胆固醇在甲状腺功能减退中的用途的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体说是胆固醇在引发甲状腺功能减退中的用途。
背景技术：
：胆固醇是哺乳动物组织细胞中不可缺少的重要物质，它不仅参与细胞膜的形成，而且是机体合成维生素d、甾体激素及胆汁酸的原料。随着人们生活方式的转变，高胆固醇血症的患病率逐年增高，据统计，在我国≥20岁人群中，高胆固醇血症的患病率为9.0％，临界性高胆固醇血症的患病率为22.5％。胆固醇超载与疾病的关系已引起国内外广泛关注。大量研究表明胆固醇可损伤胰岛β细胞、肝细胞、血管平滑肌细胞及海马细胞功能，在糖尿病、脂肪肝、动脉粥样硬化性疾病及阿尔茨海默症等疾病发病中发挥作用。近年来，我国甲状腺疾病的患病率显著增高，2010年中国首次10城市居民甲状腺疾病流行病学调查结果显示：我国甲状腺功能亢进症的患病率为3.7％，甲状腺功能减退症的患病率达6.5％。甲状腺疾病已日益成为威胁中国居民健康的杀手。作为合成和分泌甲状腺激素的内分泌器官，甲状腺在中枢神经系统、长骨、心血管系统的生长发育及维持机体的新陈代谢方面发挥着重要作用。甲状腺激素是一类含碘的酪氨酸衍生物，其合成主要是在甲状腺细胞钠碘转运体(sodiumiodidesymporter,nis)、甲状腺过氧化物酶(thyroidperoxidase,tpo)、甲状腺球蛋白(thyroglobulin,tg)等分子的参与下完成的。钠碘转运体(nis)是位于甲状腺滤泡上皮细胞基底外侧膜的跨膜蛋白，主要作用是转运碘离子进入滤泡上皮细胞，即细胞富集碘。nis所介导的摄碘是甲状腺激素合成的首要条件。甲状腺过氧化物酶(tpo)是甲状腺激素合成过程中的关键酶，位于甲状腺滤泡上皮细胞顶端膜侧，在碘的活化、甲状腺球蛋白酪氨酸残基的碘化以及碘化酪氨酸的耦联中发挥催化作用。甲状腺球蛋白(tg)是由甲状腺滤泡上皮细胞特异性合成的一种高度糖基化的大分子分泌蛋白，碘与tg上的酪氨酸残基结合形成碘化酪氨酸，其主要作用是为甲状腺素的合成提供前体物质，且是甲状腺激素的储存形式。因此任何一种分子的表达或活性发生改变，都必然会影响甲状腺激素的合成。内质网(endoplasmicreticulum，er)是广泛存在于真核细胞中的一种重要的细胞器，负责分泌蛋白和跨膜蛋白的合成、折叠、组装和运输。在外部因素过度刺激作用下，内质网生理功能发生紊乱，使未折叠及错误折叠的蛋白质增多并在内质网腔内堆积，造成内质网应激(endoplasmicreticulumstress，erstress)。内质网分子伴侣与内质网内新生肽结合，帮助其正确的折叠和转运，其中免疫重链结合蛋白bip(bindingimmunoglobulinprotein)是最重要、最有代表性的分子伴侣之一。生理状态下，bip与其下游的perk、ire-1和atf6结合；内质网应激时，bip与下游分子解离，表达增加，因此bip常常被认为是内质网应激发生的标志。目前，尚无研究表明，胆固醇在引发甲状腺功能减退中的作用。技术实现要素：针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供胆固醇在引发甲状腺功能减退中的用途。本申请以内质网应激为切入点，分别通过体内(高胆固醇喂养大鼠模型)与体外细胞水平(胆固醇刺激甲状腺细胞及干扰信号等技术)研究，阐明胆固醇对甲状腺细胞功能的影响，识别其主要调控途径和关键分子，为血脂异常伴甲状腺功能异常提供新的治疗思路和策略。