。

词语“抑制”指的是活性或表达降低或减少。这可以是完全抑制或部分抑制活性或表达。抑制可以与对照相比或与标准水平相比。可以抑制1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64,65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。

此处所述词语“监测”指的是本领域可以测定活性的任何方法。

此处所述词语“提供”指的是本领域熟悉的向某种事物中加入化合物或分子的任何手段。提供的实例包括使用移液管、pipettemen、注射器、针、管道、枪等。可以是手动的或自动的。它可包括通过任何方式的转染或提供核酸至培养皿、细胞、组织、无细胞系统的任何其它方式，并可以是体外或体内的。

此处所述词语"预防"指的是疾病或病况的临床症状发作前施用一种化合物，以防止与疾病或病况有关的异常的身体表现。

此处所述词语“需要治疗”指的是由护理者(如人的情况下，医生、护士、从业护士或个人；动物(包括非人类哺乳动物)的情况下，兽医)作出的受试者需要治疗或将从治疗中受益的判断。这种判断根据各种因素作出，所述因素属于护理者的专业知识领域，但包括了解到受试者患有或将患有所述公开组合物可治疗的疾病，。

此处所述的“受试者”包括，但不限于动物、植物、细菌、病毒、寄生虫和任何其它生物体或实体。受试者可以是脊椎动物，更特别是哺乳动物(例如，人、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、非人类灵长类动物、牛、猫、豚鼠或啮齿动物)、鱼、鸟或爬行动物或两栖动物。受试者可以是无脊椎动物，更特别是节肢动物(如，昆虫和甲壳类动物)。该词语并不指明特定的年龄或性别。因此，成年和新生受试者，以及胎儿，无论是雄性或雌性，均涵盖在内。患者指罹患疾病或病症的受试者。词语“患者"”包括人和兽类受试者。

“治疗”指的是希望治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状态或病症的受试者的医疗管理。该词语包括积极的治疗，也就是说，特别针对疾病、病理状态或病症改善的治疗，并且还包括病因治疗，即针对消除相关疾病、病理状态或病症原因的治疗。此外，该词语包括姑息治疗，即设计用于缓解症状而不是治愈疾病、病理状态或病症的治疗；预防性治疗，即最大限度地降低或部分地或完全地抑制相关疾病、病理状态或病症发展的治疗；和支持治疗，即作为相关疾病、病理状态或病症改善的另一种特异性疗法的补充治疗。应该了解的是，治疗，虽然想要治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状态或病症，但不必在实际上治愈、改善、稳定或预防。治疗效果可如本文所述和如本领域熟悉的适合于所涉及疾病、病理状态或病症的方法衡量或评价。所述衡量和评价可以是定性的和/或定量的。因此，例如，疾病、病理状态或病症的特征或特点和/或疾病、病理状态或病症的症状可以减少到任何效果或任何数量。

细胞可以在体外。或者，细胞可以在体内，并可在受试者中发现。“细胞”可以是来自任何生物体(包括但不限于细菌)的细胞。

所述公开组合物、肽等的“有效量”指的是提供期望结果的化合物的无毒性但足够的用量。词语有效量通常用于指期望具有某种效果的化合物和组合物。如本申请别处所讨论的，所需的精确用量将因受试者不同而变化，取决于受试者的物种、年龄和一般状况、所治疗疾病的严重程度、采用的具体化合物、施用模式等。因此，不可能规定精确的“有效量”。然而，合适的有效量可由本领域普通技术人员仅使用常规实验确定。

“药学上可接受的”指的是不是生物学上或其它不希望的材料，即，材料可与经选择的化合物一起向受试者施用，而不会引起任何不希望的生物作用或以有害的方式与包含它的药用组合物的任何其它组分相互作用。

实例

实例1噬菌体展示分离脑损伤选择性肽

材料和方法

脑损伤模型所有动物实验都按照桑福德伯纳姆普利贝斯医学发现研究所实验动物保护和使用管理委员会批准的协议开展。将8至10周大的雄性bl6小鼠采用70％n2o和30％o2中的4％异氟烷(aerrane；baxter,uk)麻醉，并采用立体固定架固定。采用头部限制装置，并采用便携式钻和环锯，在右顶颞皮层上开展5-mm颅骨切开术，清除骨瓣。按照(kielianetal.,j.immunol.166:4634-4643(2001)；kielian,j.neuroinflammation1:16(2004))所述，使用穿透性脑损伤模型。采用21g针，按照宽度间隔1mm、高度间隔1mm的3x3网格开展3mm深9针穿刺。对于创伤性脑损伤，按照(krajewskaetal.,plosone6:e24341(2011))所述，采用控制性皮层撞击(cci)模型。采用标准立体定位撞击器(impactonetm；myneurolab.com)，致动器部件直接安装在立体定位仪器上，使小鼠接受cci。将撞击器(直径3mm)尖端加速向下达到1.0mm距离，达到预定速度3m/s，施加的电磁力在此处保留时间85ms，然后自动缩回。为了得到具有重现性的结果，采用接触传感器指示准确的接触点。在两个模型中，在整个程序中，采用面罩麻醉(70％/30％一氧化二氮/氧气中1-2％异氟烷)，然后，缝合头皮，中断麻醉，并给小鼠腹腔注射丁丙诺啡控制疼痛。损伤后的第1个2小时内，密切监测笼内小鼠的情况。

