本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪多杀性巴氏杆菌病三联灭活疫苗及其制备方法。
背景技术：
副猪嗜血杆菌(haemophilusparasuis，hps)是猪上呼吸道的一种条件性致病菌，特定条件下侵入机体引起以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎及高死亡率为特征的一种全身性传染性疾病。目前，副猪嗜血杆菌病是我国流行的主要细菌病之一，该菌可影响2-25周龄的仔猪和育肥猪，主要在断奶后和保育阶段发病，多见于5～8周龄的猪，发病率在10％-90％，严重时死亡率高达50-90％，成年猪感染病死率在20％左右，母猪病死率可高达30％-40％，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。根据krg血清分型，至少可以将其分为15个血清型，其中以血清4型、5型为主。副猪嗜血杆菌各血清型之间缺乏免疫交叉保护，副猪嗜血杆菌灭活疫苗只对同一血清型的菌株有抵抗保护作用，一旦流行菌株血清型与疫苗血清型不符，该疫苗对猪群就无保护作用。
猪链球菌(streptococcussuis，ss)是引起猪链球菌病的病原菌，自然条件下，不同年龄、品种和性别的猪均对本病易感，可引起猪的败血症、脑膜炎、关节炎等临床症状。根据细菌荚膜多糖可将猪链球菌分为33个血清型，经流行病学分析，2、7、9型是引起猪感染的重要血清型，其中猪链球菌2型毒力最强，流行广。
猪巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌(pasteurellamultocida，pm)引起的猪发生呼吸系统、局灶性感染及出血性败血症的传染性疾病，正常定植于健康动物的口腔、鼻咽和上呼吸道。根据细菌的荚膜多糖可将猪多杀性巴氏杆菌分为a、b、d、e、f型，猪巴氏杆菌病又叫猪肺疫，主要由a、b型感染引起，多杀性巴氏杆菌感染可引起急性或散发性传染病，该病原菌还可与多种病原协同感染，从而增加猪群呼吸道疾病的发病率和死亡率，造成严重的经济损失。
市面对上猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病、猪多杀性巴氏杆菌病的疫苗防控，大多为单苗、二联疫苗，针对猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病、猪多杀性巴氏杆菌病共感染的灭活疫苗，国内还是空白，商品苗已不能满足临床的需求，而抗生素的滥用，造成耐药菌株的产生，使得针对共感染的多价疫苗更加受到欢迎。
兽用大多数疫苗是采用甲醛进行灭活，甲醛灭活易受温度、ph和浓度的影响，而过量甲醛灭活不仅会损坏疫苗的抗原性，也会导致多量残留，对动物机体和人的食用安全性均有影响。铝佐剂是得到公认的疫苗佐剂之一，常规铝佐剂由于免疫应激大等缺点使其应用受到了限制，故研究开发一种制备方法简单、可有效预防猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病、猪多杀性巴氏杆菌病，且副反应小、安全、高效的灭活疫苗势在必行。
技术实现要素：
本发明主要目的之一是提供一种可以同时预防副猪嗜血杆菌、猪链球菌和猪多杀性巴氏杆菌共感染的安全高效的三联疫苗。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪多杀性巴氏杆菌病三联灭活疫苗，其特征在于，所述三联灭活疫苗包括抗原浓缩液和纳米铝佐剂；所述抗原浓缩液包括灭活的副猪嗜血杆菌血清4型h23株、副猪嗜血杆菌血清5型h24株、猪链球菌血清2型s23株、猪多杀性巴氏杆菌荚膜a型p13株以及猪多杀性巴氏杆菌荚膜b型p11株的抗原浓缩液。
优选的，所述副猪嗜血杆菌血清4型h23株、副猪嗜血杆菌血清5型h24株、猪链球菌血清2型s23株、猪多杀性巴氏杆菌荚膜a型p13株以及猪多杀性巴氏杆菌荚膜b型p11株的抗原浓缩液体积比为1:1:1:1:1。
优选的，所述副猪嗜血杆菌血清4型h23株、副猪嗜血杆菌血清5型h24株、猪链球菌血清2型s23株、猪多杀性巴氏杆菌荚膜a型p13株以及猪多杀性巴氏杆菌荚膜b型p11株的抗原浓缩液含量均为5×107cfu/ml。
优选的，所述纳米铝佐剂体积比为10％。
优选的，所述三联灭活疫苗还包括1％(w/v)的硫柳汞和兽医学可接受的疫苗稀释剂。
优选的，所述疫苗稀释剂为0.9％nacl溶液或pbs溶液。
本发明另外一个目的是提供副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病和猪多杀性巴氏杆菌病三联灭活疫苗制备方法，所述三联灭活疫苗制备方法包括以下步骤：
s1、分别将副猪嗜血杆菌血清4型h23株、血清5型h24株，猪链球菌血清2型s23株，猪多杀性巴氏杆菌荚膜a型p13株、猪多杀性巴氏杆菌荚膜b型p11株菌增殖得到培养液；