一方面，本发明提供了胆固醇在制备引发受试者甲状腺功能减退的产品中的用途。另一方面，本发明提供了胆固醇在制备甲状腺功能减退的动物模型中的应用。在上述应用中，所述动物为哺乳动物。在上述应用中，所述哺乳动物为大鼠或小鼠，优选为大鼠。在上述用途或应用中，所述甲状腺功能减退包括如下1)-6)变化中的至少一种：1)血清总甲状腺素(tt4)降低，2)血清游离甲状腺素(ft4)降低，3)血清促甲状腺激素(tsh)水平升高，4)甲状腺总体积、甲状腺左叶体积、和/或甲状腺右叶体积变大；优选的，所述甲状腺总体积中包括甲状腺左叶体积和甲状腺右叶体积，5)甲状腺滤泡变大，滤泡上皮细胞变矮呈扁平状，胶状液体增加；6)甲状腺对碘的摄取率降低。本发明的有益效果如下：本发明通过研究证明：1、胆固醇过量摄入可影响甲状腺细胞功能，在甲状腺功能减退的发生发展中具有一定作用；2、胆固醇可引起甲状腺细胞内质网应激及内质网应激相关通路——perk/eif2α通路的激活；3、胆固醇可下调甲状腺细胞中nis的表达，至少部分是通过内质网应激起作用的。附图说明图1为光学显微镜下观察的人甲状腺原代细胞形态，其中，a图为培养2-3天的细胞形态，b图为培养5-7天的细胞形态。图2为高胆固醇饮食大鼠体重及血清tc、ldl-c及tg结果。图3为高胆固醇饮食大鼠血清tsh、tt4及ft4结果。图4为高胆固醇饮食大鼠甲状腺形态学检测结果，其中，a图为高频超声扫描图，b图为he染色图，c图为甲状腺外观形态照片。图5为胆固醇对大鼠甲状腺和人甲状腺原代细胞中nis的mrna水平影响，其中，a图为大鼠甲状腺结果，b图为人甲状腺原代细胞结果，chol(μg/ml)代表胆固醇处理浓度。图6为免疫组化检测高胆固醇饮食对大鼠甲状腺nis蛋白水平的影响，其中，a图为甲状腺石蜡包埋切片nis免疫组化的镜检结果，棕黄色为阳性染色。b图为检测a图中阳性染色值的结果，信号值0-255代表阳性染色的强弱。图7为westernblotting检测nis蛋白在胆固醇处理的人甲状腺原代细胞中的表达。图8为免疫荧光方法检测nis蛋白在胆固醇处理的甲状腺细胞中的表达，其中，chol为15μg/ml胆固醇处理72小时后的检测结果。图9为放射性碘131摄取率结果，其中，a图为大鼠甲状腺结果，b图为人甲状腺原代细胞结果，其中，chol为15μg/ml胆固醇处理72小时后的检测结果。图10为不同胆固醇浓度处理后人甲状腺原代细胞内的胆固醇含量检测结果。图11为ezetimibe预处理人甲状腺细胞后细胞总胆固醇filipin荧光染色结果。图12为westernblotting检测ezetimibe预处理对甲状腺细胞nis蛋白表达水平的影响，其中e代表ezetimibe。图13为免疫荧光方法检测nis蛋白在ezetimibe预处理的甲状腺细胞中的表达。图14为高胆固醇饮食大鼠甲状腺内质网应激的透射电镜结果。图15为免疫组化检测高胆固醇饮食对大鼠甲状腺bip蛋白水平的影响。图16a为胆固醇处理的人甲状腺细胞中bip的mrna相对表达水平。图16b为胆固醇处理的人甲状腺细胞中nis和bip蛋白的表达水平。图17为免疫荧光方法同时检测胆固醇处理的人甲状腺细胞中bip和钙联蛋白的表达水平。图18为westernblotting检测胆固醇处理的人甲状腺细胞中内质网应激通路相关蛋白eif2α的磷酸化水平。图19为westernblotting检测胆固醇和/或4-pba处理的人甲状腺细胞中nis和bip蛋白的表达水平。