体内噬菌体展示脑损伤6小时后，给小鼠静脉注射1e10pfucx7c天然噬菌体库(溶于100μlpbs中)。将该库循环30分钟，然后采用2.5％阿佛丁将小鼠麻醉，并心脏内灌注pbs。提取大脑，并分离出损伤周围及对侧对应区域的组织。将这些组织在lb-np40(1％)中均化，并按照(teesaluetal.,methodsenzymol503:35-56(2012))所述处理噬菌体。简而言之，将回收的噬菌体在大肠杆菌blt5403中滴定和扩增，并提纯用于第二轮筛选的输入。采用桑格测序(美国圣地亚哥etonbiosciences公司)，对第二轮回收的菌落进行测序。或者，在第一轮后，通过大肠杆菌中扩增，援救裂解液中的噬菌体，并采用iontorrent高通量测序法，对噬菌体基因组的肽－编码部分进行测序。

肽合成和偶联所述肽采用微波－辅助自动肽合成器(liberty；北卡罗来纳州马修斯市cem公司)，按照fmoc/t-bu(fmoc：芴甲氧羰基,t-bu：叔-丁基)策略，在rinkamide树脂上，采用hbtu(n,n,n′,n′-四甲基-o-(1h-苯并三氮唑-1-基)脲六氟磷酸盐(或)o-(苯并三氮唑-1-基)-n,n,n′,n′-四甲基脲六氟磷酸盐)活化剂、三甲吡啶活化剂碱及5％哌嗪去保护而合成。在序列n-末端合成期间，加入荧光素和生物素标记。采用95％tfa三氟乙酸切割，然后提纯，得到纯度>90％的肽。将肽在-20℃冻干储存。

皮肤和肝损伤动物实验对于肝损伤模型，将动物进行麻醉，并首先切割皮肤，钝性分离肌肉，然后，采用无菌钳抬起腹膜，开展中线剖腹手术。在抬起的腹膜中开一个小孔，小心沿中线两个方向扩大该孔(不损害内部器官)。一旦很好地露出肝脏，夹紧动脉(robozsurgical(rs-5420))，并在其中一个肝叶表面上制造深2mm的切除伤口。从动脉取下夹子，让血液流动。缝合腹膜、肌肉和皮肤上的切口。然后，将小鼠放在其笼内的加热垫上，并密切监测，直到它们从麻醉中恢复。

对于皮肤伤口，开展麻醉，用酒精和必妥碘清洗皮肤，在小鼠背部皮肤上开展4个6或8mm皮肤活检。为了保证最佳无感染愈合，对任何皮肤伤口都不进行遮盖或缝合。为了测试肽归巢，在损伤6小时后静脉注射fam-标记肽(50nmol)，并循环30分钟。在小鼠心脏内灌注盐水，将器官分离，并采用免疫染色法分析。

大脑清晰成像按照(chungetal.,nature497:332-337(2013))所述，对新提取的大脑组织开展清晰成像。简而言之，在脑损伤6小时后，向小鼠静脉内注射fam-标记肽。循环30分钟后，在小鼠心脏内灌注pbs和水凝胶溶液(丙烯酰胺(4％)、bis(0.05％)、va-044引发剂(0.25％)、4％低聚甲醛pbs溶液)。灌注后，将所述组织在4℃水凝胶溶液中培养2-3天。在加利福尼亚大学圣迭戈分校神经科学光学显微镜重点实验室中，将该组织采用氮气脱气，并在37℃培养3-4小时用于聚合。然后，将样品在4％sds溶液中被动澄清大约4周，直到组织变得透明。最后，样品在pbs－t中清洗2天，并在梯度甘油溶液中培养：30、50和80％溶液，每种溶液大约培养1天，并在80％室温甘油溶液中储存，直到采用共聚焦显微镜(leicasp5)成像。

结果

为了分离与脑损伤特异性结合的肽，在成年雄性小鼠右半球施以单侧穿刺戳伤伤害(图1a)。这种穿透性脑损伤(pbi)导致bbb破坏，具体体现在小鼠igg选择性泄漏到损伤侧脑实质内。pbi还导致外皮组织缺损、轴索损伤及胼胝体内髓磷脂损失，同时伴随损伤半球内糖胺聚糖沉积增加。

pbi6小时后，静脉内注射t7噬菌体库，该库在噬菌体表面具有普通组成cx7c(seqidno:3)(c＝半胱氨酸；x＝任何氨基酸)的9-氨基酸环肽上展示(teesaluetal.,methodsenzymol503:35-56(2012))。注射30分钟后，从损伤部位和对应的对侧半球收获噬菌体。损伤半球的噬菌体回收比未受伤对侧半球高10-倍，表明损伤造成bbb破坏。回收噬菌体池的高通量测序分析表明，所述四-肽caqk(seqidno:4)插入的噬菌体出现显著的富集，占总回收噬菌体池(6.4x105pfu)的22％(1.28x105pfu)。除截短的caqk肽以外，还回收了以caqk基序开始的全长(9aa)环状插入，但频率更低。第二轮生物淘选将caqk分数提高到占总回收噬菌体池的83％。令人感兴趣的是，对侧有一些caqk噬菌体回收，表明对侧损伤引起了比较温和的损害(图1b)。注射噬菌体库的正常小鼠大脑未回收任何caqk。

