一种用于治疗银屑病的混合干细胞制剂及其制备方法与流程

本发明涉及一种具有免疫调节功能的干细胞药物，具体涉及一种用于治疗银屑病的混合干细胞制剂及其制备方法。

背景技术：

银屑病俗称牛皮癣，是一种慢性炎症性皮肤病，一种以th1、th17淋巴细胞异常活化和浸润为主要特征的慢性炎性反应皮肤病，其病理改变主要为皮肤出现增厚、鳞屑、红斑的症状，角质细胞的过度增生，新生血管的生成，炎症细胞的浸润，il23/il17炎性轴的炎性因子升高。银屑病的确切发病原因还不清楚，环境因子(诸如感染、外伤、压力等)和遗传因子等综合因素决定了个体的易感性。银屑病目前尚无根治的药物，常用的银屑病治疗药物例如类固醇免疫抑制剂和炎症因子拮抗剂，只能在一定程度上缓解病情，且有些疗法的毒副作用大，长期治疗会产生耐受引起复发。银屑病的初发年龄以15至45岁居多，患者发病率男性高于女性，城市高于农村，症状表现冬重夏缓，我国的发病人数估计400万-600万，因此研发一种能从根本上缓解银屑病症状的药物势在必行。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于治疗银屑病的混合干细胞制剂，它可以解决现有技术中药物无法从根本上缓解银屑病症状的问题，为此，本发明还要提供一种用于治疗银屑病的混合干细胞制剂的制备方法。

为了解决上述问题，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种用于治疗银屑病的混合干细胞制剂，包括间充质干细胞、造血干细胞、人血白蛋白和生理盐水。

进一步地，所述间充质干细胞是脂肪间充质干细胞，所述造血干细胞为胎盘造血干细胞。

更进一步地，所述脂肪间充质干细胞的密度为4至8乘10⁶个/毫升，所述胎盘造血干细胞的密度为0.5至8乘10⁶个/毫升，人血白蛋白的质量分数为10至20％。

间充质干细胞(msc)是一种具有自我复制和多向分化潜能的多能性细胞，msc最初多从骨髓中取得，骨髓间充质干细胞具有抑制免疫应答和诱导外周免疫耐受的特质，曾被应用于抑制骨髓移植时所导致的移植物抗宿主反应。随后，在脂肪、脐带、牙髓和胎盘等多种组织中均发现间充质干细胞。msc具有免疫豁免的特性，不表达主要组织相容性复合体ⅱ类分子，不表达或极低水平表达mhⅰ类分子及b7-1(cd80)、b7-2(cd86)和cd40、cd40l等共刺激分子，这些共刺激分子的缺失使得效应性t淋巴细胞活化的第二信号丧失，t淋巴细胞无法被激活，因而msc逃避了同种异体反应的t淋巴细胞的攻击，因此msc移植可以避免免疫排斥。msc可以通过细胞间的直接接触和分泌pge2、ido、tgf-β等细胞因子，作用于免疫细胞，如：下调淋巴细胞中th1、th17的比例，上调treg的比例；抑制b细胞增殖和其表面趋化因子受体的表达；抑制主要抗原呈递细胞树突状细胞(dc)的成熟和分泌炎症因子的能力；抑制自然杀伤细胞(nk)的增殖、细胞毒性和炎症因子分泌的能力；抑制m1型巨噬细胞活性，促进m2型巨噬细胞的极化；抑制单个核和中性粒细胞活性等。

治愈银屑病，不仅要修复皮肤破损，还要缓解银屑病患病部位的炎性因子浸润和免疫环境异常，脂肪组织来源的间充质干细胞具有来源广泛、免疫原性低和扩增能力强等特点，能调节和平衡免疫系统，促进造血功能，和修复人体组织器官。

胎盘中含有大量的造血干细胞和免疫前体细胞，移植胎盘造血干细胞可以促进造血和重塑免疫系统；在临床上移植胎盘造血干细胞可以治疗恶性肿瘤、血红蛋白与血液异常病、先天性代谢性疾病、先天性免疫缺陷疾病和自身免疫性疾患等。

本发明的第二方面，提供一种混合干细胞制剂的制备方法，用于制备上述的混合干细胞制剂，包括以下步骤：

步骤一、制备间充质干细胞；

步骤二、制备造血干细胞；

步骤三、将间充质干细胞、造血干细胞、人血白蛋白按照比例于生理盐水中进行混合。

进一步地，所述步骤一中间充质干细胞为脂肪间充质干细胞，其制备方法如下：

a.用消化酶溶液消化脂肪组织，分离消化后的细胞产物；

b.用淋巴细胞分离液进一步纯化细胞；

c.用无血清干细胞培养基培纯化后的细胞，把细胞放入37摄氏度、含有体积分数为5％的二氧化碳细胞培养箱中培养；

d.当干细胞的融合度为70至80％时，按照1:3的比例进行细胞传代；

e.收集第三代到第六代之间的脂肪间充质干细胞。

进一步地，所述步骤二中造血干细胞为胎盘造血干细胞，其制备方法如下：

a.用生理盐水清洗胎盘，用剪刀剪碎胎盘小叶，用生理盐水充分冲洗胎盘小叶，收集冲洗液；

b.用细胞过滤网过滤冲洗液，并收集细胞，用生理盐水重悬细胞，将细胞与6％的羟乙基淀粉按照4：1的比例混匀，4摄氏度下静置1小时，去上清液，即得到胎盘造血干细胞。

本发明的混合干细胞制剂以涂抹或浅表皮注射的方式作用于银屑病发病部位，通过促皮肤组织新生和调节炎性环境对银屑病进行治疗，中间充质干细胞和造血干细胞发挥不同的治病机制，安全、高效、副作用小，而且取材和生产过程简单，具有实现医疗转化的潜力。

