本发明涉及生物医用新材料技术领域，尤其涉及一种智能响应型基因载体传递体系及其制备方法和应用。
背景技术：
癌症作为一种恶性疾病，威胁着人类的生命健康。在癌症的治疗手段中，基因治疗作为一种全新的治疗方式，得到人们的广泛关注。基因治疗的关键是高效的基因载体。目前基因载体主要分为病毒类基因载体和非病毒类基因载体。病毒类基因载体存在较高的免疫原性，因此临床上应用受限。在非病毒类基因载体中，聚阳离子基因载体由于其独特的性能得到人们的极大关注。一般地，正电性的聚阳离子与负电性的核酸通过静电相互作用形成复合物颗粒，进行基因的担载和传输[参见fang，h.p.；guo，z.p.；lin，l.；chen，j.；sun，p.j.wu，j.y.；cainaxu；tian，h.y.；chen，x.s.molecularstringssignificantlyimprovedthegenetransfectionefficiencyofpolycations.j.am.chem.soc.2018，140，11992-12000.fang，h.p.；lin，l.；chen，j.；wu，j.y.；tian，h.y.；chen，x.s.zincioncoordinationsignificantlyimprovedthetransfectionefficiencyoflowmolecularweightpolyethylenimine.biomater.sci.，2019，c9bm00039a]。但是对于聚阳离子基因载体的体内应用来说，由于血液中含有许多负电性的蛋白，其易与聚阳离子基因载体发生静电相互作用，引起载体/核酸复合物颗粒发生团聚，进而影响载体的传输性能。
通常对于体内水平的聚阳离子基因载体来说，我们希望其在体内传输过程中保持较低的正电荷密度，这样有利于载体/核酸复合物在体内传输过程中稳定，而在肿瘤细胞内吞阶段，我们希望其具有较高的正电荷密度，这样能够较好地被肿瘤细胞内吞。根据肿瘤微环境与正常的生理环境的差异，人们构建了不同智能响应的聚阳离子基因载体传递体系[参见guan，x.w.；guo，z.p.，lin，l.；chen，j.；tian，h.y.；chen，x.s.ultrasensitivephtriggeredcharge/sizedual-reboundgenedeliverysystem.nanolett.2016，16，6823-6831.tian，h.y；tang，z.h.；zhuang，x.l.；chen，x.s.；jing，x.b.biodegradablesyntheticpolymers：preparation，functionalizationandbiomedicalapplication.prog.polym.sci.2012，37，237-280]。目前，构建载药性能较好的聚阳离子基因载体传递体系仍是大家研究的热点。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种智能响应型基因载体传递体系及其制备方法和应用，本发明提供的一种智能响应型基因载体遮蔽体系具有交底的细胞毒性，且在肿瘤不菲具有高的转染效率。
本发明提供了一种智能响应型基因载体传递体系，包括：内核以及包覆在内核上的外壳；
其中，所述外壳为缩硫酮改性的葡聚糖；
所述缩硫酮改性的葡聚糖中缩硫酮与葡聚糖的摩尔比为(1～1200)∶1；
所述内核为聚阳离子。
优选的，所述缩硫酮改性的葡聚糖中的葡聚糖的数均分子量为2000～200000。
优选的，所述缩硫酮改性的葡聚糖中缩硫酮与葡聚糖的摩尔比为(30～1000)∶1，优选为(60～500)∶1。
优选的，所述缩硫酮改性的葡聚糖具有式(i)所示结构，