为了验证caqk的选择性，化学合成了一种氨基荧光素(fam)-标记的caqk肽。当静脉注射合成的fam-caqk肽(seqidno:5)时，宏观检验，及肽上fam-标记免疫组化染色的结果表明，选择性归巢到损伤大脑(图1c)，这一结果与噬菌体筛选结果一致。与caqk长度和总电荷相同的fam-标记对照肽(cggk)(seqidno:7)产生的荧光信号最少。循环30分钟后，除肾脏外，健康大脑或其它主要组织中未观察到任何caqk积聚，肾脏是肽从循环中清除的常见路径(图1d)。

为了研究caqk是否靶向其它类型的脑损伤，在控制性皮层撞击损伤(cci)模型中测试肽归巢。没有穿透性损伤，这种模型模拟tbi的外皮组织缺失、轴索损伤、震荡和的bbb机能障碍(xiongetal.,naturereviewsneuroscience14:128-142(2013))。在此模型中，caqk归巢到大脑损伤区。caqk肽与脑损伤特异性结合，因为在肝和皮肤上制造的穿孔损伤内并未检测到任何肽积聚(图1d)。这些发现表明，caqk肽的结合表位对脑损伤部位具有特异性，至少在测试的模型中是这样。

在损伤后不到5天内，观察到caqk归巢到pbi(图1e)，表明存在一个用于有效的全身caqk-靶向的可能窗口。为了使整个大脑中肽的积聚更为直观化，对整个大脑进行处理，并采用clarity协议使其透明(chungatal.,nature497:332-337(2013))，对透明组织中的fam-caqk进行直观化。透明大脑中fam-caqk信号限于大脑的损伤象限，比fam-caqk对照的信号高。caqk在胼胝体的连合纤维区及皮层的环形细胞结构中积聚。caqk积聚导致在损伤脑内停留时间更长，因为在注射3小时后还可以看到肽的信号，而对照肽完全消失。

实例2caqk归巢对脑损伤具有特异性

材料和方法

银纳米颗粒合成和靶向。按照以前的报道，并进行了一些改进，制备带peg涂层的银纳米颗粒(agnp)(braunetal.,naturematerials13:904-911(2014))。在柠檬酸盐溶液中，通过硝酸银的鞣酸还原，合成直径～20nm的agnp(dadosh,materlett63:2236-2238(2009)。将agno3(252mg)溶于2.5l水中，并搅拌，加热到60℃，然后加入含鞣酸(6.1mg)和二水合柠檬酸三钠(6.1mg)的50ml水。3分钟后，使溶液沸腾20分钟。最终400nm的光密度是～10。硫辛酸peg胺(lpn,51.9mg,3400g/mol,nanocs公司)在84mm三-羧基乙基膦(tcepph7.0,sigma公司)的4.1ml水溶液中还原3h。将agnp分配500ml，并加热到50℃，然后加入lpn溶液(0.79ml)，紧接着加入0.25ml0.5mtcep。30分钟后，将溶液冷却到室温(rt)。加入tween20(t20,0.25ml,10％水溶液)和20ml2mnacl，并在4℃培养一个晚上。将agnp浓缩50-倍，并通过配备100kda膜的搅拌式超滤杯中(millipore公司)过滤到含0.005％t20和5mmtcep的0.5xpbs内，然后采用0.03mmn-乙酰基-l-半胱氨酸甲酯(sigma公司)，和0.10mm四半胱氨酸肽(乙酰基-ccpgcc-酰胺,lifetein公司)(seqidno:8)钝化，并以20krcf洗涤，并在含0.005％t20的0.05m磷酸盐缓冲溶液中以300o.d.重新悬浮。这种产品可以在4℃储存至少6个月。将双官能团接头与胺反应，引入马来酰亚胺基团(nhs-peg-mal,5kda美国jenkem公司)，离心分离洗涤，并与半胱氨酸肽(fam-x-caqk-nh2)(seqidnop:9)或对照含硫醇肽，或l-半胱氨酸(sigma公司)反应。将产品在含0.005％t20的pbs(pbst)中洗涤，过滤(0.22μm)，在400nmag等离子体峰处的典型最终光密度是150。根据braunetal.,naturematerials13:904-911(2014)(navarroetal.,theanalyst138:583-592(2013))，球形银的消光系数是5x10^9m-1cm-1，利用该系数，估算agnp浓度是～30nm。采用silverenhance(thermofischer)，对固定组织切片开展ag染色，并采用核固红(sigma)复染，并安装在dpx(sigma)中。采用imagej软件，分离出代表ag的灰色像素，对组织切片中银钠米颗粒信号进行定量。对于动物实验，在pbi6小时后，给小鼠静脉注射35nm肽-结合银纳米颗粒。让所述颗粒循环2小时，灌注小鼠，并分离大脑。采用核固红(sigma)复染，通过银染色金属自显影技术分析大脑中银的积聚。

归巢研究和组织切片损伤6小时后，将50nmol肽在pbs中溶解，通过静脉注射到动物体内，并让其循环30分钟。采用盐水心脏内灌注小鼠，分离器官，并采用illumatoolbrightlightsystemlt-9900(lightoolsresearch)成像。在oct包埋之前，将大脑和器官放在ph7.4的4％pfa中一个晚上，用pbs洗涤，并放在梯度蔗糖溶液中一个晚上。切成10μm厚切片，并通过免疫荧光法开展分析。为了开展全面的组织学分析，按照生产商的说明，将切片采用movatpentachromekit(五色套染)(americanmastertechinc.)染色。

