一种用于预防或治疗乙型肝炎病毒感染的药物及制备方法和应用与流程

文档序号：17631286发布日期：2019-05-11 00:08阅读：413来源：国知局

本发明属于抗病毒药物技术领域，尤其涉及一种用于预防或治疗乙型肝炎病毒感染的药物及制备方法和应用。

背景技术：

目前，业内常用的现有技术是这样的：

乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)感染是引起肝癌的主要因素之一，严重威胁着人类的生命健康。全世界有3.64亿人感染慢性乙型肝炎病毒(hbv)，每年导致80万人死亡。而我国是乙型肝炎病毒感染的高发区，约有1.2亿慢性乙肝患者，每年约有30万人死于慢性乙肝引起的肝癌。hbv属于嗜肝dna病毒科，基因组为部分双链环状dna，hbv的核心颗粒直径为28nm，为20面体，有感染性的病毒颗粒又称作dane颗粒，直径为42nm。hbv感染会导致一系列的肝脏疾病，从急性肝炎(包括暴发性肝功能衰竭)到慢性肝炎，肝硬化和肝细胞癌。hbv复制本身不直接导致细胞病变，多数的hbv携带者是无症状的，肝损害也很小，宿主的抗病毒免疫是导致肝损伤等临床症状的主要原因。hbv感染人体后的症状与被感染者的年龄和免疫力相关。新生儿中肝炎99％以上是无症状的，1–5岁儿童中，只有10％是有症状的。三分之一的成人急性乙型肝炎患者有临床症状，其中约1％为爆发性肝炎，致死率达到70％。爆发性肝炎伴随着强烈的抗病毒免疫，病毒很快被清除。95％的成年人感染后会自发地清除病毒，而90％的幼儿和30％的1–5岁的儿童则会导致慢性感染。hbv感染和相关疾病的诊断是根据一系列的临床的生化、组织和血清学的指标来进行的。检测病毒感染的指标主要有病毒的几种抗原，和相对应的特异性抗体以及hbvdna；检测病人肝脏病变情况主要有血液丙氨酸和谷丙转氨酶(alaninetransaminase，alt)，以及肝组织检测炎症和纤维化程度。

目前临床上乙型肝炎病毒感染的治疗主要有两类药物：干扰素和核苷类似物。临床应用的干扰素包括ifnα2a，ifnα2b和ifnα1b，这些是传统的干扰素，还包括peg-ifnα2a和peg-ifnα2b。ifn用于治疗慢性hbv感染已经有超过30年的历史。临床上ifnα对于hbeag阳性的病人，在6个月内，每周注射三次，有25％的病人hbeag转阴。12个月的ifnα治疗结果显示10–17％的病人hbsag转阴。对于hbeag阴性的病人，12个月的ifnα治疗后60％病人血清中检验不到hbvdna。但是有较多副作用，包括流感样症状，疲劳，骨髓抑制，抑郁，自身免疫性疾病的恶化和暴露。经peg修饰的ifn即peg-ifn，其抗病毒机理与ifnα相同，但明显提高了ifnα的药物代谢动力学，注射次数为每周一次，血清中ifnα浓度能维持较高的水平。2003年的一项工作表明，peg-ifn的治疗效果优于ifn。但另一方面，peg-ifn也有其副作用和局限，若治疗初期的效果不佳，则应停止用药，考虑其他治疗方案。核苷类似物拉米夫定(lamivudine，lam)和替比夫定(telbivudine，ldt)；脱氧鸟苷类似物恩替卡韦(entecavir，etv)；核苷膦酸酯，阿德福韦酯(adefovir，adv)和富马酸替诺福韦酯(tenofovirdisoproxilfumarate，tdf)。核苷类似物通过抑制前基因组rna逆转录为hbvdna而对cccdna没有直接影响。主要优点是耐受性良好可以长期治疗，但是也有一些缺点，如高复发率，低hbsag转阴率，单一用药时容易产生耐药性。

sox9是sox家族中一种重要的转录因子，位于17号常染色体。这个家族起源于一个共同的祖先，通过重复、散布、突变、新功能的获得等步骤来增加数。与其他已知的sox转录因子类似，sox9通过高度保守的hmg结构能够识别特定dna序列c(t/a)ttg(t/a)(t/a)。人们将含有保守性hmg结构域的sox家族分为a-j组，其中属于e组sox9不同于大多为单一外显子结构sox家族基因，是第一个被报道的含有内含子的sox基因。sox9基因位于17号染色体，长度约为3934bp,包含有三个外显子和两个内含子，一个可读框(orf)。sox9基因分布广泛，不论是在低等生物中还是高等生物中都发现了sox9基因的存在。sox9首先在人类一种躯干发育异常中发现的决定基因，是一种软骨形成的主要调控因子，并且参与睾丸、肾脏、心脏、脑等各种重要器官的发育。sox9在性别决定中起到重要的作用。人们发现在sox3和sox9参与性腺分化的；在雌性中没有sry基因，因此sox3发挥作用从而抑制sox9的功能，从而抑制了sox9对睾丸决定的启动作用；而在雄性个体中sry基因抑制了sox3，使sox9作用得以发挥，参与睾丸决定。同时人们发现认为sox9与foxl2保持相互排斥关系。sox9通常只在男性体内活动，当男性的sox9的表达，foxl2的表达量就会抑制，这种情况在女性体内却正好相反。如果将sox9基因前端的增强子敲出掉，sox9表达量明显下降的情况下，雄性小鼠的性腺将变成雌性。另外，sox9与肝硬化有关，并且可以作为新的肝癌干细胞标志物。但是还没有任何相关报道sox9的表达和hbv复制之间的关系。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有技术中高复发率，低hbsag转阴率，单一用药时容易产生耐药性。hbv可以特异性在肝细胞中共价闭合的环状dna(cccdna)，cccdna可以与组蛋白或非组蛋白形成细胞染色质，从而稳定存在于肝细胞。药物治疗后，可以减少hbsag等hbv病毒蛋白产生，却难以清除细胞内存在cccdna，所以药物停止使用后会容易出现复发。为了真正治愈hbv感染，需要将hbv感染的肝细胞中完全清除cccdna。