以上图中，*代表两组结果比较后差异显著(p<0.05)，**代表两组结果比较后差异极显著(p<0.01)。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的基础饲料为购自北京科奥协力饲料有限公司的清洁级大小鼠维持饲料。实施例1、动物模型建立雄性sd大鼠40只(6周龄，170-190g/只)，随机分入普通饮食组和高脂饮食组，普通饮食组(nc)给予普通饮食(100％基础饲料，3.49kcal/g)，高脂饮食组(hc)给予高胆固醇饮食(98％基础饲料+2％胆固醇，3.14kcal/g)，各组分别喂养24周。喂养过程中分别于第12、18周经锁骨下静脉穿刺取空腹血，24周处死时留取空腹血和甲状腺组织，用于后续实验。实施例2、胆固醇刺激人甲状腺原代细胞1、取人正常甲状腺组织使用0.25％i型胶原酶及0.125％胰酶消化，筛网过滤后种植于dmem/f12培养液中，于5％co2、37℃条件下培养，每周换液1-2次。图1为光学显微镜下观察的人甲状腺原代细胞形态。经消化分离后，人甲状腺原代细胞大多数聚集成团块状，大约24小时贴壁。刚贴壁的细胞体积小，折光性好，大多数细胞聚集成簇状，细胞呈不规则多角形。其中，a图为培养2-3天的细胞形态，可见贴壁细胞逐渐伸展并相互连接成片，体积逐渐变大，立体感变弱，细胞多为梭形或不规则多角形，部分细胞向细胞团外迁移。b图为培养5-7天的细胞形态，可见细胞逐渐拉长，细胞边缘模糊并逐渐呈融合状态直至铺满培养皿，细胞呈不规则形。2、步骤1的人甲状腺原代细胞融合至80％-90％时，使用饥饿培养基(即血清浓度为0.2％的培养基)饥饿细胞使之同步化，然后用不同浓度(0、5、10、15μg/ml)胆固醇处理相应时间后根据需要进行后续实验。实施例3、长期高胆固醇饮食改变大鼠甲状腺功能和形态对实施例1两组大鼠分别进行如下检测：1、造模过程中每周检测大鼠体重，结果如图2a所示，高胆固醇饮食组(hc)和普通饮食组(nc)组大鼠的体重始终无明显差别。由此可见，高胆固醇摄入并不增加体重。2、使用全自动生化分析仪对喂养12、18、24周大鼠空腹血清总胆固醇(tc)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、甘油三酯(tg)分别进行测定，结果如图2b所示，高胆固醇饮食组大鼠血清tc(3.04±1.06mmol/l)和ldl-c(1.21±0.59mmol/l)分别较普通饮食组的tc(1.64±0.33mmol/l)和ldl-c(0.22±0.63mmol/l)升高了85％和6倍(p＜0.01)。该结果表明，高胆固醇饮食成功诱导了高胆固醇血症大鼠模型。3、喂养12、18、24周时，应用elisa方法分别检测大鼠空腹血的血清总甲状腺素(tt4)、血清游离甲状腺素(ft4)及促甲状腺激素(tsh)水平，结果如图3所示。图3结果表明，在喂养12、18、24周后，hc组大鼠的促甲状腺激素水平均明显高于nc组大鼠，即高胆固醇饮食可以升高大鼠的促甲状腺激素水平；在喂养12、18、24周后，hc组大鼠的血清总甲状腺素水平均有低于nc组大鼠的趋势，但仅在高胆固醇喂养24周后才明显低于nc组大鼠，即高胆固醇饮食可以降低大鼠血清总甲状腺素水平；在喂养12、18、24周后，hc组大鼠的血清游离甲状腺素水平均有低于nc组大鼠的趋势，但仅在高胆固醇喂养18周和24周后才明显低于nc组大鼠，即高胆固醇饮食可以降低大鼠血清游离甲状腺素水平。