其中，m为1～1200；
n为12～1200；
a为0～15；
b为0～15。
优选的，所述缩硫酮改性的葡聚糖按照以下方法制备得到：
将巯基烷基酸与丙酮在氯化氢氛围下反应，得到缩硫酮；
然后将缩硫酮与葡聚糖反应，得到缩硫酮改性的葡聚糖。
优选的，所述聚阳离子为对甲苯磺酰基精氨酸改性的聚-α-赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、壳聚糖和聚酰胺-胺中的一种或几种。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物，包括载体和负载在载体上的药物；
其中，所述载体为本发明所述的智能响应型基因载体传递体系，所述药物为dna和/或rna。
优选的，所述智能响应型基因载体传递体系中的聚阳离子与药物的质量比为(2～10)∶1。
优选的，所述抗肿瘤药物中的肿瘤细胞为4t1、mcf-7、hela、b16f10、ct26、skbr3、a549、hepg-2、pc3、a2780、sk-ov-3或huh-7。
本发明还提供了一种本发明所述的抗肿瘤药物的制备方法，包括：
1)将智能响应型基因载体传递体系中的聚阳离子与药物复合，得到聚阳离子药物复合物；
2)将缩硫酮改性的葡聚糖与聚阳离子药物复合物混合，得到抗肿瘤药物。
与现有技术相比，本发明提供了一种智能响应型基因载体传递体系及其制备方法和应用，本发明提供的智能响应型基因载体传递体系包括内核以及包覆在内核上的外壳；其中，通过选择所述外壳为缩硫酮改性的葡聚糖；且使所述缩硫酮改性的葡聚糖中缩硫酮与葡聚糖的摩尔比为(1～1200)∶1；所述内核为聚阳离子；通过实验结果表明，本发明提供的基因载体传递体系具有较低的细胞毒性以及优异的h2o2响应性，且在肿瘤部位具有高效的转染效率，构建的基因载体传递体系介导治疗基因具有显著的抗肿瘤效果。即本发明提供的基因载体传递体系在基因治疗抗肿瘤领域有着广阔的应用前景。
具体实施方式
本发明提供了一种智能响应型基因载体传递体系，包括：内核以及包覆在内核上的外壳；
其中，所述外壳为缩硫酮改性的葡聚糖；
所述缩硫酮改性的葡聚糖中缩硫酮与葡聚糖的摩尔比为(1～1200)∶1；
所述内核为聚阳离子。
按照本发明，所述缩硫酮改性的葡聚糖中葡聚糖(dsdpa-dex)的数均分子量优选为2000～200000，更优选为10000～180000，更优选为20000～150000，更优选为50000～100000；所述缩硫酮改性的葡聚糖具有式(i)所示结构，
其中，m为1～1200，优选为10～1000，更优选为50～800，最优选为100～500；
n为12～1200，优选为20～1000，更优选为50～800，最优选为100～600；
所述a为0～15，优选为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；所述b为0～15，优选为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。所述缩硫酮改性的葡聚糖中缩硫酮与葡聚糖的摩尔比为(30～1000)∶1，更优选为(60～500)∶1，更优选为(90～300)∶1，更优选为(120～200)∶1。
本发明中，本发明对所述缩硫酮改性的葡聚糖的来源没有特殊要求，优选可以按照以下方法制备得到：
首先将巯基烷基酸与丙酮在氯化氢氛围下反应，得到缩硫酮；其中，所述巯基烷基酸与丙酮的摩尔比优选为1∶(2～4)，更优选为1∶3；所述反应的温度优选为20～40℃，更优选为30～35℃；所述反应时间优选为6～24h，更优选为10～20小时；反应完毕后，优选将反应液在冰盐混合物条件下冷却结晶，得到缩硫酮(dsdpa)。
