特女贞苷作为细胞自噬诱导剂的应用的制作方法

本发明实施例涉及医药技术领域，具体涉及一种细胞自噬诱导剂及应用。

背景技术：

自噬是指细胞内的长寿命蛋白质以及受损的细胞器经溶酶体途径被降解的过程，是真核细胞所特有的现象。高温、缺氧、饥饿等应激时产生自噬能帮助细胞抵御这些不利因素，发挥细胞保护作用。但是，自噬过度激活或不适时则会导致细胞死亡，即自噬性细胞死亡(autophagiccelldeath)。已有研究表明自噬的失调与肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病以及感染等疾病密切相关。

在发生应激时，细胞自噬能够防止有毒或致癌的损伤蛋白质和细胞器的累积，抑制细胞癌变；然而肿瘤一旦形成，细胞自噬为癌细胞提供更丰富的营养，促进肿瘤生长。尽管自噬在绝大多数肿瘤中低表达，提示自噬可能起到抑制肿瘤生长的作用。但研究表明上调自噬同样使得肿瘤细胞的侵袭性和化疗药物抵抗性增强。自噬在化疗或者放疗的情况下能够帮助肿瘤细胞在凋亡缺陷的情况下渡过代谢压力的难关。代谢压力不仅存在于放化疗的肿瘤细胞中，在肿瘤细胞血供不足，或者远处转移到缺乏营养的器官中也同样能见到。因此，自噬诱导在肿瘤形成早期具有重要意义。

在抗菌研究中，自噬是天然免疫应答和特异性免疫应答的重要环节。自噬在抗细菌毒素、增强mhcii类分子的抗原提成能力、清除病原菌方面发挥了重要作用。

目前，常用的自噬诱导剂主要有雷帕霉素、bredeldina、carbamazepine、xestosponginb/c、n-acetyl-d-sphingosine。现有的自噬诱导剂可供选择的种类较少，多为合成的化合物分子，有待开发出新的自噬诱导剂。

技术实现要素：

为此，本发明实施例提供特女贞苷在制备细胞自噬诱导剂或药物组合物中的应用。

为了实现上述目的，本发明的实施方式提供如下技术方案：

特女贞苷在制备细胞自噬诱导剂或药物组合物中的应用。

优选的，所述特女贞苷在诱导腺癌人类肺泡基底上皮细胞a549自噬中的应用。

优选的，所述诱导剂为口服剂型或注射剂型。

优选的，所述药物组合物还包括杀菌或者治疗肿瘤的有效成分。

优选的，所述治疗肿瘤的有效成分包括顺铂或者紫杉醇。

优选的，所述药物组合物治疗的病症包括与细胞自噬相关的细菌感染及肿瘤。

优选的，所述的肿瘤为白血病、肺癌、结肠癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、乳腺癌、胰腺癌、子宫颈癌、胃癌、肝癌、肉瘤或黑色素瘤。

所述的细菌感染包括mrsa、staphylococcusaureus等葡萄球菌，或肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等革兰氏阳性菌。

在荧光显微镜下采用gfp-mcherry-lc3融合蛋白来示踪自噬形成。无细胞自噬时，gfp-lc3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬体形成时，gfp-lc3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

本发明实施例中的特女贞苷，是木犀科女贞ligustrumlucidum的叶及女贞子(女贞的果实)提取物，分子式c31h42o17。其结构式如图1所示。

本发明实施例中，自噬是指细胞内的长寿命蛋白质以及受损的细胞器经溶酶体途径被降解的过程，是真核细胞所特有的现象。高温、缺氧、饥饿等应激时产生自噬能帮助细胞抵御这些不利因素，发挥细胞保护作用。但是，自噬过度激活或不适时，则会导致细胞死亡，即自噬性细胞死亡(autophagiccelldeath)。已有研究表明自噬的失调与肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病以及感染等疾病密切相关。

根据本发明实施例具有如下优点：

本发明实施例的特女贞苷的自噬诱导效果的发现，特女贞苷为天然化合物分子，使其有待开发成一种新的自噬诱导剂，应用到疾病的治疗或辅助治疗中，例如细菌感染疾病的辅助治疗，肿瘤的辅助治疗中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明实施例的特女贞苷分子结构示意图；

图2为本发明的实施例的特女贞苷0.34ug/ml处理组的confocalmicroscopy检测荧光的示意图，其中，图2a为dapi染色图，图2bgfp荧光图，图2c为mcherry荧光图，图2d为gfp与mcherry融合后的荧光图；

