一种含促渗肽的干细胞生长因子醇质体及其制备方法与流程

本发明属于生物医药制剂
技术领域：
，公开了一种含促渗肽的干细胞生长因子醇质体及其制备方法。
背景技术：
：透皮给药是将药物涂抹或敷贴于皮肤表面的给药方法。与口服或注射给药比较，透皮给药有使用方便、用药次数少，避免胃肠道刺激与肝首过效应、维持稳定持久的血药浓度，降低药物毒副作用，提高安全性与疗效等诸多优点，因此市场前景广阔，与口服、注射并列三大给药系统。但是，由于皮肤角质层的存在，药物的吸收会受到很大的限制，大多数药物无法直接通过皮肤，达到治疗要求的渗透速率和渗透量，所以透皮给药的关键在于寻找合适的方法来改善皮肤的透过性，提高药物的透皮量。醇质体是一种含小分子醇且具有囊泡结构的纳米给药载体，具有流动性及变形性强、包封率高、稳定性好、刺激性小等优点，可通过包封增加药物的溶解度，促进药物的经皮吸收，并在角质层形成药物贮库，起到缓释作用，避免药物大量进入血液，引起全身性反应。醇质体能传递药物到达皮肤深层，继而进入血液循环，也可以实现细胞间的传递，是迄今为止最高效的透皮载体。醇质体膜的组成极大的影响其包封率和透皮性能，在磷脂中加入一定比例的胆固醇可以增加脂质双分子膜中分子间的紧密程度，但过量会导致膜不对称，造成药物泄漏。磷脂中的不饱和酰基链易氧化，因此需在制备过程中加入一定的抗氧化物质稳定磷脂，比如维生素e等。乙醇可以降低醇质体之间的水合力，但过量可导致醇质体的聚集与融合，因此可加入部分丙二醇，减少乙醇的用量，防止药物泄漏，避免囊泡聚集导致粒径变大，并使醇质体具有良好的变形性、透皮性及稳定性，可有效增加药物透皮深度和皮肤内滞留量，并且改善醇质体稳定性欠佳的问题，使其更易于保存。另外，近年来研究发现了一些能够有效地帮助药物透过角质层的短肽，称其为促渗肽。这种促渗肽作用明显，包括对亲水性大分子都有独特的促渗活性，且生物相容性良好、毒性低，极具竞争优势。脐带干细胞能分泌大量的细胞活性因子，包括血管内皮生长因子(vegf)、胰岛素样生长因子(igf)、角质细胞生长因子(kgf)、表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)等，这些细胞因子可以有效调控机体细胞的信号传导，改善机体局部微环境，促进内源性干细胞分化及向伤口部位的迁移，更新病变及衰老的细胞，进而生理性修复机体组织的损伤。在皮肤上作用尤其明显，能有效促进创伤愈合。目前，临床上已有将单细胞因子或者两三种因子联合应用于组织修复的报道，取得了很好的疗效。相比之下，富含多种因子的干细胞上清液更适用于机体创面组织的修复。但干细胞分泌的因子属于生物活性大分子，不能直接透过皮肤角质层，到达表皮基底层、真皮层，或渗透到组织深层发挥治疗作用。且干细胞因子的保存条件苛刻，不能在4℃长时间保存，否则生物活性丧失。这些因素都影响了干细胞因子的应用。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种含促渗肽的干细胞生长因子醇质体及其制备方法，以解决上述
背景技术：
中提到的问题。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:一种含促渗肽的干细胞生长因子醇质体及其制备方法，包括以下步骤:(1)脐带干细胞的原代分离和培养:在超净工作台内，将脐带剪成5cm左右的小段，用pbs洗净脐带表面残余的血液；剥离脐动脉和脐静脉后，将脐带置于含双抗的α-mem培养基中，剪成2mm3左右的组织块；将剪碎的组织转移到50ml离心管中，200～300g离心5～10min；小心弃去上层培养基，加入与组织等体积的混合消化酶，于37℃摇床中，振荡消化1.5～2.0h。