牛磺酸鼻喷剂、其制备方法及应用与流程

本发明涉及一种牛磺酸鼻喷剂、其制备方法及应用。
背景技术：
：变应性鼻炎(ar)也称过敏性鼻炎，是免疫球蛋白e(ige)介导的鼻粘膜的i型变态反应性疾病，也是全身变态反应影响局部靶器官的一个典型，以鼻痒、喷嚏、鼻分泌亢进、鼻粘膜肿胀等为主要特点。ar能够影响各年龄段的个体，在儿童和青少年中尤其多发。ar不仅损害患者的生活质量，还会诱发多种疾病，例如过敏性眼结膜炎、鼻窦炎、鼻息肉、渗出性中耳炎、支气管哮喘等。因此，有效地治疗ar具有积极的临床意义。目前，关于ar的治疗主要分为以下几类：避免接触变应原，免疫治疗，药物治疗以及外科治疗。其中，临床上用于治疗ar的药物主要包括抗组胺药、糖皮质激素、抗白三烯药、减充血剂、抗胆碱药和肥大细胞膜稳定剂等，其中，抗组胺药(鼻用或口服)和鼻用糖皮质激素为治疗ar的一线药物。然而，目前使用的鼻喷剂多为液体，在鼻腔内的停留时间短，局部的药物浓度降低快速，使得药物与鼻黏膜不能充分接触，药效降低；并且在使用过程中，会有大量的药液流入咽喉部，引起不适感。全身皮质激素的长期使用可致皮肤变薄、骨质疏松症和库欣氏综合征等副反应的发生，虽然鼻内用皮质激素为局部用药，仍不宜长期使用。减充血剂的使用时间一般不得超过10天以避免发生药物性鼻炎，还具有其他副作用，例如头晕、头痛、震颤和失眠等。因此，仍然需要开发新的安全有效的变应性鼻炎的治疗药物。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于克服现有的鼻喷剂在鼻腔内的停留时间短、药物与鼻黏膜接触不充分、副作用大等缺陷，而提供了一种牛磺酸鼻喷剂、其制备方法及应用。本发明首次将牛磺酸应用到鼻喷剂中，在发挥治疗作用的同时能减小对人体的毒副作用，同时，鼻喷剂中使用的温敏原位凝胶在鼻腔内以凝胶状态存在，使得药物和鼻黏膜接触更充分，延长滞留时间，更好地发挥药效。本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。本发明提供了一种牛磺酸鼻喷剂，按质量百分比计，其包含以下组分：1％-7％牛磺酸、15％-40％温敏原位凝胶材料和水；其中，所述的百分比为占所述的牛磺酸鼻喷剂的质量百分比。本发明中，所述的牛磺酸占所述的牛磺酸鼻喷剂的质量百分比为1％-7％，例如1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％，优选4％-6％，例如5％。本发明中，所述的温敏原位凝胶材料占所述的牛磺酸鼻喷剂的质量百分比为15-40％，例如15％、18％、20％、23％、25％、30％、36％或40％，优选15-25％，例如20％。本发明中，所述的温敏原位凝胶材料可为本领域常规的温敏原位凝胶材料，一般在室温及储存状态下为自由流动的液体状态，鼻腔给药后在鼻腔环境作用下形成半固体或固体状态的凝胶，优选自卡波姆910、卡波姆934、卡波姆940、卡波姆1342、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、海藻酸钠和壳聚糖中的一种或多种，更优选泊洛沙姆407和/或泊洛沙姆188。本发明中，当所述的温敏原位凝胶材料为泊洛沙姆407和泊洛沙姆188时，所述的泊洛沙姆407和泊洛沙姆188的质量比优选1:1-10:1，更优选1:1-5:1，例如3:1。本发明中，当所述的温敏原位凝胶材料为泊洛沙姆407和泊洛沙姆188时，所述的泊洛沙姆407占所述的牛磺酸鼻喷剂的质量百分比优选10％-30％，例如10％、15％、20％、25％或30％，更优选15％-30％。