然后将缩硫酮与葡聚糖(dex)反应，得到缩硫酮改性的葡聚糖；其中，缩硫酮与葡聚糖的摩尔比为(30～1000)∶1，更优选为(60～500)∶1，更优选为(90～300)∶1，更优选为(120～200)∶1；所述反应的催化剂优选为c8h17n3·hcl和4-二甲氨基吡啶(dmap)；所述c8h17n3·hcl、dmap和dsdpa的摩尔比优选为(1～5)∶(1～5)∶1，更优选为(2～4)∶(2～4)∶1，更优选为(2.5～3)∶(2.5～3)∶1；所述反应的溶剂优选为dmso；所述dex在dmso溶液的浓度优选为0.01～0.5mg/ml，更优选为0.1～0.4mg/ml，更优选为0.2～0.3mg/ml；所述反应的温度优选为20～40℃，更优选为30～35℃，反应时间优选为60～80h，更优选为70～75h；本发明中，缩硫酮与葡聚糖(dex)反应完毕后，还将得到的反应液透析，得到缩硫酮改性的葡聚糖，然后将其冻干；其中，所述透析用透析袋的分子量为1000～7000；所述步骤中透析的时间为60～80h；所述冻干温度设定为-50～-80℃。
更具体的，所述具有式(i)结构的缩硫酮改性的葡聚糖的反应流程如下：
将式(ii)结构的化合物、式(iii)的化合物与丙酮在氯化氢气体氛围下反应，得到式(iv)结构的化合物；
将得到的式(iv)结构的化合物与葡聚糖反应，得到式(i)结构的缩硫酮改性的葡聚糖。
按照本发明，所述聚阳离子优选为甲苯磺酰基精氨酸改性的聚-α-赖氨酸(pll-rt)，聚乙烯亚胺(pei)，聚赖氨酸(pll)，壳聚糖(cs)或聚酰胺-胺(pamam)，更优选为甲苯磺酰基精氨酸改性的聚-α-赖氨酸，其中，所述甲苯磺酰基精氨酸改性的聚-α-赖氨酸中聚-α-赖氨酸与甲苯磺酰基精氨酸的摩尔比优选为1∶(10～200)，更优选为1∶(30～150)，最优选为为1∶(60～120)，最优选为为1∶(70～90)。
按照本发明，本发明所述的智能响应型基因载体传递体系中，内核与包覆在内核上的外壳之间通过静电作用来实现包覆的，且内核的聚阳离子与外壳的缩硫酮改性的葡聚糖的质量比优选为1∶(0.8～1.2)，更优选为1∶1。
本发明还提供了一种抗肿瘤药物，包括载体和负载在载体上的药物；
其中，所述载体为本发明所述的智能响应型基因载体传递体系，所述药物为dna和/或rna，所述智能响应型基因载体传递体系的聚阳离子与药物的质量比为(2～10)∶1，更优选为(2.5～8)∶1，最优选为(3～7)∶1，最优选为(4～6)∶1，最优选为(5～5.5)∶1；本发明对所述抗肿瘤药物中的肿瘤细胞没有特殊要求，所有肿瘤细胞均可，优选为4t1、mcf-7、hela、b16f10、ct26、skbr3、a549、hepg-2、pc3、a2780、sk-ov-3或huh-7。
本发明还提供了一种本发明所述的抗肿瘤药物的制备方法，包括：
1)将智能响应型基因载体传递体系中的聚阳离子与药物复合，得到聚阳离子药物复合物；
2)将缩硫酮改性的葡聚糖与聚阳离子药物复合物混合，得到抗肿瘤药物。
按照本发明，本发明首先将智能响应型基因载体传递体系中的聚阳离子与药物复合，得到聚阳离子药物复合物；然后将缩硫酮改性的葡聚糖与聚阳离子药物复合物混合，得到抗肿瘤药物；其中，本发明对复合或者混合的方法没有特殊要求，本领域技术人员可以根据本领域公知常识选择合适的复合或混合方式；其中，所述智能响应型基因载体传递体系的聚阳离子与药物的质量比为(2～10)∶1，更优选为(2.5～8)∶1，最优选为(3～7)∶1，最优选为(4～6)∶1，最优选为(5～5.5)∶1。
