一种簕草石方提取物及其在保肝中的应用的制作方法

本发明属于医药产品研究开发技术领域。本发明涉及一种簕草石方提取物及其在保肝中的应用。

背景技术：

肝脏是机体最大的实质性器官，承担着人体重要的消化、代谢、解毒和分泌功能，对机体有重要保护作用。肝损伤是一种常见的肝脏疾病，常伴随代谢和合成的机能障碍，进而导致肝纤维化、肝硬化、肝炎、甚至肝癌等严重疾病，严重影响着人类的健康。急性肝损伤是一种常见的肝脏临床疾病，临床上轻者表现为血清转氨酶升高、胆红素升高等，可引发慢性肝炎、肝衰竭、肝性脑病等多种肝脏疾病。研究显示，急性肝损伤是可能由毒物、化学毒素、药物、酒精、病毒、细菌、寄生虫等多种致病因素造成。目前对急性肝损伤形成的作用机制有多种解释，由氧自由基介导的细胞损伤在肝脏损伤中一直备受关注。化学毒物、药物等作用于肝细胞，会引发强烈的脂质过氧化反应并产生脂质过氧化物(mda)，造成血浆内丙氨酸转氨酶(alt)和天冬氨酸转氨酶(ast)含量的升高。在肝脏保护中，超氧化物歧化酶(sod)可以将超氧阴离子转化为h2o2，在谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)和cat的作用下进一步转化为h2o，减少肝脏氧化损伤，所以sod活力的高低间接反应了机体清除氧自由基的能力。而mda含量的高低，间接反应了机体细胞受氧自由基攻击的严重程度。目前，现有临床肝损伤治疗的手段仍然十分有限，肝损伤仍旧是全世界关注的健康难题。据世界卫生组织报告显示，世界上有10％的人口在遭受着的肝脏疾病的困扰。近年来，虽然研发出了一些预防和治疗肝损伤的药物，但是长期服用之后或疗效有限或有严重的副作用，许多药物停止用药后有疾病复跳的现象，没有起到真正治疗的效果。因此，开发安全、有效、可靠的保肝药物十分迫切。

先前发明人采用95％乙醇对复方中药(簕草石方，由老鼠簕、穿破石和排钱草三味药材组成)进行提取获得一种能显著降低大鼠肝脏组织中氧自由基和脂质过氧化物的含量，提高sod活性，改善肝细胞脂肪变性、空泡样变性、损伤、坏死、核碎裂等病理状况的提取物，为进一步提高提取物的活性，优化提取方法，本发明以水代替95％乙醇对簕草石方提取物的制备做了进一步优化。

技术实现要素：

本发明提供一种复方中药，其特征在于，按重量份计，所述复方中药由以下原料组成：老鼠簕4-6份，排钱草1-3份，穿破石2-4份。优选老鼠簕5份，排钱草2份，穿破石3份。

本发明的另一实施方案提供一种复方中药提取物，其特征在于所述复方中药提取物的制备方法包括如下步骤：

(1)按上述重量份将老鼠簕、排钱草、穿破石，粉碎混匀，得物料；

(2)将步骤(1)得到的物料，用水浸泡1-3h后，回流提取2-3h，过滤收集提取液，滤渣再用水回流提取1.5-2h，合并两次提取液，浓缩至浓度为1g/ml生药量，装瓶，密封，即得所述复方中药提取物。

步骤(1)所述粉碎优选粉碎至20-100目；步骤(2)中第一次使用水的用量为老鼠簕、排钱草、穿破石总质量的10倍，第二次使用水的用量为老鼠簕、排钱草、穿破石总质量的8倍。

本发明的另一实施方案提供一种复方中药提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)按上述重量份将老鼠簕、排钱草、穿破石，粉碎混匀，得物料；

(2)将步骤(1)得到的物料，用水浸泡1-3h后，回流提取2-3h，过滤收集提取液，滤渣再用水回流提取1.5-2h，合并两次提取液，浓缩至浓度为1g/ml生药量，装瓶，密封，即得所述复方中药提取物。

步骤(1)所述粉碎优选粉碎至20-100目；步骤(2)中第一次使用水的用量为老鼠簕、排钱草、穿破石总质量的10倍，第二次使用水的用量为老鼠簕、排钱草、穿破石总质量的8倍。

本发明的另一实施方案提供上述复方中药、复方中药提取物或其药学上可接受的盐在制备保肝药物中的应用。

本发明的另一实施方案提供一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物以上述复方中药、复方中药提取物或其药学上可接受的盐作为有效成分；还可以包括药学上可接受的辅料；还任选包括其他保肝药物。该药物组合物的剂型优选片剂、硬胶囊剂、丸剂、颗粒剂、软胶囊剂、口服液体制剂或注射剂。