本发明中，当所述的温敏原位凝胶材料为泊洛沙姆407和泊洛沙姆188时，所述的泊洛沙姆188占所述的牛磺酸鼻喷剂的质量百分比优选2％-10％，例如2％、5％或10％，更优选5％-10％。本发明中，所述的温敏原位凝胶材料的凝胶化的温度为30-35℃(例如32℃)。本发明中，所述的水可为本领域常规的水，例如蒸馏水、纯化水或去离子水等；所述的水占所述的牛磺酸鼻喷剂的质量百分比优选50％-85％，更优选54％-80％，例如54％、55％、55.98％、57％、66％、67.48％、73％、74％、75％、77％、79％或80％。本发明中，所述的牛磺酸鼻喷剂还可包括药剂学上可接受的药用辅料，所述的药用辅料包括防腐剂、表面活性剂、渗透压调节剂中的一种或多种。所述的防腐剂可为本领域常规的防腐剂，选自苯甲酸、山梨酸、桉叶油、紫苏油、聚维酮碘、醋酸氯己定、苯扎溴铵、苄索溴铵、苯氧基乙醇、布罗多尔、三氯新、己内酰脲、咪唑烷基脲、尼泊金甲酯、尼泊金乙酯和尼泊金丙酯。所述防腐剂占所述的牛磺酸鼻喷剂的质量百分比可为本领域常规的质量百分比，例如0.008％-0.05％，又例如0.02％。所述的表面活性剂可为本领域常规的表面活性剂，选自聚山梨酯80和司盘80。所述表面活性剂占所述的牛磺酸鼻喷剂的质量百分比可为本领域常规的质量百分比，例如0.1％-0.7％。所述的渗透压调节剂可为本领域常规的渗透压调节剂，选自葡萄糖和氯化钠。所述的渗透压调节剂占所述的牛磺酸鼻喷剂的质量百分比可为本领域常规的质量百分比，例如1％-4％，又例如1.5％。本发明一优选实施方案中，按质量百分比计，所述的牛磺酸鼻喷剂由以下组分组成：1％-7％牛磺酸，15％-40％温敏原位凝胶材料，余量为水。本发明还提供了一种牛磺酸鼻喷剂的制备方法，其包括以下步骤：按照上述的配方，将各组分混合均匀，即可。本发明某一实施方案中，所述的制备方法包括以下步骤：将温敏原位凝胶材料加热溶解或溶胀于水中形成凝胶溶液，再加入牛磺酸混合均匀，即可；当含有药用辅料时，所述的药用辅料先于温敏原位凝胶材料溶于水中。所述加热的温度优选85-90℃，所述溶胀的温度优选2-6℃(例如4℃)。本发明还提供了上述的牛磺酸鼻喷剂在制备治疗变应性鼻炎药物中的应用。在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：本发明首次将牛磺酸应用到鼻喷剂中，配合温敏原位凝胶材料，使得药物在鼻腔内的滞留时间延长，对变应性鼻炎表现出良好的治疗效果，且毒副作用小，安全性高。附图说明图1为各组小鼠的行为评估结果。图2为苏木精和曙红染色的对照组小鼠的鼻粘膜组织的石蜡切片。图3为苏木精和曙红染色的变应性鼻炎组小鼠的鼻粘膜组织的石蜡切片。图4为苏木精和曙红染色的1％牛磺酸鼻喷剂组小鼠的鼻粘膜组织的石蜡切片。图5为苏木精和曙红染色的3％牛磺酸鼻喷剂组小鼠的鼻粘膜组织的石蜡切片。图6为苏木精和曙红染色的5％牛磺酸鼻喷剂组小鼠的鼻粘膜组织的石蜡切片。图7为甲苯胺蓝o染色的对照组小鼠的鼻粘膜组织的石蜡切片。图8为甲苯胺蓝o染色的变应性鼻炎组小鼠的鼻粘膜组织的石蜡切片。图9为甲苯胺蓝o染色的1％牛磺酸鼻喷剂组小鼠的鼻粘膜组织的石蜡切片。图10为甲苯胺蓝o染色的3％牛磺酸鼻喷剂组小鼠的鼻粘膜组织的石蜡切片。图11为甲苯胺蓝o染色的5％牛磺酸鼻喷剂组小鼠的鼻粘膜组织的石蜡切片。图12为各组对sod3表达水平的影响。图13为各组对tnf-α表达水平的影响。图14为各组对ifn-γ表达水平的影响。图15为各组对il-4表达水平的影响。