4、喂养24周后，分别采用高频超声扫描和he染色(苏木精-伊红染色)观察大鼠甲状腺组织结构变化，并在高频超声扫描下测量甲状腺体积，结果如图4和表1所示。表1、高频超声扫描下测量甲状腺体积nchc右叶体积(mm3)105.90±32.64149.01±15.13左叶体积(mm3)103.90±21.111150.68±2.19**甲状腺总体积(mm3)209.70±48.69299.80±15.56*注：表1为采用高频超声扫描甲状腺，并采用卵圆形体积计算公式计算甲状腺体积v＝宽度×深度×长度×π/6，甲状腺峡部未计算入内，表1中的数据为平均值±标准差(sd)，每组5-6个重复，*代表与nc组相应结果相比差异显著(p<0.05)，**代表与nc组结果相比差异极显著(p<0.01)。如图3a所示，普通饮食组大鼠甲状腺实质回声均匀，而高胆固醇饮食组大鼠甲状腺回声减低且不均，且由头尾径、前后径及中间外侧径计算所得的甲状腺左、右体积分别增大45.0％(p＜0.01)和40.7％，甲状腺总体积增大42.9％(p＜0.05)(见表1)。在处死大鼠甲状腺取材时我们通过肉眼大体观察，高胆固醇饮食组大鼠甲状腺较普通饮食组呈对称性、弥漫性增大(见图3c)。这与高频超声多普勒扫描下计算的甲状腺体积结果相一致。图3b的he染色部位为大鼠甲状腺组织，细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色，细胞质和细胞外基质中的成分着红色，结果显示，经高胆固醇饮食24周后，hc组大鼠甲状腺中滤泡明显大于nc组大鼠，具体而言，滤泡上皮细胞变矮呈扁平状，而胶状胶质增多，与甲状腺功能低下的表现相同；综上步骤1-4的结果表明，高胆固醇饮食24周大鼠的血清tc升高，血清tt4、ft4降低，tsh水平升高，且伴随有高频超声扫描下、he染色下的大鼠甲状腺形态学改变。实施例4、胆固醇降低甲状腺钠碘转运体(nis)的转录、表达水平及功能对实施例1两组大鼠的甲状腺和实施例2中不同浓度胆固醇处理的人甲状腺细胞分别进行如下检测：1、采用real-time-pcr(以gapdh为内参)检测大鼠甲状腺中钠碘转运体(nis)、甲状腺球蛋白(tg)、甲状腺过氧化物酶(tpo)、pendrin蛋白(pds)、脱碘酶1(deiodinase1，d1)、双氧化酶2(duox2)和促甲状腺素受体(tshr)以及人甲状腺原代细胞中nis的mrna相对表达水平。结果如图5所示：与普通饮食组相比，大鼠高胆固醇饮食24周后，甲状腺中nis的转录水平明显降低，而甲状腺球蛋白(tg)、甲状腺过氧化物酶(tpo)、pendrin蛋白(pds)、脱碘酶1(deiodinase1，d1)、双氧化酶2(duox2)和促甲状腺素受体(tshr)的转录水平变化不明显(图5a)；与不添加胆固醇的处理相比，经10μg/ml和15μg/ml胆固醇处理24小时后，人甲状腺细胞中nis的转录水平明显降低，经5μg/ml胆固醇处理24小时后，人甲状腺细胞中nis的转录水平变化不明显(图5b)。2、采用免疫组化方法检测nis蛋白在大鼠甲状腺中的表达，结果如图6所示，图6a中，蓝色为滤泡上皮细胞的细胞核，棕黄色为阳性染色的nis蛋白，hc组阳性染色明显少于nc组，图6b为针对图6a的阳性染色火山图；结果表明，大鼠高胆固醇饮食24周后，甲状腺中nis的蛋白水平明显降低。