本发明所述老鼠簕、排钱草、穿破石可以为中药材或中药饮片；老鼠簕指爵床科植物老鼠簕(acanthusilicifoliuslinn.)的干燥全株，排钱草指豆科植物排钱树(phyllodiumpulchellum(l.)desv.)的干燥地上部分，穿破石指桑科植物构棘(cudraniacochinchinensis(lour.)kudoetmasam.)或柘木(cudraniatricuspidata(carr.)bur.exlavallee)的干燥根。

与现有技术相比，本发明的优点在于：通过以水代替95％乙醇对簕草石方提取物的制备方法进行优化，获得一种在中剂量就能显著降低大鼠肝脏组织中氧自由基和脂质过氧化物的含量，提高sod活性，改善肝细胞脂肪变性、空泡样变性、损伤、坏死、核碎裂等病理状况的提取物。

附图说明

图1是提取物a的指纹图谱(测定仪器：waters1525；色谱柱：ymc-packods-a(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇(a)，0.1％三氟乙酸水溶液(b)；梯度洗脱：0-15min，10-25％a；15-30min，25-35％a；30-60min，35-40％a；60-75min，40-50％a；75-115min，50-100％a；115-120min，100％a；流量：1.0ml/min；柱温25℃；进样量20μl；检测器：waters2996；紫外检测波长λ＝254nm、280nm、330nm、360nm、380nm)。

图2是提取物e(醇提物)的指纹图谱(测试条件同图1)。

图3是各组实验大鼠肝组织病理切片图(200×)。

具体实施方式

实施例1

配方：老鼠簕50g、排钱草20g、穿破石30g

(1)按上述配方量将老鼠簕、排钱草、穿破石，粉碎至20-100目混匀，得物料；

(2)将步骤(1)得到的物料，用水(1000g)浸泡1h后，回流提取3h，过滤收集提取液，滤渣再用水(800g)回流提取2h，合并两次提取液，浓缩至浓度为1g/ml生药量，装瓶，密封，即得所述复方中药提取物(以下简称提取物a，其指纹图谱见图1)。

实施例2

配方：老鼠簕50g、排钱草20g、穿破石30g

(1)按上述配方量将老鼠簕、排钱草、穿破石，粉碎至20-100目混匀，得物料；

(2)将步骤(1)得到的物料，用水(1000g)浸泡3h后，回流提取2h，过滤收集提取液，滤渣再用水(800g)回流提取1.5h，合并两次提取液，浓缩至浓度为1g/ml生药量，装瓶，密封，即得所述复方中药提取物(以下简称提取物b，指纹图谱与图1一致)。

实施例3

配方：老鼠簕40g、排钱草10g、穿破石20g

(1)按上述配方量将老鼠簕、排钱草、穿破石，粉碎至20-100目混匀，得物料；

(2)将步骤(1)得到的物料，用水(700g)浸泡1h后，回流提取3h，过滤收集提取液，滤渣再用水(560g)回流提取2h，合并两次提取液，浓缩至浓度为1g/ml生药量，装瓶，密封，即得所述复方中药提取物(以下简称提取物c)。

实施例4

配方：老鼠簕60g、排钱草30g、穿破石40g

(1)按上述配方量将老鼠簕、排钱草、穿破石，粉碎至20-100目混匀，得物料；

(2)将步骤(1)得到的物料，用水(1300g)浸泡1h后，回流提取3h，过滤收集提取液，滤渣再用水(1040g)回流提取2h，合并两次提取液，浓缩至浓度为1g/ml生药量，装瓶，密封，即得所述复方中药提取物(以下简称提取物d)。

实施例5

配方：老鼠簕50g、排钱草20g、穿破石30g

(1)按上述配方量将老鼠簕、排钱草、穿破石，粉碎至20-100目混匀，得物料；

(2)将步骤(1)得到的物料，用95％乙醇(1000g)浸泡1h后，回流提取3h，过滤收集提取液，滤渣再用95％乙醇(800g)回流提取2h，合并两次提取液，浓缩至浓度为1g/ml生药量，装瓶，密封，即得所述复方中药提取物(以下简称提取物e，其指纹图谱见图2)。

实施例6药理实验

1材料与仪器

1.1受试物及药品

提取物a-e；水飞蓟宾(天津天士力圣特制药有限公司，批号：201704)；丙氨酸转氨酶(alt)测定elisa试剂盒(r&d公司)；天冬氨酸转氨酶(ast)测定elisa试剂盒(r&d公司)；sod(超氧化物歧化酶)及mda(丙二醛)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：201706)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，货号：100092683)；二甲苯(国药集团化学试剂有限公司，货号：10023418)；苏木精—伊红(h.e.)染液(武汉塞维尔生物科技有限公司，货号：g1005)；分化液(武汉塞维尔生物科技有限公司，货号：g1005-3)；返蓝液(武汉塞维尔生物科技有限公司，货号：g1005-4)；中性树胶(国药集团化学试剂有限公司，货号：10004160)。

