一种促进创伤愈合和再生并负载中药外泌体的复合敷料及制备方法与流程

本发明涉及一种促进创伤愈合和再生并负载中药外泌体的复合敷料及制备方法。

背景技术：

皮肤是人体的第一道防线，也是人体最大的器官，具有感觉和屏障等多种功能。皮肤可在生物体和环境之间形成有效的屏障，防止病原体的入侵，抵御化学和物理侵袭等。然而在日常生活中，皮肤往往受到多种外界因素的影响，引起创伤，其中大面积的丧失往往会带来严重后果，导致严重残疾甚至死亡，给个人与社会带来沉重的压力与负担。

伤口的愈合是一个复杂而动态的过程，包括多种组织与细胞等共同参与调节。伤口修复过程不受控制的调节，经常导致创面愈合后疤痕严重、附属器官不能新生，造成修复障碍。

骨髓间充质干细胞是一种多能细胞，具有分化成多种细胞类型的潜力，包括脂肪细胞，内皮细胞，成骨细胞和软骨细胞等。并且由于骨髓间充质干细胞在体外来源丰富且易于分离，间充质干细胞被认为是再生医学最重要的干细胞来源之一,且也被广泛用于细胞疗法和组织工程。在创伤过程中，骨髓间充质干细胞(bmscs)也在其中发挥重要作用。例如，在肉芽组织的形成过程中，成纤维细胞产生了支持细胞生长所必需的新的细胞外基质。而成纤维细胞不仅是局部来源，也来源于bmscs。然而间充质干细胞，仅占骨髓来源细胞总数的0.01-0.001％，在创伤部位数量稀少。

基质细胞衍生因子(sdf-1)，是趋化因子家族的一个成员，能与cxcr4受体特异性结合。通过与受体的相互作用，sdf-1可以与bmscs表面大量表达的cxcr4受体结合，通过sdf-1/cxcr4轴促使bmscs定向趋化、迁移和募集到创伤部位参与创伤愈合。

外泌体，是一种可以由细胞分泌的膜性囊泡结构，大小介于30-100nm之间，内部含有dna、rna和蛋白质等，参与细胞间通讯，具有多种功能。外泌体的来源主要包括血液，尿液，细胞培养液等，然而这些来源中的外泌体含量往往较少。

人参，是传统名贵中草药。首见于《神农本草经》，有“补五脏、安精神、定魂魄、止惊悸、除邪气、明目益智、久服轻身延年”等功效，在我国的中医药体系中具有重要地位。并随着对人参现代科学研究的深入，其中人参皂苷rg1、rg3和rb1等多种有效成分可以有效促进伤口愈合和血管新生。而对于人参中外泌体的研究却尚未出现。

甲基丙烯酸酯化明胶，由明胶与甲基丙烯酸修饰而来，一方面制备简单方便，成本经济实惠，具有很大的工业化潜力；一方面，具有良好的机械强度以及生物相容性。现有研究多利用其光敏特性进行3d打印，以及骨损伤方面应用。然而在包载中药外泌体与细胞因子后，应用于创伤治疗以及血管新生领域尚属空白.

技术实现要素：

本发明的目的时提供一种促进创伤愈合和再生并负载中药外泌体的复合敷料及制备方法，以解决：

a.创伤愈合过程中愈合缓慢和血管再生问题；

b.外泌体在中药中的全新应用问题；

c.给药过程中的操作不便以及患者顺应性问题；

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

本发明首先公开了一种促进创伤愈合和再生并负载中药外泌体的复合敷料及制备方法，包括以下步骤：

a.将明胶与甲基丙烯酸酐反应制备甲基丙烯酸酯化明胶；

b.通过差速离心、密度梯度离心法，制备并纯化中药外泌体；

c.将甲基丙烯酸酯化明胶溶于超纯水或者磷酸缓冲盐溶液中，然后将制备的外泌体与甲基丙烯酸酯化明胶复合，并加入sdf-1与光敏剂，制备成预凝胶体系；

d.预凝胶体系通过光交联，制备成复合敷料。

作为本发明的优选方案，所述步骤a中，甲基丙烯酸酯化明胶的接枝率为20-80％。

作为本发明的优选方案，所述步骤b中，外泌体的来源药材为人参、女贞子、丹参、地黄、西红花、芍药中的一种或多种。

作为本发明的优选方案，所述步骤b具体为：

1)将药材洗净、然后榨汁；榨得的汁液过100-300目的筛子，除去药材残渣；将过筛的汁液进行差速离心，首先在离心力为1000-10000g下，离心10-60分钟，弃去沉淀；然后将上清在离心力为3000-30000g下，离心10-120分钟；弃去沉淀，将上清再在离心力为10000-300000g下，离心10-480分钟；