组织切片银纳米颗粒覆膜按照上述免疫荧光学染色的相同协议，将纳米颗粒当作好象是第一抗体，并且不使用第二抗体，在冷冻大脑组织切片上开展覆膜实验，用于分析体外结合。在肽上涂布1nm浓度的银纳米颗粒pbs-t溶液，并在37℃培养1小时。通过查看肽上fam标记的本征发射，采用荧光显微镜对切片成像。

结果

为了进一步表征caqk与损伤大脑区的结合，在小鼠大脑切片上开展结合caqk的银纳米颗粒(caqk-np)的覆膜结合实验。caqk-np表现出与损伤大脑切片强烈结合，而对照np的结合(cggk-np)可以忽略不计。据观察，正常动物caqk-np和大脑切片的结合非常低，表明正常大脑中肽结合表位水平较低，受伤后则升高。在控制性皮层撞击模型中，也观察到类似的caqk-np结合模式。通过导致接近全面抑制的过量游离caqk，抑制caqk-np结合，证实了结合特异性。

实例3caqk肽与大脑ecm组分互相作用

材料和方法

亲和层析法和蛋白质组学为了鉴定caqk结合蛋白质，在损伤6小时后采集脑损伤的小鼠大脑。采用液氮，采用研钵及研杵，将大脑压碎和磨成粉。接下来，如(teesaluetal.,pnas16157-16162(2009))所述，将脑组织在含200mmn-辛基-β-d-吡喃葡萄糖苷和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(roche)的pbs中溶解。将澄清的裂解液装载到涂布sulfolink-琼脂糖微球(pierce,waltham,ma)的caqk或对照肽(cggk)上，并在4℃培养3-4小时。用洗涤缓冲溶液(溶于pbs中的75mm辛基-β-d-吡喃葡萄糖苷和蛋白酶抑制剂鸡尾酒)洗涤柱子，然后用含0.5mm的对照肽洗涤缓冲溶液洗涤，脱除非特异性结合的蛋白质。将结合的蛋白质采用2mm游离caqk肽洗脱。将洗脱组分汇合，采用二喹啉甲酸(bca)蛋白质分析法(thermofischer)测定其蛋白质浓度，采用过滤辅助样品制备(fasp)法(wisniewskietal.,natmethods6:359-362(2009))，对样品进行消解。最后，将消解样品进行脱盐、干燥，并在桑福德伯纳姆普利贝斯医学发现研究所蛋白质组学重点实验室开展lc-ms/ms分析。采用1.5.0.25版maxquant软件开展所有质谱分析。对照musmusculusuniprot蛋白质序列数据库(2014年7月版)，搜索ms/ms谱图。对于表1中的数据，通过对小鼠pbi大脑开展肽-亲和层析和质谱分析，鉴定了属于pnn复合物的蛋白质。采用maxquant软件，得到了lfq强度，并对三个技术性样本进行平均。强度在log2坐标上绘制。空柱表示未检测到蛋白质。

免疫荧光分析采用pbs-triton(0.2％)，使冷冻切片渗透，采用5％封闭缓冲溶液：含5％bsa、1％山羊血清、1％驴血清的pbs-t溶液开展封闭。将第一抗体在按1/100或1/200稀释的(1％)的4℃封闭缓冲溶液中培养1个晚上，采用pbs-t洗涤，并采用以1％稀释缓冲液按1/200或1/500稀释的第二抗体室温培养一个小时，然后采用pbs-t洗涤，并用含1μg/mldapi的pbs复染5分钟，采用pbs洗涤，并采用封片剂(vectorbiolabs)封片，采用共聚焦显微镜(zeisslsm-710)成像。采用下述抗体和试剂染色：荧光素(invitrogena889)、多功能蛋白聚糖(abcam,ab177480)、hapln4(r&dsystems,af4085)、肌腱蛋白r(r&dsystems,af3865)、wfa(sigma,l1516)、cspg(sigma,c8035)、ng2和olig2(giftfromdr.williamstallcupatsbpmdi)、gfap(dako,z0334)和mbp(millipore-mab386)。

噬菌体和ecm结合采用无酶细胞解离液(thermofisherscientific)清除96-孔板内以汇合单层生长的细胞，并在37℃采用200μl含0.5％牛血清白蛋白(bsa)的pbst封闭平板1小时。将噬菌体在4℃平板内培养1个晚上，采用200μlpbst洗涤三次，清除未结合的噬菌体。通过采用内部产生的抗-t7噬菌体抗体在4℃培养1小时，从而检测结合噬菌体。洗涤后，将辣根过氧化物酶(hrp)-标记的抗-兔igg(sigma-aldrich)采用pbs按1:1000稀释，向孔内加入100μl，然后在室温培养30分钟，并洗涤3次。接下来，向孔内加入100μlopd金银基质(sigma-aldrich)，并在室温培养，直到观察到可见颜色(<30min)。加入50μl1mh2so4终止反应，在495nm读板(flexstation3reader,美国加利福尼亚州森尼韦尔市moleculardevices公司)。为了开展酶消化，向板内加入软骨素酶abc(2u/ml,sigma)或透明质酸酶(500iu/ml)，在37℃消化3小时。然后，在采用噬菌体培养之前，采用pbst洗涤所述板3次。