本发明提供了一种智能响应型基因载体传递体系及其制备方法和应用，本发明提供的智能响应型基因载体传递体系包括内核以及包覆在内核上的外壳；其中，通过选择所述外壳为缩硫酮改性的葡聚糖；且使所述缩硫酮改性的葡聚糖中缩硫酮与葡聚糖的摩尔比为(1～1200)∶1；所述内核为聚阳离子；使得本发明提供的基因载体传递体系具有较低的细胞毒性以及优异的h2o2响应性，且在肿瘤部位具有高效的转染效率，构建的基因载体传递体系介导治疗基因具有显著的抗肿瘤效果。即本发明提供的基因载体传递体系在基因治疗抗肿瘤领域有着广阔的应用前景。
下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、dsdpa-dex的合成
以分子量20000的dex为例，将无水巯基丙酸和无水丙酮混合物用干燥的氯化氢充满，在室温下进行反应，反应完毕后在冰盐混合物条件下冷却直至结晶完全。将得到的晶体过滤，用正己烷和冰水洗涤，将所获得的产物进行冻干，得到dsdpa。
然后在加入c8h17n3·hcl和dmap条件下，根据表1中dsdpa与dex的摩尔比分别进行混合，得到不同比例的dsdpa与dex得到混合物，将上述混合物分别溶于dmso溶液中，进行反应。然后将反应后的混合物用去离子水透析。最后将透析后的产物冻干，得到缩硫酮改性的葡聚糖(dsdpa-dex)。
表1为基因载体传递体系的外壳dsdpa-dex对应的投料比
其中，我们通过在分子量20000的dex上接枝不同数目的dsdpa，按照表1给出的投料比，dsdpa-dex-1、dsdpa-dex-2、dsdpa-dex-3和dsdpa-dex-4表示接枝dsdpa的个数分别为30，60，90，120。
2、将dsdpa-dex作为基因载体体系的遮蔽层，聚阳离子基因载体作为内核，以pll-rt(其组成见表2，表2为在分子量20000的pll上接枝不同数目的对甲基苯磺酰基精氨酸的结果)为例，作为dna的基因载体传递体系，运用于多种肿瘤细胞系(例如，4t1，mcf-7，hela，b16f10，ct26，skbr3，a549，hepg-2，huh-7等)。
表2为合成基因载体传递体系的内核pll-rt对应的投料比
其中，按照如表2的不同投料比，pll20k-rt1、pll20k-rt-2、pll20k-rt-3和pll20k-rt-4表示接枝rt的个数分别为30，60，90，120，150。
3、dsdpa-dex/pll-rt作为绿色荧光蛋白质粒(pegfpn1)和荧光素酶质粒(pgl3)载体的用法
步骤和条件如下：
(1)细胞培养
在含胎牛血清体积分数10％的培养液中培养细胞，将细胞培养箱的温度设定为37℃、二氧化碳的体积分数设定为5％，进行恒温培养。
(2)细胞转染
取对数生长期的细胞，胰酶消化后用含胎牛血清体积分数10％的培养液进行稀释，按照每孔1×104细胞在96孔细胞培养板中铺板，置于培养温度为37℃、含co2体积分数5％的恒温培养箱中培养，直至细胞汇合度达80～90％。在进行转染实验时，将pll-rt/pdna复合20min后，然后将dsdpa-dex加入其中再复合20min。按照0.2μgpdna/孔加入到96孔细胞板中，继续培养48h。对于需要h2o2作用的实验组，在加入dsdpa-dex之前，将h2o2加入到dsdpa-dex溶液中，使得加入后h2o2在溶液中物质的量浓度是100um，进行反应12h，然后将处理后的dsdpa-dex加入pll-rt/pdna中进行转染。
(3)细胞转染效率的测定
a)荧光素酶活性检测
在细胞培养箱中培养48h后，将细胞培养板取出，吸出细胞培养液，用pbs洗涤2次，每孔加入50ul细胞裂解液，放入-80℃冰箱中30min。然后根据在每孔中加入等量的荧光素酶底物，通过光度计定量检测转染效率，结果见表3。