2)将步骤1)最后一步得到的沉淀，用超纯水或者磷酸缓冲盐溶液重悬，然后通过密度梯度离心纯化，其密度梯度溶液由蔗糖或cscl制备，各梯度溶液浓度为10-90％；离心力100000-200000g，时间为10-360分钟；

3)将不同浓度区间的外泌体吸出，在离心力50000-300000g下离心，时间为10-360分钟，得到沉淀。用超纯水或者磷酸缓冲盐溶液重悬，得到中药外泌体。

作为本发明的优选方案，所述步骤c的预凝胶体系中，甲基丙烯酸酯化明胶的质量百分比浓度为5％-30％。

作为本发明的优选方案，所述步骤c的预凝胶体系中，中药外泌体的浓度为1ng-10ug/ml；sdf-1的浓度为0.01-1μg/ml；光敏剂为lap与i2959中的一种或两种；光敏剂的质量百分比浓度为0.01-1％。

作为本发明的优选方案，所述步骤d中，导电预凝胶体系中，光交联时间为10-360秒。

本发明还公开了所述方法制得的复合敷料。

本发明的复合敷料可以在创伤愈合及再生、血管新生以及神经再生领域中的应用。

由于采用上述技术方案，本发明取得了以下有益效果：

1.本发明适用范围广，不需要使用特殊的材料，降低生产成本；

2.本发明制备的光交联凝胶，具有良好粘弹性与机械强度，可降解并具有缓释作用，且在体外实验中，具有的细胞黏附能力和生物相容性；

3.本发明制备的中药外泌体，来源于中药，来源范围广，制备容易，产量高，

具有广大的医用以及商用前景；

4.本发明制备的复合敷料，可以在伤口处包载释放外泌体与细胞因子。所述操作简单方便，交联迅速，并可有效诱导干细胞向伤口处迁移，通过伤口愈合和血管新生。

附图说明

图1为明胶与甲基丙烯酸酯化明胶的核磁共振氢谱图；

图2为复合敷料的细胞黏附结果图；

图3为复合敷料的活死染色结果图；

图4为外泌体的粒径电位图；

图5为外泌体的透射电镜结果图；

图6为干细胞在外泌体给药后1天的cck-8增殖结果图；

图7为干细胞在外泌体给药后的细胞迁移结果图；

图8为复合敷料的大鼠体重结果图；

图9为复合敷料的大鼠伤口愈合结果图；

图10为复合敷料的大鼠皮肤马森三色染色结果图；

图11为复合敷料的大鼠皮肤cd31免疫组化结果图；

图12为复合敷料的大鼠皮肤神经丝蛋白(nf-l)免疫组化结果图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明作详细的说明。

为了使本发明的目的、技术方案以及优点更加清晰明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例，仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：一种促进创伤愈合和再生并负载中药外泌体的复合敷料及制备方法，包括以下步骤：

1)将明胶与甲基丙烯酸酐反应，之后用8k-14kda的透析袋中室温透析1周，然后冻干，制备成甲基丙烯酸酯化明胶；

2)先将女贞，洗净，榨汁，过100目筛；再通过差速离心法，先后用1000g、12000g离心之后，取上清液用超速离心机在100000g下离心，然后将沉淀用pbs重悬。用蔗糖配备密度梯度溶液，然后在200000g下超离60分钟；再取不同组分的外泌体，在50000g下离心60分钟，制备成中药外泌体；

3)将甲基丙烯酸酯化明胶用pbs溶解，使其浓度达到5％；然后加入sdf-1，使其浓度达到1μg/ml；再加入中药外泌体，使其最终浓度达到10μg/ml。再混入光敏剂1％lap，得到水胶预凝胶体系；

4)将水凝胶预凝胶体系，加到伤口处，然后光交联30s，制备成复合敷料；

制备甲基丙烯酸酯化明胶之后，溶解于氘代水中，然后用核磁共振仪测试，获得相关材料的¹h-nmr谱图，确定甲基丙烯酸酯化明胶的化学结构；如图1所示，相较于明胶,甲基丙烯酸酯化明胶的h谱中存在化学位移在5.2～5.6ppm之间的峰(黑色圆形框中所示)，代表双键碳上的氢原子。并且受局部屏蔽效应和远程屏蔽效应的影响，双键碳上的两个氢原子处在不同的化学位移上.