混合消化酶含ⅱ型胶原酶2g/l、中性蛋白酶0.8g/l、透明质酸酶0.03g/l；将消化后的组织液于300～400g离心5～10min，小心弃去上清，pbs洗1次，弃上清，沉淀用α-mem完全培养基重悬，接种于数个75cm2培养瓶中，37℃、5％co2培养箱中培养，每隔3天换液，长满后正常传代扩增。(2)干细胞分泌因子溶液的获取:待脐带干细胞融合度达到80％以上时，更换新鲜的不含抗生素的无血清培养基，培养3～5天，收集第5～12代脐带干细胞的培养上清液，2000g离心20min，去掉细胞碎片等成分后，将上清液用0.22μm的无菌过滤器过滤除去较大粒径的颗粒，用超滤浓缩技术对收集到的上清液进行浓缩，即得含有多种干细胞分泌因子的溶液。(3)干细胞因子醇质体的制备:用10ml无水乙醇与丙二醇的混合醇溶液溶解0.5～2g磷脂、0.01～0.1g胆固醇、0.02～0.1mg维生素e，作为油相。干细胞分泌因子溶液为水相，在800～1000rpm/min的搅拌状态下，将水相以4％～5％v/min的速度缓慢注入油相中，完成后继续搅拌20～30min，得到干细胞因子醇质体原液。用超声仪对醇质体进行初步分散，然后用挤压器挤压统一粒径的方法进行均质处理，最后与促渗肽tat、pep-1、space、peptide、td-1中的一种或几种混合，即得含促渗肽的干细胞因子醇质体。优选地，干细胞培养上清液使用的脐带干细胞为第5～12代的细胞，无血清培养时间3～5天。优选地，超滤浓缩步骤使用1kd、3kd、10kd、30kd、50kd、100kd超滤膜中的一种或几种。优选地，油相使用的醇溶液为无水乙醇与丙二醇的混合物，比例4:6～9:1。优选地，油相使用的磷脂为天然大豆磷脂、蛋黄磷脂或者混合磷脂中的一种或几种。优选地，油相制备过程中，磷脂、胆固醇、维生素e处理步骤如下:将醇溶液加热至75～80℃，加入胆固醇，完全溶解后，搅拌降温至55～60℃，然后加入磷脂和维生素e，继续搅拌至完全溶解，正常降温至室温，制备完成。优选地，干细胞因子醇质体的粒径范围为50～400nm。优选地，所使用的促渗肽为tat、pep-1、space、peptide、td-1中的一种或几种。与现有技术相比，本发明的有益效果如下:1.磷脂容易被氧化，温度越高氧化越明显，因此制备时高温时间越短，越能保留磷脂的理化特性。本发明所述醇质体的油相制备过程中，用较高温度(75～80℃)溶解难溶于混合醇溶液的胆固醇，然后搅拌降温至55～60℃，迅速溶解磷脂和维生素e，降低了磷脂的氧化程度。且制备过程中加入了常用的促渗肽，可进一步提高醇质体的透皮吸收效果。2.用本发明所述方法制备的干细胞因子醇质体包封率较高，稳定性好，放置30d，包封率仍在70％以上，zeta电位绝对值在15mv以上。且制备方法简单，有助于工业化生产。附图说明图1为本发明的整体流程图；图2为本发明实施例提供的脐带干细胞的形态学示意图；图3为本发明实施例提供的脐带干细胞因子醇质体形态学图；图4为本发明实施例提供的脐带干细胞因子醇质体粒径检测图；具体实施方式下面结合具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。本发明实施例提供一种含促渗肽的干细胞生长因子醇质体及其制备方法，包括以下步骤:(1)脐带干细胞的原代分离和培养：在超净工作台内，将脐带剪成5cm左右的小段，用pbs洗净脐带表面残余的血液；剥离脐动脉和脐静脉后，将脐带置于含双抗的α-mem培养基中，剪成2mm3左右的组织块；将剪碎的组织转移到50ml离心管中，300g离心10min；小心弃去上层培养基，加入与组织等体积的混合消化酶，于37℃摇床中，振荡消化2h。