结果

为了鉴定脑组织中caqk的潜在蛋白质靶，对固定肽开展亲和层析法，得到从损伤脑提取物分离的蛋白质，对这些蛋白质开展质谱蛋白质组学分析。表1列出了caqk和对照(cggk)柱洗脱液中蛋白质的对比情况。在鉴定的大量蛋白质中，caqk柱洗脱液中主要的肽主要属于硫酸软骨素蛋白多糖的凝集蛋白聚糖(cspgs(ruoslahti,glycobiology6:489-492(1996)))。这些包括多功能蛋白聚糖、相关蛋白质肌腱蛋白-r和透明质酸蛋白聚糖连接蛋白(hapln)。caqk柱洗脱液中多功能蛋白聚糖和hapln4独家存在。在正常大脑中，硫酸凝集素蛋白聚糖构成细胞外基质(ecm)复合物，称为神经元表面周围的神经元周围网络(pnn)(kwoketal.,int.j.biochem.cellbiol.44:582-586(2012))，这些凝集素蛋白聚糖在cns损伤部位上调(asheretal.,j.neuroscience22:2225-2236(2002)；lauetal.,nat.rev.neuroscience14:722-729(2013))。

表1caqk与脑ecm蛋白质结合

通过免疫染色，证实了脑损伤部位ecm-相关cspg表达增加。多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和透明质酸蛋白聚糖连接蛋白(hapln4)，都是脑ecm复合物的组分，损伤后上调，表现出损伤大脑中出现高表达，而在未损伤半球并未出现高表达(图2)。来自静脉注射caqk的信号和多功能蛋白聚糖、肌腱蛋白-r和hapln4共定位。所述肽信号还与pnn标志物-wfa(紫藤凝集素)共染色。在细胞水平，通过apc(腺瘤性结肠息肉病)标志物表达鉴定，fam-caqk在成熟的少突神经胶质细胞处明显积聚。在几种情况下，caqk结合方式遵照在胼胝体轴索方向对齐的伸长细胞。只有几个分离的olig-2和ng2-阳性细胞，大多数可能是少突胶质前体细胞与所述肽结合。在其它胶质细胞群内或周围，包括星形胶质细胞(gfap+)和小胶质细胞，并未检测出任何caqk。总之，这些数据表明，神经元周围网络(pnn)复合物中存在脑损伤中上调的caqk肽的结合分子(受体)。

为了进一步探索caqk与pnn复合物的结合，测试caqk噬菌体与u251人星形细胞瘤细胞产生的ecm的体外结合情况。这些细胞表达高水平的多功能蛋白聚糖和其它脑ecm成员(dours-zimmermannetal.,j.biol.chem.269:32992-32998(1994))，表明这些细胞在培养中被活化。结果表明，caqk噬菌体与u251ecm的结合比对照噬菌体明显高很多(图3a)。除进一步提供了caqk与ecm结合的证据外，此结果还表明了caqk识别人类靶点。这一点并不令人吃惊，因为肽的结合性质通常并不具有物种-特异性(ruoslahti,advancedmat.n/a-n/a(2012))。由于其被过量游离caqk肽抑制，因此，与这种ecm的结合具有特异性。此外，采用软骨素酶abc或透明质酸酶对ecm进行酶处理，导致多功能蛋白聚糖染色损失(图3d)，相应减少了caqk结合。这一结果表明，caqk的表位驻留在cspg、透明质酸和相关蛋白质形成的pnn复合物中(图3b、3c)。

实例4caqk作为脑损伤的诊断和治疗载体

材料和方法

多孔硅纳米颗粒(psinp)的合成和官能化。从virginiasemiconductor有限公司购买单晶硅高掺杂p-型硅晶圆(～1mωcm电阻,<100>抛光、硼-掺杂)。按照以前所述(qinetal.,part.part.syst.char.31:252-256(2014))。简而言之，所述硅晶圆在由hf:乙醇为3:1(体积比)的48％水溶液中开展阳极腐蚀。采用铂线圈对电极，在暴露抛光硅晶圆表面的teflon腐蚀池中开展腐蚀。硅晶圆与铝箔带的背面接触。腐蚀波形由方波组成，其中施加50ma/cm²较低电流密度1.8秒，紧接着施加较高电流密度400ma/cm²0.36秒。重复该波形140个循环，产生高低孔隙度交替层的多孔硅薄膜。在由hf:乙醇为1:30(体积比)的48％水溶液组成的电解质中，施加3.7ma/cm²电流密度250秒，从硅基材上清除得到的多孔纳米结构。然后，通过超声破碎，将这种独立的多孔硅薄膜破碎成所需的尺寸(公称150nm)，并将得到的纳米颗粒浸入到硼砂水溶液中进行氧化，从而活化光致荧光(jooetal.,adv.funct.mat.24:5688-5694(2014))。

psinp的表征采用jeol-1200exii，在120kv操作，得到透射电镜(tem)图。采用动态光散射(dls，zetasizerzs90,malverninstruments)测定所述纳米颗粒的水力尺寸和ζ电势。采用qepro分光计(oceanoptics)，得到光致发光和荧光光谱。采用分光计(nanodrop2000,thermofisherscientific)，测定260nm处的吸光度，并根据sirna的od260标准曲线，测定sirna的浓度。