图16为各组对il-6表达水平的影响。图17为westernblot法中各组对sod3、ppar-γ、p-erk1/2、erk1/2和gapdh表达水平的影响。图18为westernblot法中各组对sod3蛋白表达水平的影响。图19为westernblot法中各组对ppar-γ蛋白表达水平的影响。图20为westernblot法中各组对p-erk1/2和erk1/2表达水平比例的影响。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例1配方及制备方法：组分质量百分数牛磺酸5％卡波姆91020％水75％制备方法：称取处方量的卡波姆910，加入处方量的蒸馏水，在85℃水浴中加热完全溶解成温敏原位凝胶材料的水溶液，将处方量的牛磺酸加入到上述的水溶液中充分搅拌混匀，即得。实施例2配方及制备方法：组分质量百分数牛磺酸1％泊洛沙姆40725％水74％制备方法：称取处方量的泊洛沙姆407，加入处方量的蒸馏水，在85℃水浴中加热完全溶解成温敏原位凝胶材料的水溶液，将处方量的牛磺酸加入到上述的水溶液中充分搅拌混匀，即得。实施例3配方及制备方法：组分质量百分数牛磺酸4％卡波姆134230％水66％制备方法：称取处方量的卡波姆1342，加入处方量的蒸馏水，在90℃水浴中加热完全溶解成温敏原位凝胶材料的水溶液，将处方量的牛磺酸加入到上述的水溶液中充分搅拌混匀，即得。实施例4配方及制备方法：组分质量百分数牛磺酸7％海藻酸钠36％水57％制备方法：称取处方量的海藻酸钠，加入处方量的蒸馏水磁力搅拌后，放置于4℃的冰箱中，冷藏6-12小时，使其充分溶胀形成均匀澄明的凝胶溶液，将处方量的牛磺酸加入到上述的水溶液中充分搅拌混匀，即得。实施例5配方及制备方法：组分质量百分数牛磺酸6％壳聚糖40％水54％制备方法：称取处方量的壳聚糖，加入处方量的蒸馏水磁力搅拌后，放置于4℃的冰箱中，冷藏6-12小时，使其充分溶胀形成均匀澄明的凝胶溶液，将处方量的牛磺酸加入到上述的水溶液中充分搅拌混匀，即得。实施例6配方及制备方法：组分质量百分数牛磺酸5％泊洛沙姆18815％水80％制备方法：称取处方量的泊洛沙姆188，加入处方量的蒸馏水磁力搅拌后，放置于4℃的冰箱中，冷藏6-12小时，使其充分溶胀形成均匀澄明的凝胶溶液，将处方量的牛磺酸加入到上述的水溶液中充分搅拌混匀，即得。实施例7组分质量百分数牛磺酸3％泊洛沙姆18820％水77％称取处方量的泊洛沙姆188，加入处方量的蒸馏水磁力搅拌后，放置于4℃的冰箱中，冷藏6-12小时，使其充分溶胀形成均匀澄明的凝胶溶液，将处方量的牛磺酸加入到上述的水溶液中充分搅拌混匀，即得。实施例8配方及制备方法：制备方法：称取处方量的泊洛沙姆188和泊洛沙姆407，加入处方量的蒸馏水磁力搅拌后，放置于4℃的冰箱中，冷藏6-12小时，使其充分溶胀形成均匀澄明的凝胶溶液，将处方量的牛磺酸加入到上述的水溶液中充分搅拌混匀，即得。实施例9除了牛磺酸和水的质量百分比不同，其余配方和制备方法均同实施例8；其中，牛磺酸的质量百分比为1％，水的质量百分比为79％。实施例10除了牛磺酸的质量百分比不同，其余配方和制备方法均同实施例8；其中，牛磺酸的质量百分比为3％，水的质量百分比为77％。实施例11配方及制备方法：组分质量百分数牛磺酸5％泊洛沙姆1882％泊洛沙姆40720％水73％制备方法：称取处方量的泊洛沙姆188和泊洛沙姆407，加入处方量的蒸馏水磁力搅拌后，放置于4℃的冰箱中，冷藏6-12小时，使其充分溶胀形成均匀澄明的凝胶溶液，将处方量的牛磺酸加入到上述的水溶液中充分搅拌混匀，即得。