图3为本发明实施例的特女贞苷1.1ug/ml处理组的confocalmicroscopy检测荧光的示意图，其中，图3a为dapi染色图，图3b为gfp荧光图，图3c为mcherry荧光图，图3d为gfp与mcherry融合后的荧光图；

图4为本发明实施例的特女贞苷3.4ug/ml处理组的confocalmicroscopy检测荧光的示意图，其中，图4a为dapi染色图，图4b为gfp荧光图，图4c为mcherry荧光图，图4d为gfp与mcherry融合后的荧光图；

图5为本发明实施例的mrsa处理组的confocalmicroscopy检测荧光的示意图，其中，图5a为dapi染色图，图5b为gfp荧光图，图5c为mcherry荧光图，图5d为gfp与mcherry融合后的荧光图；

图6为本发明实施例的阳性对照组雷帕霉素的confocalmicroscopy检测荧光的示意图，其中，图6a为dapi染色图，图6b为gfp荧光图，图6c为mcherry荧光图，图6d为gfp与mcherry融合后的荧光图；

图7为本发明实施例的阴性对照组氯喹的confocalmicroscopy检测荧光的示意图，其中，图7a为dapi染色图，图7b为gfp荧光图，图7c为mcherry荧光图，图7d为gfp与mcherry融合后的荧光图；

图8为本发明实施例的正常组的confocalmicroscopy检测荧光的示意图，其中，图8a为dapi染色图，图8b为gfp荧光图，图8c为mcherry荧光图，图8d为gfp与mcherry融合后的荧光图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中，利用小分子化合物特女贞苷作为小分子的自噬诱导剂。

本发明实施例中，自噬过程进行观察和检测，细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测。

本发明实施例中，具有自噬诱导作用的单体化合物特女贞苷，其具有明显的自噬诱导作用，而且来源广泛，扩充了诱导自噬工具药的种类，有待开发出新的自噬诱导剂治疗疾病。

本发明实施例中，moi：multiplicityofinfection，即为感染复数。

本法明实施例中，细胞自噬是机体的一种防御和保护机制，当细菌感染腺癌人类肺泡基底上皮细胞a549时，腺癌人类肺泡基底上皮细胞a549可通过细胞自噬降解细菌，但有些细菌可以逃避自噬对其的吞噬作用而有利于自身的存活，如耐甲氧西林金葡菌mrsa。

本发明实施例中，自噬流检测原理为：

ad-mcherry-gfp-lc3b，即adenovirusexpressingmcherry-gfp-lc3bfusionprotein，是一种可以表达mcherry-gfp-lc3b融合蛋白的腺病毒，可以用于感染细胞或组织后进行细胞自噬(autophagy)的检测。

lc3是酵母自噬关键蛋白atg8在哺乳动物中的同源蛋白。lc3最初被分析鉴定为microtubule-associatedprotein1lightchain3(map1lc3)。lc3蛋白家族包括lc3a、b、c和gabarap等亚家族，其中，对于lc3b的研究最为广泛。lc3b被认为是细胞自噬信号通路最为关键的标志性蛋白。lc3b是一个具有125个氨基酸残基的蛋白，在蛋白合成后，被atg4酶切而失去了c端的22个氨基酸蛋白，从而暴露出c端的甘氨酸，人们把它命名为胞质形式的lc3bi。在细胞自噬的过程中，其c端暴露的甘氨酸经过一个类似泛素化的过程，以atg7为e1样激活酶(e1-likeactivatingenzyme)，以atg3为e2样连接酶(e2-likeconjugationenzyme)，以atg12-atg5-atg16复合物为e3样连接酶(e3-likeligase)，在c端甘氨酸上共价连接上磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，pe)而成为lc3b-pe即lc3bii。与胞质定位的lc3bi不同，lc3bii定位于自噬体(autophagosome)的内膜和外膜上。在自噬体与溶酶体融合后，自噬体外膜上的lc3bii被atg4所酶切，而自噬体内膜上的lc3bii则被溶酶体内的蛋白酶所降解。

ad-mcherry-gfp-lc3b感染后能够在靶细胞中有效表达红色荧光蛋白mcherry、绿色荧光蛋白(gfp)和lc3b的融合蛋白，呈现明亮的红色和绿色荧光，可以用于细胞自噬的检测。