制备成复合敷料后，将复合敷料于超净台中紫外照射0.5小时。用骨髓间充质干细胞完全培养液洗去酒精并浸泡水凝胶，于37℃中平衡。将消化的骨髓间充质干细胞以1×10⁵/ml的细胞密度接种在凝胶上，置于37℃、5％co2的孵箱内培养24小时后，吸掉培养基，pbs清洗两次，再用4％多聚甲醛浸泡固定10分钟后，用含0.1％tritonx-100的pbs洗涤2次，每次约5分钟。用含有5％bsa和0.1％tritonx-100的pbs按照1:100的比例稀释actin-trackergreen染色液，滴加到细胞上，室温避光孵育1h后再用pbs洗两次。加入500μl/mldapi溶液，室温孵育15分钟，除去dapi溶液，pbs清洗两次后，立即置于共聚焦显微镜下观察。如图2所示，在培养24h后，细胞在水凝胶上正常黏附，细胞形态正常，成梭状伸展。

制备成复合敷料后，用骨髓间充质干细胞完全培养液洗去酒精并浸泡水凝胶，于37℃中平衡。将消化的骨髓间充质干细胞以1×105/ml的细胞密度接种在凝胶上，置于37℃、5％co2的孵箱内培养48h后，去除培养液，pbs清洗3次。加入已用pbs分别稀释到2μm和8mμ的calceinam和pi溶液，没过细胞，避光孵育30-45分钟，最后用pbs清洗三次，将残余的试剂去除，立即将待测样品放在激光共聚焦显微镜下观察。其中活细胞显示绿色，死细胞中的核酸物质被染成红色。如图3所示，培养48h后，复合敷料中细胞基本显绿色，未见红色，证明复合敷料有良好的生物相容性。

实施例2：一种促进创伤愈合和再生并负载中药外泌体的复合敷料及制备方法，包括以下步骤：

1)将明胶与甲基丙烯酸酐反应，之后用8k-14kda的透析袋中室温透析2周，然后冻干，制备成甲基丙烯酸酯化明胶；

2)先将丹参，洗净，榨汁，过200目筛；再通过差速离心法，先后用2000g、10000g离心之后，取上清液用超速离心机在120000g下离心，然后将沉淀用pbs重悬。用cscl梯度溶液，然后在100000g下超离60分钟；再取不同组分的外泌体，在100000g下离心60分钟，制备成中药外泌体；

3)将甲基丙烯酸酯化明胶用pbs溶解，使其浓度达到10％；然后加入sdf-1，使其浓度达到0.2μg/ml；再加入中药外泌体，使其最终浓度达到1μg/ml。再混入光敏剂0.1％i2959，得到水胶预凝胶体系；

4)将水凝胶预凝胶体系，加到伤口处，然后光交联30s，制备成复合敷料；

将制备完成的外泌体，于马尔文粒径分析仪中，分析其粒径电位。如图4所示，外泌体的粒径和电位分布均一，其中粒径为147.3±2.931nm，pdi为0.225，表面电位为-27.9±0.451mv。

然后将外泌体溶液滴于镀有碳膜的铜网上，之后用醋酸双氧铀进行复染，透射电镜观察。如图5所示，外泌体呈标准饼状结构。

取第三代的骨髓间充质干细胞，以5×10³/孔的密度种在96孔板上，培养24小时，向96孔板中加入不同浓度的外泌体。放入细胞培养箱中孵育6小时后，吸出培养液，pbs洗两次，将培养液更换为新鲜的含有10％血清的新鲜培养液并继续培养18小时后，除去培养液，加入含有cck-8的dmem低糖培养液100μl，放入细胞培养箱培养4小时，在酶标仪475nm处测定吸光值。计算细胞增殖百分率。如图6所示，在三种不同组别的外泌体浓度培养下，从低浓度到高浓度，外泌体均对骨髓间充质干细胞有良好的增殖作用。