表3为构建的基因载体传递体系介导荧光素酶质粒的体外转染效率
从表中可以看出，我们通过测定了构建的基因载体体系在4t1细胞中的荧光素酶质粒的转染效率，发现在pll20k-rt1，pll20k-rt2，pll20k-rt3，pll20k-rt4以及pll20k-rt5中，pll20k-rt2/pdna在质量比2.5/1时获得最佳的转染效率。于是我们选择pll20k-rt2作为内核，dsdpa-dex-1，dsdpa-dex-2，dsdpa-dex-3，dsdpa-dex-4分别作为外壳，测定在4t1细胞中的转染效率。我们发现dsdpa-dex-2作为外壳时表现出最高的转染效率，且在h2o2作用下，外壳层脱离，转染效率显著提高。
b)绿色荧光蛋白(gfp)的表达
在恒温细胞培养箱中培养48h后，取出细胞培养板，将其置于荧光显微镜下观察细胞表达的绿色荧光蛋白信号。产生绿色荧光信号的细胞为发生转染的阳性细胞，而不产生绿色荧光信号的细胞为不发生转染的阴性细胞。可以用流式细胞仪(flowcytometry)检测发生转染的阳性细胞所占的百分比，结果见表4。
表4为构建的基因载体传递体系介导绿色荧光蛋白质粒的体外转染效率
从表4可以看出，我们通过测定构建的基因载体体系在4t1细胞中的绿色荧光蛋白质粒的体外转染效率，发现在pll20k-rt1，pll20k-rt2，pll20k-rt3，pll20k-rt4以及pll20k-rt5中，pll20k-rt2/pdna在质量比2.5/1时获得最佳的转染效率。于是我们选择pll20k-rt2作为内核，dsdpa-dex-1，dsdpa-dex-2，dsdpa-dex-3，dsdpa-dex-4分别作为外壳，测定在4t1细胞中的转柒效率。我们发现dsdpa-dex-2作为外壳时表现出最高的转染效率，且在h2o2作用下，外壳层脱离，转染效率显著提高。
(4)细胞毒性的测定(mtt)
采用噻唑蓝比色法进行基因载体传递体系的生物相容性评价。取对数生长期的细胞，在胰酶消化后用含胎牛血清体积分数10％的培养液进行稀释，按照每孔1×104细胞在96孔细胞培养板中进行铺板。将其置于培养温度为37℃，含co2体积分数5％的恒温培养箱中进行培养直至细胞汇合度达80～90％。将不同质量比的载体/pdna复合物加入到96孔细胞培养板的细胞中进行培养48h，然后每孔中加入20μl质量分数为5％的噻唑蓝溶液，在37℃恒温下培养4h，吸出培养液，然后每孔加入200μldmso，运用酶标仪检测吸收值，选用波长为490nm。按照如下公式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(asample/acontrol)×100
asample是材料组样品孔的吸收，acontrol是不加材料的对照孔的吸收，每组实验重复三次，计算存活率(见表5)；
表5为构建的基因载体传递体系介导pdna的细胞存活率
从表中可以看出，通过测定构建的基因载体担载pdna在4t1细胞中的细胞毒性。我们发现pll20k-rt2/dna在最佳转染效率时具有可以忽略的细胞毒性。另外dsdpa-dex-2/pll20k-rt-2/dna在最佳转染效率时，在有无h2o2条件下均呈现出可以忽略的细胞毒性。
4.将dsdpa-dex作为基因载体体系的遮蔽层，聚阳离子基因载体作为内核，以pll-rt为例，作为rna的基因载体传递体系，运用于目前各种细胞系(例如，4t1，mcf-7，hela，b16f10，ct26，skbr3，a549，hepg-2，huh-7等)，步骤和相关条件如下所示：