肽结合和sigfp载入到psinp将一份psinp(2mg/ml乙醇溶液)与20μl3-(乙氧基二甲基)-丙胺硅烷通过涡流在室温混合一个晚上。采用乙醇洗涤所述胺终止的纳米颗粒，然后，进一步与1ml琥珀酰亚胺基羧基甲酯-聚乙二醇-马来酰亚胺(10mg/ml乙醇溶液)反应2小时，然后用乙醇和去离子水清洗(各清洗三次)。向得到的纳米颗粒中加入肽(500μl,1mg/ml，caqk或对照)的水溶液，并通过涡流混合2小时，通过肽末端基团的游离半胱氨酸残基与肽结合(caietal.,nat.prot.3:89-96(2008))。肽结合通常通过测定fam标记肽的荧光证实。纳米颗粒上肽的数量估计是～70nmol/mg(肽/psinp)。通过与sirna溶液(200μm)在4℃混合24小时，将寡核苷酸sigfp通过静电作用装载到纳米颗粒带正电的多孔内部结构上。sigfp的装载量是～7wt％(sigfp/psinp)，装载量通常通过测定260nm处的吸光度确定。值得注意的是，由于其分子量大及相对孔径(～12nm)而言较长的链长，因此，peg接头仅连接到psinp的外表面上(并非内部孔中)。3-(乙氧基二甲基)-丙胺硅烷和琥珀酰亚胺基羧基甲酯-聚乙二醇-马来酰亚胺(scm-peg-mal,mw5000)分别购自sigma-aldrich公司和laysanbio公司，并且未经进一步提纯直接使用。无核糖核酸酶的水购自thermofischer(carlsbad,ca)。针对绿色荧光蛋白(sigfp)的小干扰rna购自dharmacon。sigfp的正义链和反义链的序列为：5’-ggcuacguccaggagcgcaccdtdt-3’(正义)(seqidno:1)和5’-ugcgcuccuggacguagccttdtdt-3’(反义)(seqidno:2)。

体内sirna靶向和分析转基因cag-gfp小鼠购自jacksonlaboratory(物料编号#006567)。按照上文所述制作脑损伤。在损伤后6小时和24小时通过尾静脉注射，两次施用肽-结合、载sirna的psinp(300μg)(n＝3)。损伤三天后，灌注小鼠，收获器官，并固定用于下游分析。将组织在时间-门控成像设置下成像，并由对实验分组不知情的研究人员分析gfp表达。

硅纳米颗粒的门控发光成像(glisin)如(jooetal.,acsnano9:6233-6241(2015))报道，门控发光图像采用强化ccd相机(istar334t,andortechnologyltd.)，采用定制时间域成像系统得到。采用由三倍频nd:yag-泵送光参量振荡器组成的可调激光器(opolette355,opotekinc.)作为激励源，重复率10hz，与ccd同步且由ccd启动。andorsolis软件用于控制时间延迟和采集条件，并分析信噪比(snr)。将小鼠组织放在黑色聚苯乙烯板上，拍摄亮场(环境光下)和门控发光(脉冲激光器激发，λex＝410nm)图像。

人类组织实验福尔马林固定人脑组织从美国马里兰州贝塞斯达市的健康科学统一服务大学(usu)的神经科学&再生医学中心(cnrm)维持的脑组织库获得。tbi情况是72岁因中度tbi(车祸)死亡的一名患者。对照情况是根据详细的神经病理学评估，没有任何神经诊断或任何tbi症状的63岁男性。将固定组织冷冻保存，并切片，用于如上文所述与agnp覆膜结合。为了免疫组织化学分析，在采用抗-hapln4和抗-多功能蛋白聚糖抗体培养之前，先完成一个抗原修复步骤。

统计分析。所有数据以平均值±sem表示。所有显著性分析都采用statistica8.0软件，采用单因素方差分析或双尾异方差学生t-检验进行。统计检验的详细情况在各图注说明中表明。

结果

与caqk肽连接的fam标记积聚表明，caqk能够将低分子量化合物递送到脑损伤部位。为了进一步研究caqk靶向方法的翻译潜力，首先考察caqk-介导递送纳米颗粒(np)至脑损伤作为成像剂和药物载体的模型。静脉施用caqk-结合的银np(平均直径–20nm)，结果表明，其在脑损伤组织内的积聚明显大于对照np(图4a)。caqk-np的定位与游离caqk肽的定位非常一致。因此，caqk靶向np模拟了游离肽的归巢能力。

为了证明caqk系统的多功能性，测试了将装载到多孔硅np内的寡核苷酸作为载体进行递送的情况(parketal.,nat.mater.331-336(2009))。这种概念方法的证据是cag启动子转基因小鼠中系统表达的绿色荧光蛋白局部表达沉默(okabeetal.,febslett407:313-319(1997))。采用针对caqk结合多孔硅纳米颗粒(caqk-psinp)中装载的gfp的sirna，模拟治疗寡核苷酸(图4b-4d)。将psinp静脉注射到存在pbi的gfp小鼠内，并通过时间-门控发光成像直观化(jooetal.,acsnano9:6233-6241(2015)；guetal.,nat.commun.4:2326(2013))，允许对离体大脑内的积聚情况进行定量。成像结果表明，损伤中积聚的caqk-psinp显著高于(35倍)涂布对照肽的psinp。其它组织，包括损伤区外的大脑区域，其caqk的积聚情况与对照psinp并不存在显著区别(图5b)。注射caqk-psinp-sigfp的小鼠的横向皮层切片的共聚焦显微镜图像表明，损伤部位较多地缺少gfp表达，而对照np处理的小鼠大脑与未处理的大脑并没有不同。通过靶向sigfp，观察到gfp表达70％沉默，而未靶向sigfp和其它对照观察的沉默非常低。由于损伤中随着时间变化，psinp逐渐降解，释放出sigfp，因此，这种沉默在整个损伤处都可以看到，而不是仅在特定的细胞类型中可以看到。基因沉默对脑损伤具有特异性，因为正常大脑或其它主要组织中gfp表达保持不变。