3、采用westernblotting及免疫荧光方法检测nis蛋白在甲状腺细胞中的表达，结果如图7和图8所示：图7显示，相同处理时间下，nis蛋白水平随胆固醇(chol)处理浓度的升高逐渐降低；相同胆固醇处理浓度下，nis蛋白水平随胆固醇处理时间的延长逐渐降低；图8显示，第一列红色为tritc标记的nis蛋白，第二列蓝色为dapi标记的细胞核，第三列为第一列和第二列整合后的结果。与对照相比，胆固醇(chol)处理后的人甲状腺细胞中红色区域面积和亮度明显降低，即nis蛋白水平明显降低。4、采用放射性碘131摄取率实验测定大鼠活体状态下甲状腺和人甲状腺细胞摄碘功能，结果如图9所示：图9a显示，大鼠高胆固醇饮食24周后，hc组大鼠甲状腺对碘的摄取率明显低于nc组；图9b显示，与未经胆固醇处理的对照相比，经15μg/ml胆固醇(chol)处理72小时后人甲状腺细胞对碘的摄取率明显降低；图9结果表明，胆固醇可以降低钠碘转运体(nis)的功能。综上步骤1-4的结果表明，胆固醇可以降低甲状腺钠碘转运体(nis)的mrna、蛋白表达水平及功能。实施例5、胆固醇进入细胞后发挥下调甲状腺nis表达的作用1、采用酶法检测实施例2中经0、5、10和15μg/ml胆固醇处理24小时后人甲状腺细胞内的胆固醇含量，结果如图10所示，10和15μg/ml胆固醇处理24小时后人甲状腺细胞内的胆固醇含量明显高于未添加胆固醇的对照，且15μg/ml胆固醇处理的结果明显高于10μg/ml胆固醇处理的结果，即胆固醇处理使细胞内胆固醇含量呈浓度依赖性增加。2、使用游离胆固醇转运体npc1l1阻断剂ezetimibe(10μmol/l)预处理人甲状腺细胞，再将细胞使用15μg/ml胆固醇处理24小时，采用细胞总胆固醇filipin荧光染色直观展示甲状腺细胞中胆固醇含量，结果如图11所示。其中，对照为未经ezetimibe预处理也未使用胆固醇处理的人甲状腺细胞，chol代表使用15μg/ml胆固醇处理24小时的人甲状腺细胞，e代表经ezetimibe预处理的人甲状腺细胞，e+chol代表经ezetimibe预处理且使用15μg/ml胆固醇处理24小时的人甲状腺细胞。图11结果显示，游离胆固醇转运体npc1l1阻断剂ezetimibe预处理细胞可使细胞内胆固醇含量减少。3、westernblotting检测ezetimibe预处理甲状腺细胞对nis蛋白表达水平的影响，以gapdh为内参，结果如图12所示，与未经胆固醇处理的对照相比，使用15μg/ml胆固醇处理72小时的人甲状腺细胞的nis蛋白表达水平降低，经ezetimibe预处理后，与未经胆固醇处理的对照相比，使用15μg/ml胆固醇处理72小时的人甲状腺细胞的nis蛋白表达水平升高。4、免疫荧光方法检测nis蛋白在ezetimibe预处理的甲状腺细胞中的表达，结果如图13所示，第一行的红色为tritc标记的nis蛋白，第二行的蓝色为dapi标记的细胞核，第三行为第一行和第二行整合后的结果。与对照相比，15μg/ml胆固醇处理72小时(chol)的人甲状腺细胞中红色区域面积和亮度明显降低，即nis蛋白水平明显降低，经ezetimibe预处理且未使用胆固醇处理的人甲状腺细胞(e)中红色区域面积和亮度明显升高，即nis蛋白水平明显升高，经ezetimibe预处理且使用15μg/ml胆固醇处理72小时的人甲状腺细胞(e+chol)的中红色区域面积和亮度明显高于chol，即nis蛋白水平明显升高。步骤3-4的结果说明，游离胆固醇转运体npc1l1阻断剂ezetimibe具有提高甲状腺nis蛋白表达的作用，即游离胆固醇具有降低甲状腺nis蛋白表达的作用，ezetimibe在阻断npc1l1转运游离胆固醇进入人甲状腺原代细胞的同时，可有效削弱胆固醇对nis蛋白的下调作用。