实施例12配方及制备方法：组分质量百分数牛磺酸5％泊洛沙姆18810％泊洛沙姆40730％水55％制备方法：称取处方量的泊洛沙姆188和泊洛沙姆407，加入处方量的蒸馏水磁力搅拌后，放置于4℃的冰箱中，冷藏6-12小时，使其充分溶胀形成均匀澄明的凝胶溶液，将处方量的牛磺酸加入到上述的水溶液中充分搅拌混匀，即得。实施例13配方及制备方法：组分质量百分数牛磺酸4％泊洛沙姆18810％泊洛沙姆40730％苯甲酸0.02％水55.98％制备方法：称取处方量的苯甲酸溶于处方量的蒸馏水中，再加入处方量的泊洛沙姆188和泊洛沙姆407，磁力搅拌后，放置于4℃的冰箱中，冷藏6-12小时，使其充分溶胀形成均匀澄明的凝胶溶液，将处方量的牛磺酸加入到上述的水溶液中充分搅拌混匀，即得。实施例14制备方法：称取处方量的尼泊金丙酯和氯化钠溶于处方量的蒸馏水中，再加入处方量的卡波姆934，磁力搅拌后，放置于4℃的冰箱中，冷藏6-12小时，使其充分溶胀形成均匀澄明的凝胶溶液，将处方量的牛磺酸加入到上述的水溶液中充分搅拌混匀，即得。效果实施例1：牛磺酸鼻喷剂对小鼠变应性鼻炎的治疗效果1.实验动物及分组实验动物：健康6-8周c57bl/6小鼠80只，清洁级动物，雄雌各半，体重17-20g，排除鼻部疾病。饲养条件为：雌雄分开，雌雄各40只再分笼饲养，每笼7-8只，共10笼。实验小鼠每组随机抽取雌雄小鼠7-8只，每组各15只，分为五组：a组：对照组(生理盐水)；b组：变应性鼻炎组(ova致敏+鼻滴生理盐水)；c组：牛磺酸鼻喷剂组(ova致敏+鼻滴1％牛磺酸鼻喷剂)；d组：牛磺酸鼻喷剂组(ova致敏+鼻滴3％牛磺酸鼻喷剂)；e组：牛磺酸鼻喷剂组(ova致敏+鼻滴5％牛磺酸鼻喷剂)。上述1％牛磺酸鼻喷剂、3％牛磺酸鼻喷剂和5％牛磺酸鼻喷剂分别根据实施例9、实施例10和实施例8制备获得。各组小鼠的处理详见下述方法中变应性鼻炎模型的建立及牛磺酸鼻喷剂的干预。2.ova致敏的变应性鼻炎模型的建立在无菌条件下，依据常规实验小鼠的致敏常规，按如下步骤用卵清白蛋白(ova)构建变应性鼻炎小鼠模型。每只小鼠用20pg卵清白蛋白(ova)溶于1ml生理盐水，以lmlal(oh)3为免疫佐剂，腹腔注射qod×8次(每天注射1次，共8天)致敏，第16天予以10％ova10ul滴鼻qd×10次(每天滴鼻1次，共10天)激发。鼻部症状评分：末次激发后，每只动物观察30分钟。记分标准，具体参见表1：1分，喷嚏1-3个；清涕流至前鼻孔；单前肢偶有挠鼻。2分，喷嚏4-10个；清涕超过前鼻孔；双前肢挠鼻。3分，喷嚏10个以上；清涕流至面部；不停到处擦鼻。3个症状叠加量化记分，5分或5分以上为造模成功。表1症状评分记分标准表症状积分喷嚏(一次连续几个)清涕鼻痒1分1-3流至前鼻孔单前肢偶有挠鼻2分4-10超过前鼻孔双前肢挠鼻3分≥11超过前鼻孔到处擦磨经变应性鼻炎的评分标准评定，成功建立ova致敏的变应性鼻炎小鼠模型，之后从ova致敏小鼠中提取血液和组织标本。3.实施牛磺酸鼻喷剂干预治疗建立ova致敏的小鼠模型后，鼻滴牛磺酸鼻喷剂实施干预治疗。a组和b组小鼠鼻滴生理盐水；c组小鼠鼻滴1％牛磺酸鼻喷剂；d组小鼠鼻滴3％牛磺酸鼻喷剂；e组小鼠鼻滴5％牛磺酸鼻喷剂；以上每天鼻滴两次，每次两喷。鼻滴3天之后，将c组、d组和e组与b组作比较，观察牛磺酸鼻喷剂对ova致敏的治疗影响。4.行为评估牛磺酸鼻喷剂干预治疗3天后，对小鼠的行为进行打分，每组小鼠的平均打分结果如下表1和图1(p<0.01)所示：表1打分结果5.