最后，为了考察caqk对人类脑损伤的识别，对从头部创伤患者得到的人类皮层切片开展caqk-结合银np的体外结合试验。caqk-np表现出与来自皮层和胼胝体区的损伤脑切片强烈结合，而与正常脑切片的结合非常少(图6a和6b)。通过免疫组织化学法分析，结果表明，与小鼠大脑类似，与正常大脑相比，观察到人类损伤大脑中多功能蛋白聚糖和hapln4表达显著升高(图6c-6e)。这些发现证明了caqk与人类靶点结合，并支持其用于人类治疗应用的潜在用途。

讨论

此项研究中采用了两个小鼠模型。穿透性脑损伤模型模拟枪伤或弹片伤，如军人的伤口。钝性皮层撞击模型更常用于重现严重tbi的特征。caqk识别这两种模型中的损伤，表明其在急性脑损伤的广泛用途。与正常大脑不同，对侧半球积聚了一些caqk噬菌体，这一事实表明，没有此处严重的损伤亦可以采用caqk靶向。从它们表达caqk靶这方面来说，caqk还可以归巢到脊髓损伤和cns脱髓鞘病(如多发性硬化症)。已经证明，caqk识别其人类培养细胞和受伤的人类大脑皮层切片中的靶。

此研究中噬菌体筛选表明了体内筛选的一个新方面：而以前的筛选已经探测了靶组织的脉管系统，甚至大脑内(chenetal.,nat.med.15:1215-1218(2009)；pasqualinietal.,nature380:364-366(1996)；fanetal.,pharm.res.24:868-879(2007))，脑损伤中受损害的bbb完整性允许噬菌体探测血管外脑组织的情况。其次，噬菌体基因组中肽-编码插入的高通量测序改进了筛选技术。与以前重复多轮筛选相反的是，一轮选择提供了200,000多个肽序列的指纹，显示出令人吃惊的caqk肽序列展示噬菌体的富集。虽然采用环状噬菌体库，但是，这种设计的库包含少量线性肽，因为终止密码子发生在随机插入内，导致环状肽截短。此外，突变可能改变肽的结构。因此，噬菌体筛选中通常遇到不符合文库通用结构的肽(hoffmanetal.,cancercell4:383-391(2003)；simbergetal.,pnas104:932-936(2007))。除主要的线性caqk肽之外，含caqk基序的环状肽的回收表明，caqk基序亦在环状肽中活跃。

bbb破坏是tbi之后二次伤害的重要贡献者，为了神经保护，恢复bbb功能的治疗正在研究之中(pillaietal.,j.cerebralflowandmetabol.29:1846-1855(2009))。bbb的定位渗透性和二次伤害的延迟开始，为治疗干预提供了一个机会窗口。文献(cunninghametal.,j.neurotrauma31:505-514(2014))和此处结果表明，bbb不良影响的持续时间至少达5天。在此时间窗口，基于亲和配体的(突触)靶向可以是一种有效的药物递送方法；结果表明在损伤部位处和损伤部位周围全身施用的成像剂和治疗剂的积聚提高35-倍。

突触靶向的浓缩效果可能是由两个因素造成的：肽能够接近和结合其靶，允许有效负载积聚，导致在损伤部位停留。bbb的损害允许将物质全循环进入损伤区。而且，如果肽受体数量相对采用的肽-药物结合物足够丰富，则肽与受体的结合可以推动有效负载积聚而超出被动泄漏导致的积聚(hussainetal.,scien.rep.4:5232(2014))。这是脑损伤的情况，其中cspg复合物的组分在损伤时过表达(kwoketal.,int.j.biochem.cellbiol.44:582-586(2012))(figure2)。第二个重要的因素是滞留效应。随着循环中药物浓度下降，药物被从损伤区清除(stewartetal.,j.neurosci.meth.41:75-84(1992))。肽与其靶结合可以通过最大限度地减少这种清除，而将药物保留在损伤微环境内。因此，此工作的靶向方法包括愈合的临界期，可以提供更持久的治疗效果，至少在治疗作用是长时间作用时是如此。值得指出的是，已经表明，有些寡核苷酸—此工作中成功递送的药物类型之一，在组织内几周都保持活性(bartlettetal.,nuc.acidsres.34:322-333(2006))。

cns损伤导致形成富-cspg胶质瘢痕，它是再生的主要障碍(silveretal.,nat.rev.neurosci.5:146-156(2004))。有人探索了阻止损伤中cspg积聚或溶解已有沉积的策略(lauetal.,nat.rev.neurosci.14:722-729(2013))。但是，位点定向递送活性化合物是一种挑战。caqk肽对损伤大脑内富cspg区域的固有亲和性在导向cspg-减少有效负载方面非常有效，如软骨素酶abc酶(hilletal.,pnas109:9155-9160(2012))。已经将纳米颗粒有效负载成功靶向到大脑损伤处表明，采用蛋白质(如软骨素酶)同样可以完成靶向。本方法在大脑损伤部位浓缩有效负载的能力可用于降低靶外位点的毒性。将从毒性降低中受益的一种现有治疗剂的实例是神经-保护剂脑源性神经营养因子(bdnf)(nagaharaetal.,nat.rev.drugdisc.10:209-219(2011))。它在caqk不靶向的正常大脑中具有不良影响。因此，此处公开的靶向方法可能将具有不利药代动力学特征的试剂转化成有效的药物。