实施例6、内质网应激参与胆固醇引起的甲状腺nis表达下调1、实施例1大鼠喂养24周后取甲状腺，其透射电镜结果如图14所示，其中，thyrocyte代表甲状腺滤泡上皮细胞，n所在的区域为细胞核，rer所在的区域代表内质网，mv所在的区域代表微绒毛，lv所在的区域代表滤泡腔，与nc组相比，hc组大鼠甲状腺滤泡上皮细胞的内质网肿胀扩张。2、对实施例1中大鼠甲状腺石蜡包埋切片进行免疫组化检测，目的蛋白为大鼠甲状腺内质网应激的标志性分子免疫重链结合蛋白(bip)，结果如图15所示，蓝色为细胞核，棕黄色为阳性染色的bip蛋白，与nc组相比，hc组大鼠甲状腺滤泡上皮细胞中阳性染色面积较大且颜色较深，说明甲状腺bip蛋白表达明显增加。3、采用real-time-pcr(以gapdh为内参)检测人甲状腺细胞中bip的mrna相对表达水平，结果如图16a所示，与未添加胆固醇处理的人甲状腺细胞的对照相比，使用15μg/ml胆固醇处理24小时的人甲状腺细胞(chol)中bip的mrna相对表达水平明显升高。4、采用westernblotting(以gapdh为内参)同时检测人甲状腺细胞中nis和bip蛋白的表达水平，结果如图16b所示，与未添加胆固醇处理的人甲状腺细胞相比，使用15μg/ml胆固醇处理48小时的人甲状腺细胞中的nis蛋白表达水平降低同时bip蛋白表达水平升高。5、免疫荧光法同时检测人甲状腺细胞中bip和钙联蛋白的表达水平，结果如图17所示，第一列的红色为细胞中bip蛋白，第二列的绿色为细胞中的钙联蛋白(c)，第三列的蓝色为细胞核，第四列为前三列的整合，与未添加胆固醇处理的人甲状腺细胞相比，使用15μg/ml胆固醇处理的人甲状腺细胞中bip蛋白的表达水平明显升高。6、采用westernblotting(以gapdh为内参)检测人甲状腺细胞中内质网应激通路p-eif2α和eif2α的表达，结果如图18所示，th(毒胡萝卜素)为引起内质网应激的阳性对照，th1μm处理12h可引起人甲状腺细胞eif2α磷酸化水平显著增加，15μg/ml胆固醇处理人甲状腺细胞6h及12h均可使eif2α磷酸化水平显著增加，以6h更为明显。7、在实施例2中含有胆固醇0或15μg/ml的人甲状腺细胞培养液中添加0或10mm的4-pba(内质网应激阻断剂4-苯基丁酸)处理72小时后，采用westernblotting(以gapdh为内参)同时检测人甲状腺细胞中nis和bip蛋白的表达水平，结果如图19所示，内质网应激阻断剂4-苯基丁酸(4-pba)在有效阻断胆固醇引起的bip蛋白表达量增加的同时，也使胆固醇对nis的下调作用减弱。综上步骤1-7的结果表明，长期高胆固醇饮食诱发大鼠甲状腺内质网应激。透射电镜结果显示大鼠甲状腺滤泡上皮细胞的内质网肿胀扩张，且大鼠甲状腺内内质网应激的标志性分子bip蛋白表达明显增加。胆固醇处理使人甲状腺原代细胞内bipmrna和蛋白的表达增加，同时减少nis蛋白的表达。perk/eif2α通路在胆固醇诱发的甲状腺细胞upr(未折叠蛋白反应)中起主要作用。内质网应激阻断剂4-苯基丁酸(4-pba)在有效阻断胆固醇引起的bip蛋白表达量增加的同时，也使胆固醇对nis的下调作用减弱。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。当前第1页12