自噬小体在与溶酶体融合过程中，溶酶体内的酸性环境会导致gfp荧光淬灭，这为追踪gfp-lc3b的细胞定位增加了难度。mcherry是一种来自于蘑菇珊瑚(mushroomcoral)的单体红色荧光蛋白，当其与gfp进行lc3b的共同标记时，在gfp被溶酶体酸性环境所淬灭的情况下，可以发出红色荧光的mcherry因为其卓越的稳定性而被保留。因此，通过融合表达mcherry-gfp-lc3b蛋白，可以非常有效地追踪自噬过程。在用ad-mcherry-gfp-lc3b腺病毒感染细胞后，在非自噬的情况下，荧光显微镜下mcherry-gfp-lc3b以弥散的黄色荧光(mcherry和gfp的综合效果)形式存在于细胞质中；而在自噬的情况下，荧光显微镜下mcherry-gfp-lc3b则聚集在自噬体膜上，以黄色斑点的形式表现出来(lc3bdotorpunctae)；当自噬体与溶酶体融合后，因gfp荧光的部分淬灭而以红色斑点的形式表现出来。

实施例1特女贞苷在诱导人肺癌上皮细胞(a549)自噬的检测

实验材料：特女贞苷，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(mrsa)，人肺癌上皮细胞，即a549细胞(培养于含10％胎牛血清的dmem培养基)，dmem购自美国hyclone公司，产品货号sh30022.01；胎牛血清购自上海吉泰依科赛生物科技有限公司，产品货号fnd500；ad-mcherry-gfp-lc3b腺病毒，购自碧云天生物技术有限公司，产品货号c3011-1ml)，等。

自噬流检测模型的建立：首先，在96孔板中以5×10⁴/孔接种a549细胞，每孔100ul，培养24h。ad-mcherry-gfp-lc3b腺病毒感染a549细胞，将病毒原液以无血清培养基稀释60倍，感染a549细胞，25ul/孔，感染2h。同时设一组a549细胞不加ad-mcherry-gfp-lc3b腺病毒，作为空白对照。在96孔板中，每孔补加含3％血清的dmem培养基，75ul/孔。继续培养，腺病毒感染24h，将培养基更换为新鲜含3％血清的dmem培养基，继续培养24h。

mrsa感染a549细胞模型的建立：除了空白对照组意外的其他组，均取耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌mrsa菌液用于感染实验。以0.1个moi感染a549细胞，即每孔加入mrsa的浓度为5×10³个/孔。耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌mrsa与a549细胞共孵育1h。弃去含菌液的培养基，用pbs缓冲液洗一遍，弃pbs，加入新鲜含3％血清的dmem培养基，100ul/孔。

实验分组：正常对照组：不做任何处理组；

模型组：仅mrsa感染组；

自噬阳性对照组：雷帕霉素，27nm/孔；

自噬阴性对照组：氯喹，50um/孔；

本发明实施例特女贞苷的浓度为0.34ug/ml；

按照实验分组，加入含药培养基(含药dmem培养基，血清含量为3％)，培养6h。采用confocalmicroscopy检测荧光表达。

在非自噬的情况下，荧光显微镜下mcherry-gfp-lc3b以弥散的黄色荧光(mcherry和gfp的综合效果)形式存在于细胞质中；而在自噬的情况下，荧光显微镜下mcherry-gfp-lc3b则聚集在自噬体膜上，以黄色斑点的形式表现出来(lc3bdotorpunctae)；当自噬体与溶酶体融合后，因gfp荧光的部分淬灭而以红色斑点的形式表现出来。

实验结果：

如图8所示，正常对照组中，细胞中lc3蛋白以弥散的形式布满这个细胞质，mrsa的感染使得lc3以弥散的状态出现在细胞核周围。

如图6所示，阳性对照组中，药物雷帕霉素能够促进a549细胞自噬，lc3蛋白以高亮的点状形式出现在细胞质中(图中箭头所指)；且红色荧光(mcherry)数量多于绿色荧光(gfp)，说明发生了自噬体与溶酶体的融合，gfp荧光的部分淬灭而以红色斑点的形式表现出来；说明阳性对照药物雷帕霉素的自噬过程通畅。

如图7所示，阴性对照组中，药物氯喹抑制细胞自噬，lc3蛋白弥散在细胞质中；且绿色荧光(gfp)数量多于红色荧光(mcherry)，说明自噬体与溶酶体的融合受到了抑制。

如图2所示，本发明实施例的特女贞苷0.34ug/ml处理组，lc3蛋白以点状形态出现在细胞核周围，且mcherry红色荧光数量多于gfp绿色荧光数量，说明发生了自噬体与溶酶体的融合，自噬过程畅通。