1.2动物

spraguedawley(sd)大鼠，spf级，180-200g，雄性，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号scxk(京)2016-0011。自由进食水，环境温度18-22℃，12h光照周期的动物室内饲养。实验前饲养一周以适应环境。

1.3仪器

multiskanspectrum酶标仪(美国thermo公司)、tgl-18m高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机有限公司)、dy89-ii组织匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、脱水机(武汉俊杰电子有限公司)、包埋机(武汉俊杰电子有限公司)、病理切片机(上海徕卡仪器有限公司)、冻台(武汉俊杰电子有限公司)、组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)、正置光学显微镜(日本尼康公司)、成像系统(日本尼康公司)。

2方法

2.1肝损伤实验

2.1.1动物分组与造模

取180-200gsd大鼠，雄性，随机分为12组，每组8只。提取物a、e低、中、高剂量组分别按3g/kg、6g/kg、12g/kg(生药/体重)给药；正常对照组及四氯化碳损伤组：按给药组等体积给予蒸馏水；水飞蓟宾组：水飞蓟宾100mg/kg以上药物均经口灌胃给药，连续给药4周。末次灌胃2h后，除正常组腹腔注射1ml/kg(体重)的橄榄油溶液外，其余各组均腹腔注射相同体积的50％ccl4油溶液进行急性肝损伤造模，随后禁食不禁水。

2.1.2alt、ast测定

取血清，按照试剂盒的方法进行alt及ast测定。

2.1.3sod、mda测定

取肝组织块，按照试剂盒的方法进行sod及mda测定。

2.1.4肝脏组织病理学观察

(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯ⅰ20min，二甲苯ⅱ20min，无水乙醇ⅰ5min，无水乙醇ⅱ5min，75％酒精5min，自来水洗。

(2)苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。

(3)伊红染色：切片依次入85％、95％的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min。

(4)脱水封片：切片依次放入无水乙醇i5min，无水乙醇ii5min，无水乙醇ⅲ5min，二甲ⅰ5min，二甲苯ⅱ5min透明，中性树胶封片。

(5)显微镜镜检，图像采集分析。

2.2统计学分析

采用spss22.0统计分析软件进行t检验，数据用“均数±标准差”表示，双侧检验以p＜0.05表示差别有统计学意义。

3结果

3.1提取物对ccl4诱导肝损伤大鼠的血清alt、ast影响

与正常组相比，四氯化碳损伤组大鼠血清中alt与ast活性显著升高(p＜0.01)；与四氯化碳损伤组相比，提取物a、e高、中、低剂量组和水飞蓟宾组的血清alt与ast水平均明显降低，统计学比较差异显著(p＜0.05，p＜0.01)。结果见表1-2。

表1提取物a对大鼠血清alt和ast的影响

注：与正常组比较##p<0.01；与模型组比较*p<0.05，**p<0.01

表2提取物e对大鼠血清alt和ast的影响

注：与正常组比较##p<0.01；与模型组比较*p<0.05，**p<0.01

3.2提取物对ccl4诱导肝损伤大鼠肝组织sod、mda的影响

与正常对照组比较，四氯化碳损伤组大鼠的sod活性明显降低(p＜0.01)，mda活性极显著升高(p＜0.01)；与四氯化碳损伤组比较，提取物a、e低、中、高剂量组的sod活性均显著升高(p＜0.05，p＜0.01)，mda活性显著降低(p＜0.05，p＜0.01)，结果见表3-4。

表3提取物a对大鼠肝组织sod和mda含量的影响

注：与正常组比较##p<0.01；与模型组比较*p<0.05，**p<0.01

表4提取物e对大鼠肝组织sod和mda含量的影响

注：与正常组比较##p<0.01；与模型组比较*p<0.05，**p<0.01

3.3提取物a、e组织病理切片图，见图3。

提取物b的药理活性实验结果与提取物a的基本一致，提取物c、d对alt、ast、mda起到了一定的降低作用，但效果明显弱于提取物a、b。

4讨论

本次实验表明簕草石方提取物对肝脏具有保护作用，可以改善肝脏损伤造成的血清转氨酶升高，降低大鼠肝脏组织中氧自由基和脂质过氧化物的含量，提高sod活性，且抑制肝细胞脂肪变性、空泡样变性、损伤、坏死，核碎裂等病理状况，有利于肝损伤的恢复。