(2)sox9与肝硬化有关，并且可以作为新的肝癌干细胞标志物。但是还没有任何相关报道sox9的表达和hbv复制之间的关系。sox9作为一种重要转录因子所认知，之前研究主要集中细胞发育与性别决定，我们通过实验首次发现sox9能够抑制hbv的复制。

解决上述技术问题的难度：

现有核苷类似物能够有效抑制hbv逆转录，却不能直接降解cccdna。

解决上述技术问题的意义：

sox9可以直接减少hbvcccdna的形成，从而减少cccdna在肝内形成稳定的染色质，从源头上清除cccdna。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于预防或治疗乙型肝炎病毒感染的药物及制备方法和应用。

本发明是这样实现的，一种用于预防或治疗乙型肝炎病毒感染的药物，所述用于预防或治疗乙型肝炎病毒感染的药物以人sox9蛋白作为药物活性成分制备的药物。通过原核蛋白表达系统，iptg诱导表达sox9蛋白，进而纯化后获得sox9蛋白(509bp)。sox9蛋白氨基酸序列为seqidno：1。

1mnlldpfmkmtdeqekglsgapsptmsedsagspcpsgsgsdtentrpqentfpkgepdl

61kkeseedkfpvcireavsqvlkgydwtlvpmpvrvngssknkphvkrpmnafmvwaqaar

121rkladqyphlhnaelsktlgklwrllnesekrpfveeaerlrvqhkkdhpdykyqprrrk

181svkngqaeaeeateqthispnaifkalqadsphsssgmsevhspgehsgqsqgpptpptt

241pktdvqpgkadlkregrplpeggrqppidfrdvdigelssdvisnietfdvnefdqylpp

301nghpgvpathgqvtytgsygisstaatpasaghvwmskqqapppppqqppqappapqapp

361qpqaappqqpaappqqpqahtlttlssepgqsqrthikteqlspshyseqqqhspqqiay

421spfnlphyspsyppitrsqydytdhqnsssyyshaagqgtglystftymnpaqrpmytpi

481adtsgvpsipqthspqhweqpvytqltrp。

本发明的另一目的在于提供一种包含所述用于预防或治疗乙型肝炎病毒感染的药物的片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂中的任意一种或几种。

本发明的另一目的在于提供一种包含所述用于预防或治疗乙型肝炎病毒感染的药物的纳米制剂，所述纳米制剂由药物活性成分按照质量比由5％sox9蛋白、90％淀粉和5％pvp组成。

本发明的另一目的在于提供一种包含所述用于预防或治疗乙型肝炎病毒感染的药物的注射剂，所述注射剂为1mg/ml，溶于生理盐水。

本发明的另一目的在于提供一种由所述用于预防或治疗乙型肝炎病毒感染的药物的sox9蛋白表达的质粒。

本发明的另一目的在于提供一种所述sox9蛋白表达的质粒的构建方法，所述sox9蛋白表达的质粒的构建方法包括：以从hepg2细胞中提取的总mrna为模板，先通过逆转录形成cdna，再以该cdna为模板，用特异引物扩增出完整sox9基因片段，引物序列如下：

sox9cdsforward：5’-cgggatccatgaatctcctggaccc-3’；

sox9cdsreverse：5’-ggaattctcaaggtcgagtgagc-3’；

通过特异限制性内切酶bamhi和ecori酶切、连接将sox9基因克隆到载体pcdna3.1上，得到pcdna3.1-sox9的过表达质粒，并测序鉴定。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明提供的人sox9是在人体内组成性表达的一种细胞因子，生理浓度下对人体没有毒副作用；人sox9的抗病毒作用机制是通过直接作用于病毒包膜，或影响病毒吸附，或改变细胞内的信号通路，从而抗病毒，因其抗病毒的机制多样化，不易使病毒产生耐药性。

附图说明

图1是本发明实施例提供的用于预防或治疗乙型肝炎病毒感染的药物的检测方法流程图。

图2是本发明实施例提供的pcdna3.1-sox9过表达的效果示意图。

图3是本发明实施例提供的干扰rna的干扰效果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的目的是制备一种人sox9蛋白用于预防或治疗乙型肝炎病毒感染的应用，从而为临床上乙型肝炎的治疗提供一类安全高效且毒副作用小的多肽。通过单独使用或者与其它抗hbv药物联合使用，sox9能够在抗乙型肝炎病毒感染过程中发挥重要作用。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细说明；

如图1所示，本发明实施例提供的用于预防或治疗乙型肝炎病毒感染的药物的检测方法，具体包括以下步骤：

s101：sox9蛋白抗乙型肝炎病毒活性的评价：

s102：将人sox9的过表达质粒或小干扰rna与能表达hbv的质粒phbv1.3共转染到肝细胞系hepg2或huh7中；

s103：检测细胞培养上清中hbv分泌抗原hbeag和hbsag的表达量和细胞内hbv复制中间体核衣壳相关dna的水平。

步骤s101中sox9蛋白氨基酸序列为seqidno：1。