实施例2特女贞苷在诱导人肺癌上皮细胞(a549)自噬的检测

自噬流检测模型的建立：首先，在96孔板中以5×10⁴/孔接种a549细胞，每孔100ul，培养24h。ad-mcherry-gfp-lc3b腺病毒感染a549细胞，将病毒原液以无血清培养基稀释60倍，感染a549细胞，25ul/孔，感染2h。同时设一组a549细胞不加ad-mcherry-gfp-lc3b腺病毒，作为空白对照。在96孔板中，每孔补加含3％血清的dmem培养基，75ul/孔。继续培养，腺病毒感染24h，将培养基更换为新鲜含3％血清的dmem培养基，继续培养24h。

mrsa感染a549细胞模型的建立：除了空白对照组意外的其他组，均取耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌mrsa菌液用于感染实验。以0.1个moi感染a549细胞，即每孔加入mrsa的浓度为5×10³个/孔。耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌mrsa与a549细胞共孵育1h。弃去含菌液的培养基，用pbs缓冲液洗一遍，弃pbs，加入新鲜含3％血清的dmem培养基，100ul/孔。

按照实验分组，加入含药培养基，特女贞苷的浓度为1.1ug/ml，培养6h。采用confocalmicroscopy检测荧光表达。

如图3所示，实验结果：本发明实施例的特女贞苷1.1ug/ml处理组，lc3蛋白以点状形态出现在细胞核周围，且mcherry荧光数量多于gfp荧光数量，说明发生了自噬体与溶酶体的融合，自噬过程畅通。

实施例3特女贞苷在诱导人肺癌上皮细胞(a549)自噬的检测

自噬流检测模型的建立：首先，在96孔板中以5×10⁴/孔接种a549细胞，每孔100ul，培养24h。ad-mcherry-gfp-lc3b腺病毒感染a549细胞，将病毒原液以无血清培养基稀释60倍，感染a549细胞，25ul/孔，感染2h。同时设一组a549细胞不加ad-mcherry-gfp-lc3b腺病毒，作为空白对照。在96孔板中，每孔补加含3％血清的dmem培养基，75ul/孔。继续培养，腺病毒感染24h，将培养基更换为新鲜含3％血清的dmem培养基，继续培养24h。

mrsa感染a549细胞模型的建立：除了空白对照组意外的其他组，均取耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌mrsa菌液用于感染实验。以0.1个moi感染a549细胞，即每孔加入mrsa的浓度为5×10³个/孔。耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌mrsa与a549细胞共孵育1h。弃去含菌液的培养基，用pbs缓冲液洗一遍，弃pbs，加入新鲜含3％血清的dmem培养基，100ul/孔。

按照实验分组，加入含药培养基，特女贞苷的浓度为3.3ug/ml，培养6h，采用confocalmicroscopy检测荧光表达。

如图4所示，实验结果：本发明实施例的特女贞苷3.3ug/ml处理组，lc3蛋白以点状形态出现在细胞核周围，且mcherry红色荧光数量多于gfp绿色荧光数量，说明发生了自噬体与溶酶体的融合，自噬过程畅通。

本发明实施例1至实施例3中，随着特女贞苷剂量增加，发生自噬的细胞数量增加；特女贞苷(0.34ug/ml、1.1ug/ml及3.3ug/ml)三个剂量处理组在自噬诱导效应中体现出一定的量效关系，随着特女贞苷浓度的增加，mcherry红色荧光数量多于gfp绿色荧光数量增多，因此，特女贞苷能够促使mrsa感染的a549细胞发生自噬。

本发明实施例的特女贞苷作为自噬诱导剂开发成药物治疗疾病，或辅助治疗疾病。本发明实施例的特女贞苷自噬诱导剂还可与杀菌或者治疗肿瘤的有效成分一起共同组成药物组合物，辅助治疗癌症或细菌感染性疾病等。其中，治疗肿瘤的有效成分包括顺铂或者紫杉醇。(matai,sunguo-ping,lijia-bin.methodsforautophagydetection[j].prog.biochem.biophys.,2012,39(3):204-209.)

其中，本发明实施例的特女贞苷在诱导肿瘤细胞自噬性死亡或增敏生物毒化疗药物抗肿瘤作用中的肿瘤为白血病、肺癌、结肠癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、乳腺癌、胰腺癌、子宫颈癌、胃癌、肝癌、肉瘤或黑色素瘤。

细菌感染性疾病包括mrsa、staphylococcusaureus等葡萄球菌，或肺炎双球菌、炭疽杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌等革兰氏阳性菌感染引起的肺炎等疾病。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。