附图说明

图1是体外淋巴细胞共培养实验中脂肪干细胞和混合干细胞分别对淋巴细胞的调控能力表征图。

具体实施方式

实施例1

一种用于治疗银屑病的混合干细胞制剂，包括间充质干细胞、造血干细胞、人血白蛋白和生理盐水。间充质干细胞是脂肪间充质干细胞，密度为4乘10⁶个/毫升；造血干细胞为胎盘造血干细胞，密度为2乘10⁶个/毫升；人血白蛋白的质量分数为15％。

其制备方法如下：

步骤一、制备脂肪间充质干细胞

a.将脂肪组织转移到250毫升离心管中，然后加入等体积的生理盐水；用力摇晃离心管数次后静置，脂肪组织浮在生理盐水上面，吸走生理盐水，再重新加入新鲜的生理盐水，用同样的操作重复洗脂肪几次直到脂肪里面的血液被洗掉。

b.用含有0.15％的胶原酶ⅰ、0.15％的胶原酶ⅱ、1/2×accutase/消化酶的dmem培养基消化脂肪组织，让脂肪组织在37摄氏度、100转每分钟的恒温摇床中消化15分钟，消化结束后，加入等体积的含有10％fbs的培养基中和消化酶，然后以400g的转速离心10分钟，收集细胞沉淀。

c.用生理盐水重悬细胞沉淀，让细胞先后通过直径为100微米和40微米的过滤网，收集单个细胞。在洁净的50毫升的离心管中加入20毫升的淋巴细胞分离液ficoll，再把细胞悬液缓慢的加入到淋巴细胞分离液上面，关掉离心机的减速阀，用400g的转速离心30分钟，收集上层液体层和分离液之间的白色细胞层，用2倍体积的生理盐水重悬细胞，以300g的转速离心10分钟，丢掉上清。

d.用生理盐水再次清洗细胞，离心后丢掉上清液，用新鲜的培养基重悬细胞，把细胞放入培养瓶培养。脂肪间充质干细胞培养基选自于加拿大stemcelltechnologies公司的mesencult^tm-acfplus培养基，培养瓶预先用促贴壁因子包被过。培养24小时后，换液，用生理盐水洗去没有贴壁的细胞。

e.在随后的培养过程中根据细胞的实际生长情况换液或者传代。当细胞的融合度达到70至80％时，用trypletm消化细胞传代，细胞的传代比例是1:3，收集第三代到第六代的脂肪间充质干细胞。

步骤二、制备胎盘造血干细胞

a.将胎盘浸泡在生理盐水中，用无菌的剪刀剪碎胎盘小叶，用生理盐水充分冲洗胎盘小叶，收集冲洗液。

b.分别用直径为100微米和40微米的细胞过滤网过滤冲洗液，然后转移到细胞离心管中，用400g的转速离心10分钟，倒掉上清，用生理盐水重悬细胞，然后将细胞与6％的羟乙基淀粉按照4：1的比例混匀，4摄氏度下静置1小时，取上清；用400g的转速离心10分钟；倒掉上清，用生理盐水再次清洗，得到胎盘造血干细胞。

步骤三、收集培养后的脂肪间充质干细胞，和纯化后的胎盘造血干细胞，将两者干细胞以一定的比例混合。脂肪间充质干细胞在制剂中的密度是4×10⁶个/毫升，胎盘造血干细胞的密度是2×10⁶个/毫升，人血白蛋白的浓度是15％。

实施例2

一种用于治疗银屑病的混合干细胞制剂，包括间充质干细胞、造血干细胞、人血白蛋白和生理盐水。间充质干细胞是脂肪间充质干细胞，密度为4至8乘10⁶个/毫升；造血干细胞为胎盘造血干细胞，密度为0.5至8乘10⁶个/毫升；人血白蛋白的质量分数为15％。

本实施例的混合干细胞制剂的制备过程与实施例1相同。

实施例3

一种用于治疗银屑病的混合干细胞制剂，包括间充质干细胞、造血干细胞、人血白蛋白和生理盐水。间充质干细胞是脂肪间充质干细胞，密度为8乘10⁶个/毫升；造血干细胞为胎盘造血干细胞，密度为8乘10⁶个/毫升；人血白蛋白的质量分数为20％。

本实施例的混合干细胞制剂的制备过程与实施例1相同。

实施例4

一种用于治疗银屑病的混合干细胞制剂，包括间充质干细胞、造血干细胞、人血白蛋白和生理盐水。间充质干细胞是脂肪间充质干细胞，密度为4乘10⁶个/毫升；造血干细胞为胎盘造血干细胞，密度为5乘10⁶个/毫升；人血白蛋白的质量分数为10％。

本实施例的混合干细胞制剂的制备过程与实施例1相同。

实施例5

一种用于治疗银屑病的混合干细胞制剂，包括间充质干细胞、造血干细胞、人血白蛋白和生理盐水。间充质干细胞是脂肪间充质干细胞，密度为6乘10⁶个/毫升；造血干细胞为胎盘造血干细胞，密度为4乘10⁶个/毫升；人血白蛋白的质量分数为15％。

本实施例的混合干细胞制剂的制备过程与实施例1相同。

体外验证实验

为了检验本专利中的混合干细胞制剂的免疫调节功能，通过体外淋巴细胞共培养实验，我们比较了单纯的脂肪间充质干细胞和实施例1混合干细胞制剂调节免疫细胞的能力。从图1可以看出，相比单纯的脂肪间充质干细胞，混合干细胞制剂具有更强的抑制th1细胞和th17细胞的能力，以及更强的促进treg细胞能力。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。