(1)通过常规方法我们合成sirna，该sirna的序列为5’-cuuacgcugaguacuucgadtdt-3’，其能够沉默荧光素酶。
(2)细胞的培养
将细胞置于含胎牛血清体积分数10％的培养液中，在培养温度37℃下体积分数为5％的co2的恒温箱中连续培养。
(3)细胞转染
在转染前24h，取对数生长期的细胞，在胰酶消化后用含体积分数10％的胎牛血清培养液进行稀释，按照1×104细胞/孔的密度铺板于96孔细胞培养板中，置于培养温度为37℃、含co2体积分数5％的的恒温培养箱中培养直至细胞汇合度达80～90％。转染时，将pll-rt/sirna复合物复合20min后，然后将dsdpa-dex加入复合物20min，按照o.2μgsirna/孔加入到96孔细胞板中，继续培养48h。对于需要h2o2作用的实验组，在加入dsdpa-dex之前，将h2o2加入到dsdpa-dex溶液中，使得加入后h2o2在溶液中物质的量浓度是100um，进行反应12h，然后将处理后的dsdpa-dex加入pll-rt/sirna中进行转染。
(4)细胞转染效率的测定
从恒温培养箱中取出细胞培养板，吸出细胞培养液，用pbs洗涤2次，每孔加入50μl细胞裂解液放入-80℃冰箱中裂解20min，然后将细胞培养板拿出放置在室温下，待裂解液融化后，每孔加入等量的荧光素酶底物，通过光度计定量测定细胞转染效率见表6。
表6为构建的基因载体传递体系介导沉默荧光素酶的基因sirna体外沉默效率
从表6可以看出，我们通过测定构建的基因载体体系在恒表达荧光素酶的4t1-luc细胞中介导沉默荧光素酶基因sirna的沉默效率，发现在pll20k-rt1，pll20k-rt2，pll20k-rt3，pll20k-rt4以及pll20k-rt5中，pll20k-rt2/pdna在质量比2.5/1时获得最佳的沉默效率。于是我们选择pll20k-rt2作为内核，dsdpa-dex-1，dsdpa-dex-2，dsdpa-dex-3，dsdpa-dex-4分别作为外壳，测定在恒表达荧光素酶的4t1luc细胞中介导沉默荧光素酶基因sirna的沉默效率。我们发现dsdpa-dex-2作为外壳时表现出最高的沉默效率，且在h2o2作用下，外壳层脱离，沉默效率显著提高。
(5)细胞毒性的测定(mtt)
采用噻唑蓝比色法进行基因载体传递体系的生物相容性评价。取对数生长期的细胞，在胰酶消化后用含胎牛血清体积分数10％的培养液进行稀释，按照每孔1×104细胞在96孔细胞培养板中进行铺板。将其置于培养温度为37℃，含co2体积分数5％的恒温培养箱中进行培养直至细胞汇合度达80～90％。将不同质量比的载体/sirna复合物加入到96孔细胞培养板的细胞中进行培养48h，然后每孔中加入20μl质量分数为5％的噻唑蓝溶液，在37℃恒温下培养4h，吸出培养液，然后每孔加入200μldmso，运用酶标仪检测吸收值，选用波长为490nm。按照如下公式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(asample/acontrol)×100
asample是材料组样品孔的吸收，acontrol是不加材料的对照孔的吸收，每组实验重复三次，计算存活率见表7。
表7为构建的基因载体传递体系介导sirna复合物的细胞存活率
从表中可以看出，我们通过测定构建的基因载体担载sirna在4t1-luc细胞中的细胞毒性，发现pll20k-rt2/dna在最佳转染效率时具有可以忽略的细胞毒性。另外dsdpa-dex-2/pll20k-rt-2/dna在最佳转染效率时，在有无h2o2条件下均呈现出可以忽略的细胞毒性。
5.本发明构建基因载体传递体系介导pdna在体内的应用，通过如下方式实现：