将含有趋化因子sdf-1蛋白的复合敷料与不含药物的空白对照组分别置于e-plate16板的下层孔中，上室中加入无血清培养基并在5％co2培养箱中平衡1小时。以每孔2×104个细胞的密度接种bmscs于上层孔中，每组3个重复，上下室装配好，室温放置半小时后，通过rtca系统观测各孔微电阻量变化，动态监测0-48hbmscs细胞迁移到下层生长板中的生长状况，最后的结果以反映细胞迁移的动力学变化反应曲线显示。如图7所示，复合敷料组相较于空白对照组细胞指数明显升高，可有效诱导骨髓间充质干细胞迁移。

实施例3：一种促进创伤愈合和再生并负载中药外泌体的复合敷料及制备方法，包括以下步骤：

1)将明胶与甲基丙烯酸酐反应，之后8k-14kda的透析袋中室温透析2周，然后冻干，制备成甲基丙烯酸酯化明胶；

2)先将西红花，洗净，榨汁，过150目筛；再通过差速离心法，先后用3000g、5000g离心之后，取上清液用超速离心机在100000g下离心，然后将沉淀用超纯水重悬。用蔗糖梯度溶液，然后在100000g下超离60分钟；再取不同组分的外泌体，在10000g下离心60分钟，制备成中药外泌体；

3)将甲基丙烯酸酯化明胶用超纯水溶解使其浓度达到15％；然后加入sdf-1，使其浓度达到0.5μg/ml；再加入中药外泌体，使其最终浓度达到0.1μg/ml。再混入光敏剂0.05％lap，得到水胶预凝胶体系；

4)将水凝胶预凝胶体系，加到伤口处，然后光交联80s，制备成复合敷料；

建立急性创伤模型：将48清洁级sd雄性大鼠(体重150-200g)分成8组：空白对照组、omv溶液组、sdf-1蛋白溶液组、omv+sdf-1混合溶液组、gelma凝胶组、gelma/sdf-1凝胶组、gelma/omv凝胶组、gelma/omv/sdf-1凝胶组。每组6只，麻醉后剪去背部毛发，去除1.5cm×1.5cm的皮肤，并用碘酒进行消毒。第二天开始给药，每隔两天给药一次。空白组每只每次给予200μlpbs，三组溶液组同样每只每次给药200μl溶液，凝胶组每只每次给药1.5cm×1.5cm的凝胶片层制剂，并用无菌贴片将其固定。并注意观察创面的愈合情况和疤痕的形成情况，每3天进行一次拍照，并测量伤口面积和大鼠的体重，计算愈合率与体重变化情况。

如图8和9所示，复合辅料组的体重与愈合率均较空白对照组明显增加。其中体重结果客观证明复合敷料对sd大鼠无有害的全身影响，而愈合率的明显增加证明复合敷料有效提高伤口的愈合率。

将切片放入weiger氏铁苏木素染色10min，自来水洗1min，1％盐酸酒精分化5s。自来水冲洗数分钟返蓝。丽春红酸性品红液染色5min，蒸馏水快速漂洗。1％磷钼酸水溶液处理约5min，不用水洗，直接用苯胺蓝液或绿液复染5min。1％冰醋酸处理1min后，95％酒精脱水多次，接着用无水酒精脱水，二甲苯透明两次后用中性树胶封片。如图10所示，复合敷料治疗后的皮肤样本中胶原排列整齐，皮肤附属器生成非常明显，且表皮结构和正常皮肤组织相似，整个皮肤组织形态基本与正常组织类似

将组织切片置于盛满edta抗原修复缓冲液(ph8.0)的修复盒中进行抗原修复，滴加3％bsa均匀覆盖组织，室温封闭30分钟，轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加pbs按一定比例配好的cd31和神经丝蛋白(nf-l)一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。玻片置于pbs中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5分钟。滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50分钟。pbs充分冲洗3遍后，滴加dapi染液，避光室温孵育10分钟。用pbs充分浸泡清洗五遍后加入pbs浸润，切片于共聚焦显微镜下观察并采集图像。如图11所示，复合敷料组皮肤组织切片中，红色荧光高度表达，且成圆形，可见大量的血管的分布。证明复合敷料可以在体内，有效的促进伤口处血管新生。如图12所示，复合敷料组皮肤组织切片中，红色荧光表达，且成丝状，可见大量的神经丝的分布。证明复合敷料可以在体内，有效的促进伤口处神经新生。