基于寡核苷酸的药物是新一类具有非常大的潜力，但因体内递送问题而受到阻碍的药物。一个实例是sirna，这是一种具有期望特异性和效力特点的治疗方法，但是，很难通过全身循环递送。以前有关脑损伤sirna治疗的研究要么直接注射到cns空间内或沉默大脑内皮细胞中存在的靶点(fukudaetal.,genes4:435-456(2013))。此处报道的caqk－介导的靶向递送sirna提供了将活性sirna从全身循环递送到损伤脑组织内的第一个证据。许多基因沉默靶(如bcl-2家族蛋白质、半胱天冬酶、hdac和pten)已经被建议用于脑损伤(fukudaetal.,genes4:435-456(2013))。在此处，caqk-介导的sirna递送通过采用多孔纳米颗粒作为载体完成。因此，这些结果还开创了采用基于纳米药物的治疗方法治疗脑损伤的先例。

caqk的发现在治疗上有用，因为它能够将有效负载从全身循环导向到急性脑损伤部位，并将其在那里保留治疗相关时间。这种方法提供了局部递送的替代方法，局部递送是侵入式的，会增加损伤的并发症。此外，这种方法适用于人类患者，因为caqk识别人类靶分子，而且在受伤的人类脑组织中，靶的表达升高方式与小鼠损伤中相同。

实例5caqk对脑损伤具有生物影响

结果

对caqk肽在脑损伤中的潜在治疗效果进行了测试。对制作了脑损伤的小鼠静脉注射caqk肽或盐水治疗。小鼠在损伤7天后处死，并通过目视和组织学方法对皮层损伤量进行评估。在3天(损伤后6、24、48、72小时)施用caqk治疗，导致损伤处组织损失量显著减少，正如从冠状脑切片目视和组织学检查中看到的那样。通过对所有小鼠整个大脑损伤区定量，测定损伤体积，结果表明，caqk治疗组的损伤显著减少(图7)。还采用对退化神经元染色的fluorojade染料对大脑切片染色。与对照小组相比，caqk处理的小鼠表现出神经元退化明显减少。这些数据表明，caqk具有固有的生物活性，降低了小鼠脑损伤后的损害。

应该了解的是，所述公开的方法和组合物并不限于描述的具体的方法、协议和试剂，因为这些可能发生变化。还应该理解的是，此处所用的术语仅用于描述具体的实施例，而不是用于限制本公开的范围，本发明的范围仅受所附的权利要求书限制。

必须指出的是，除非上下文明确指明，否则，正如本专利说明书和权利要求书中所使用的那样，单数形式“一种”、“一个”和“这个(该)”包括复数意义。因此，例如，提到“肽”时包括多个所述肽，提到“所述肽”指的是本领域技术人员熟悉的一种或多种肽及其相当物等。

在本说明书的整个发明内容和权利要求书中，词语“包含”及该词语的变化，如“含有”和“包括”指的是“包括但不限于”，并且并不排除例如其它添加剂、组分、整数或步骤。

“任选的”或“任选地”指的是随后描述的事件、环境或材料可以发生或不发生或可以存在或不存在，所述描述中包括其中事件、环境或材料发生或存在的情况及其中事件、环境或材料不发生或不存在的情况。

范围在此处可表示为从“大约”一个特定值，和/或至“大约”另一个特定值。当表达这样一个范围时，也特别地预期和考虑公开了从一个具体值和/或至另一个具体值的范围，除非文中另外具体地指明。类似地，当值通过在前面使用“大约”而表示为近似值时，应该理解的是，特定值形成另一个特别构思的、应考虑为公开的实施例，除非文中另外具体地指明。还应理解的是，各个范围的端点相对于另一端点和独立于另一端点都是有意义的，除非文中另外具体地指明。还应理解的是，明确公开的范围内包含的所有的单个值和值的子范围也特别地预期并应认为是公开的，除非文中另外具体地指明。最后，应该理解的是，所有范围指的是引用的范围作为范围及作为单个数值的集合，包括第一端点至包括第二端点。在后一种情况中，应该理解的是，任何单个数字可选择作为范围所指数量、数值或特征的一种形式。因此，一个范围描述了一组数字或数值，从第一端点和包括第一端点至第二端点和包括第二端点，从其中，可以选择组中单个成员(即单个数字)作为所述范围所指数量、数值或特征。不论在具体的情况下某些或所有这些实施例是否已明确地公开，前述均适用。

除非特别规定，本发明使用的所有技术名词和科学术语都具有与本公开的方法和组合物所属领域技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于实施或测试本发明的方法和组合物，但是描述了特别有用的方法、装置和材料。本文引用的出版物和因其而引用它们的材料通过引用而特别地结合到本发明中。本文所有内容均不应视为承认本发明无权通过在先发明而先于这样的公开。不承认任何参考文献构成现有技术。对参考文献的讨论陈述它们的作者声称的内容，申请人保留挑战所引用文件的准确性和切合性的权利。应该清楚地理解的是，虽然许多出版物在本文被提及，但这样的参考文献并不构成承认任何这些文件形成本领域的普通常识的一部分。

虽然材料、组合物、组分、步骤、技术等的描述可包括许多选项和替代，但这不应视为和不承认这样的选项和替代彼此是等同的或者尤其是明显的替代。因此，例如，不同肽的列表并不表明所列的肽彼此是明显的，也不是承认是等同的或显而易见的。

本领域的技术人员将认识到，或能够使用仅仅常规的实验确定，本文所述的方法和组合物的特定实施例的许多等同物。所述等同物被所附的权利要求书涵盖。