(1)4t1细胞的培养
将4t1细胞置于含胎牛血清体积分数10％的培养液中，在含co2体积分数5％、培养温度为37℃的恒温箱中培养。
(2)肿瘤接种
购买周龄5-6周的体重20g左右的balb/c小鼠，在肿瘤接种前，取对数生长期的4t1细胞经胰酶消化，然后加入细胞培养液进行稀释，1×103rpm离心5min，pbs洗涤三次，然后用pbs悬浮细胞。按照每只小鼠3×106细胞接种于小鼠腋下。待荷瘤小鼠的肿瘤平均体积达到200mm3时，进行pdna体内的转染实验。
(3)体内转染
将表达荧光素酶的pdna作为体内转染基因，按照每只小鼠的pdna用量20μg，将载体/pdna复合物的生理盐水溶液200μl尾静脉注射小鼠体内，转染48h。
(4)体内转染效率效率的测定
在进行48h的体内转染后，处死babl/c小鼠，取出各组肿瘤，pbs洗涤2次，运用组织裂解液进行裂解，匀浆，然后加入荧光素酶底物，测定转染效率，结果见表8。
表8为构建的基因载体传递体系介导荧光素酶质粒在体内的转染
从表中可以看出，我们通过将构建的基因载体担载荧光素酶质粒进行尾静脉注射到荷4t1瘤小鼠中，48h后检测肿瘤组织中荧光素酶的表达。发现在pll20k-rt1，pll20k-rt2，pll20k-rt3，pll20k-rt4以及pll20k-rt5中，pll20k-rt2/pdna在质量比2.5/1在肿瘤组织中获得最佳的转染效率。于是我们选择pll20k-rt2作为内核，dsdpa-dex-1，dsdpa-dex-2，dsdpa-dex-3，dsdpa-dex-4分别作为外壳，进行尾静脉注射到荷4t1瘤小鼠中。我们发现48h后dsdpa-dex-2作为外壳时在肿瘤组织表现出最高的转染效率，这是因为dsdpa-dex-2作为遮蔽层，在尾静脉注射后能够通过血液循环到达肿瘤组织，且由于肿瘤组织h2o2含量高，能够促进遮蔽层的脱离，有利于肿瘤细胞内吞，转染效率获得显著地提高。
6.本发明构建基因载体传递体系在体内sirna转染中的应用，通过如下方式实现：
(1)4t1细胞的培养
将4t1细胞置于含胎牛血清10％的培养液中，在含体积分数为5％的co2、温度为37℃的恒温培养箱中培养。
(2)肿瘤接种
购买周龄5-6周的体重20g左右的babl/c小鼠，肿瘤接种前，取对数生长期的4t1细胞，用胰蛋白酶消化，然后用细胞培养液混合胰蛋白酶，1×103rpm离心5min，pbs洗涤3次，用pbs悬浮细胞。按照每只小鼠3×106细胞接种于小鼠腋下。待荷瘤小鼠的肿瘤平均体积达到100mm3时，进行sirna的体内治疗。
(3)体内治疗
基因选用shvegf质粒，按照每只小鼠的shvegf用量20ug，载体/shvegf复合物的生理盐水溶液体积200μl尾静脉注射小鼠体内，每隔一天给一次药，给药14天。
(4)小鼠肿瘤生长的测定
在小鼠第一次给药开始，每天测量小鼠肿瘤大小以及体重的变化。表9给出了对荷瘤小鼠进行治疗14天后肿瘤的体积。
表9为构建的基因载体传递体系介导shvegf治疗后的肿瘤大小
从表9可以看出，我们通过将构建的基因载体担载治疗基因shvegf进行尾静脉注射到荷4t1瘤小鼠中，每隔1天给一次药，总共给药6次，观察肿瘤生长情况，发现pll20k作为内核，dsdpa-dex-2作为外壳介导治疗基因shvegf，能够显著地抑制肿瘤的生长，表现出最佳的抗肿瘤效果。这是因为dsdpa-dex-2作为遮蔽层，在尾静脉注射后能够通过血液循环到达肿瘤组织，且由于肿瘤组织h2o2含量高，能够促进遮蔽层的脱离，有利于肿瘤细胞的内吞，具有显著的抗肿瘤效果。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。