混合消化酶含ⅱ型胶原酶2g/l、中性蛋白酶0.8g/l、透明质酸酶0.03g/l；将消化后的组织液于300g离心10min，小心弃去上清，pbs洗1次，弃上清，沉淀用α-mem完全培养基重悬，接种于数个75cm2培养瓶中，37℃、5％co2培养箱中培养，每隔3天换液，长满后正常传代扩增。(2)干细胞分泌因子溶液的获取：第8代脐带干细胞正常培养，融合度达到80％以上时，更换新鲜的不含抗生素的无血清培养基，培养3天，收集脐带干细胞的培养上清液，2000g离心20min，去掉细胞碎片等成分后，将上清液用0.22μm的无菌过滤器过滤除去其他较大粒径的颗粒，用超滤浓缩技术对收集到的上清液进行浓缩，即得含有多种干细胞分泌因子的溶液；(3)干细胞因子醇质体的制备：取10ml比例8:2的乙醇-丙二醇混合溶液，加热至75～80℃，溶解0.03g胆固醇，搅拌降温至55～60℃，加入0.6g天然大豆磷脂和0.03g维生素e，搅拌至完全溶解，室温放置降温，得到淡黄色溶液，油相制备完成。密闭搅拌条件下，搅拌速度900rpm,将干细胞分泌因子溶液缓慢加入到油相中，速度4％v/min,完成后继续搅拌20min。用超声仪对醇质体进行初步分散，然后用挤压器挤压统一粒径，最后与促渗肽tat物理混合，tat序列:arg-lys-lys-arg-arg-gln-arg-arg-arg，即得含促渗肽的干细胞因子醇质体，放置4℃冰箱保存。本实施例所得的干细胞因子醇质体为粉色至红色混悬液，长时间静置底部可能出现少量絮状物，摇动后变均匀，平均粒径大小为212nm，zeta电位大小为-16.89mv，超滤法测得包封率为74.9％。在一个示例中，干细胞因子为人脂肪干细胞分泌的生物活性因子或其他人源干细胞分泌的生物活性因子。在一个示例中，磷脂为高纯度的蛋黄磷脂和混合磷脂。在一个示例中，干细胞因子醇质体还包含其他对人体无刺激的温和抗氧化剂，例如抗环血酸、右旋糖酐、蔗糖、乳糖或海藻糖中的至少一种。在一个示例中，干细胞因子醇质体也可以加入保护剂做成冻干粉。该冻干粉可以在功能化妆品中应用，也可以在创伤修复中用作外敷制剂或者注射制剂。在一个示例中，干细胞因子醇质体优选粒径范围为100～200nm。对醇质体稳定性进行测定取实施例所制得的脐带干细胞因子醇质体于4℃条件下保存，分别于0天、15天及30天测定其粒径、zeta电位、包封率，并观察外观，以确定其稳定性，其结果如表1所示:表1.脐带干细胞因子醇质体稳定性结果时间/天平均粒径/nmzeta电位(mv)包封率(％)0212-16.89mv74.915219.1-16.72mv75.130223.3-17.03mv73.4从表1可以看出，脐带干细胞因子醇质体在4℃条件下稳定性良好，0天、15天及30天各项结果没有显著性差异，可预测干细胞醇质体作为一种原料，稳定性良好。图1为本发明的整体流程图,是对干细胞因子醇质体制备方法的简介；图2为本发明实施例提供的一种脐带干细胞的形态学图，细胞呈长梭形、旋涡状生长，符合文献中对脐带干细胞的描述。图3为本发明实施例提供的一种脐带干细胞因子醇质体形态学图，说明脐带干细胞因子醇质体呈不规则的圆球状。图4为本发明实施例提供的一种脐带干细胞因子醇质体粒径检测图，说明脐带干细胞因子醇质体粒径呈正态分布，粒径范围在78.82nm～615.1nm，平均粒径为212nm。以上结合实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，本发明的实施方式不受上述实施例的限制，凡在本发明的精神和原则之内，所做出的任何修改、替换、组合、简化，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12