鼻粘膜标本取材牛磺酸鼻喷剂干预治疗3天后，给所有小鼠腹腔注射1％鲁米那0.3ml实施麻醉，与硬腭垂直方向剪开鼻正中缝，取出鼻中隔和双侧鼻腔外侧壁，注意勿损伤鼻粘膜。投入液氮罐速冻2h，抽提总rna前存于一80℃冰箱内。6.组织病理学评估将鼻粘膜组织在10％多聚甲醛中固定48小时，用去离子水洗涤并包埋在石蜡中。随后用苏木精和曙红染色组织切片(4-7μm厚)以显现嗜酸性粒细胞。观察嗜酸性粒细胞的形态，计算嗜酸性粒细胞的数量。甲苯胺蓝o染色用于观察和计数鼻粘膜组织中的肥大细胞。结果如图2～图11所示。其中，图2为对照组小鼠的鼻粘膜组织的石蜡切片，粘膜组织结构完整，未见或偶见嗜酸性粒细胞；图3为变应性鼻炎组小鼠的鼻粘膜组织的石蜡切片，可见血管扩张，腺体增生，组织水肿，且有大量的嗜酸性粒细胞；图4为1％牛磺酸鼻喷剂组小鼠的鼻粘膜组织的石蜡切片，粘膜组织结构相对完整，嗜酸性粒细胞较变应性鼻炎组减少；图5为3％牛磺酸鼻喷剂组小鼠的鼻粘膜组织的石蜡切片，有少量嗜酸性粒细胞；图6为5％牛磺酸鼻喷剂组小鼠的鼻粘膜组织的石蜡切片，粘膜组织结构完整，未见或偶见嗜酸性粒细胞。图2～图6表明，当使用含牛磺酸的鼻喷剂作用于变应性鼻炎时，随着牛磺酸浓度的增加，嗜酸性粒细胞的数量明显减少，当牛磺酸的浓度为5％时，鼻粘膜组织的形态与对照组相当。以上表明，牛磺酸鼻喷剂对变应性鼻炎有很好的治疗作用。从图2-图11可以看出，牛磺酸的干预可剂量依赖性地治疗减轻了粘膜上皮细胞的损伤，表皮细胞的分离和炎症细胞的浸润。7.观察粘膜中sod3、tnf-α、ifn-γ、il-4、il-6的表达使用酶联免疫吸附测定(elisa)试剂盒测量血清sod和细胞因子水平，其操作参照制造商提供的说明书。使用比色酶标仪测量450nm处的吸光度，并基于标准曲线计算sod3、tnf-α、ifn-γ、il-4、il-6的浓度。从图12～图16(p<0.01)可以看出，变应性鼻炎组与对照组相比，sod3和ifn-γ的表达水平明显降低，炎症因子tnf-α、il-4和il-6的表达水平则明显升高。牛磺酸鼻喷剂可以剂量依赖性地显著增加sod3和ifn-γ的表达，以及剂量依赖性地显著降低tnf-α、il-4和il-6的表达，从而达到很好的治疗变应性鼻炎的效果。8.western-blot观察粘膜中sod3、ppar-γ、p-erk1/2、erk1/2和gapdh的表达将鼻组织均质化，并通过洗涤剂裂解程序制备总蛋白质。通过10％sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品(25μg等分试样)并电转移至硝酸纤维素膜。将膜用5％牛血清白蛋白在室温下封闭1小时或在4℃下封闭过夜。然后将膜与一抗erk1/2(1：1000)，p-erk1/2(1：1000)，sod3(1：500)，ppar-γ(1：1000)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(gapdh)(1：2000)在室温孵育2小时或4℃孵育过夜。用tbst洗涤膜并通过hrp缀合的二抗显色。通过增强的化学发光程序使蛋白质可视化。结果如图17～图20(p<0.01)所示，从图中可以看出，与对照组相比，变应性鼻炎组的sod3、ppar-γ蛋白的表达水平显著降低，p-erk1/2蛋白的表达水平明显升高。而牛磺酸鼻喷剂可以剂量依赖性地显著增强sod3、ppar-γ蛋白的表达，并且显著降低p-erk1/2蛋白的表达，尤其是5％的牛磺酸鼻喷剂，给药后的蛋白质的表达水平几乎恢复到了对照组的水平。当前第1页12