s2、分别取步骤s1中的培养液，加入培养液总体积0.1％-0.15％的灭活剂，经4℃灭活72小时，期间搅拌数次，再在37℃水浴2小时，得到灭活的副猪嗜血杆菌血清4型h23株、血清5型h24株，猪链球菌血清2型s23株，猪多杀性巴氏杆菌荚膜a型p13株、猪多杀性巴氏杆菌荚膜b型p11株菌的培养液；
s3、将步骤s2中灭活的副猪嗜血杆菌血清4型h23株、血清5型h24株，猪链球菌血清2型s23株，猪多杀性巴氏杆菌荚膜a型p13株、猪多杀性巴氏杆菌荚膜b型p11株菌的培养液进行浓缩，再分别加入0.9％nacl溶液或pbs溶液重悬菌体，得到副猪嗜血杆菌血清4型h23株、副猪嗜血杆菌血清5型h24株、猪链球菌血清2型s23株、猪多杀性巴氏杆菌荚膜a型p13株以及猪多杀性巴氏杆菌荚膜b型p11株菌的抗原浓缩液；
s4、取步骤s3中副猪嗜血杆菌血清4型h23株、副猪嗜血杆菌血清5型h24株、猪链球菌血清2型s23株、猪多杀性巴氏杆菌荚膜a型p13株以及猪多杀性巴氏杆菌荚膜b型p11株菌的抗原浓缩液加入乳化机，同时按配方比例加入纳米铝佐剂、稀释剂、硫柳汞进行低速搅拌，混合得到副猪嗜血杆菌、猪链球菌和猪多杀性巴氏杆菌灭活疫苗。
优选的，所述步骤s2中灭活剂为β-丙内酯。
优选的，所述步骤s3中副猪嗜血杆菌血清4型h23株、副猪嗜血杆菌血清5型h24株、猪链球菌血清2型s23株、猪多杀性巴氏杆菌荚膜a型p13株以及猪多杀性巴氏杆菌荚膜b型p11株的细菌经浓缩后细菌含量为相当于灭活前活菌数为5×109fu/ml。
优选的，在步骤s4后分别对副猪嗜血杆菌、猪链球菌和猪多杀性巴氏杆菌培养进行无菌检验、安全检验和效力检验。
本发明通过实施例2-3显示，三联灭活疫苗用β-丙内酯灭活后，采用纳米铝为佐剂的疫苗注射入断奶仔猪，疫苗注射局部无不良反应，各脏器无异常病变，而采用甲醛灭活的断奶仔猪的注射部位出现2例红疹、皮下结节以及接触性过敏，表明β-丙内酯灭活的疫苗安全性好，且以纳米铝为佐剂的疫苗吸收较好，无不良反应。
通过实施例4，分别对断奶仔猪肌肉注射常规铝佐剂疫苗1和纳米铝佐剂疫苗2各2ml，并进行二次免疫，二免后14天，用各个强毒株进行攻毒；攻毒后观察14天统计显示，常规铝佐剂疫苗和纳米铝佐剂疫苗均对副猪嗜血杆菌(4型、5型)、猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌(a型、b型)攻毒具有保护作用，前者保护率基本达80％以上，后者保护率基本达100％，再次表明副猪嗜血杆菌、猪链球菌和猪多杀性巴氏杆菌病三联灭活疫苗能产生对相应病原产生较好的保护作用，且纳米铝疫苗作用效果较传统铝胶疫苗强。
本发明还通过实施例5分别对三联灭活疫苗、单联灭活疫苗或二联灭活疫苗进行效力检验，结果显示，三联灭活疫苗、单联灭活疫苗和二联灭活疫苗在副猪嗜血杆菌4型、猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌a型和b型菌株攻毒时，各疫苗对断奶仔猪免疫保护率没有明显差异，但是在副猪嗜血杆菌5型和猪多杀性巴氏杆菌b型菌株攻毒时，三联灭活疫苗对断奶仔猪的免疫保护率优于单联灭活疫苗和二联灭活疫苗；在副猪嗜血杆菌5型和猪多杀性巴氏杆菌b型菌株攻毒部分，三联灭活疫苗对断奶仔猪的免疫保护率均为10/10，而二联灭活疫苗对断奶仔猪免疫保护率均为9/10，因此在对副猪嗜血杆菌5型和猪多杀性巴氏杆菌b型攻毒的免疫效率上，本发明提供的三联灭活疫苗优于二联灭活和单联灭活疫苗。从接种剂量比较，三联灭活疫苗一针注射2ml，而单联灭活疫苗或二联灭活疫苗至少打2针共4ml，故本发明提供的三联灭活疫苗降低了免疫成本，且疫苗效价含量高，免疫方便快捷。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的副猪嗜血杆菌、猪链球菌和猪多杀性巴氏杆菌的菌种经敏感猪体复壮，具有免疫原性强，抗原谱广，遗传性能稳定，以之作为菌种，更具有针对性。
(2)本发明提供的副猪嗜血杆菌、猪链球菌和猪多杀性巴氏杆菌三联灭活疫苗采用纳米铝作为佐剂，其吸附能力强，提高抗原的靶向投递，大大减低抗原的不良反应，最大限度的提高抗原利用率，提高了安全性，做到了一针多防。
(3)疫苗效价含量高，免疫方便快捷。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
菌种：副猪嗜血杆菌血清4型h23株(gdmccno：60722，保藏地方：广东省微生物菌种保藏中心)、血清5型h24株(gdmccno：60723，保藏地方：广东省微生物菌种保藏中心)，猪链球菌血清2型s23株(gdmccno：60724，保藏地方：广东省微生物菌种保藏中心)，猪多杀性巴氏杆菌荚膜a型p13株(gdmccno：60720，保藏地方：广东省微生物菌种保藏中心)、猪多杀性巴氏杆菌荚膜b型p11株(gdmccno：60721，保藏地方：广东省微生物菌种保藏中心)
实施例1菌株抗原液的获得
1.副猪嗜血杆菌h23株、h24株的分离鉴定与毒力试验
1.1副猪嗜血杆菌h23株、h24株的分离鉴定
动物：2016年—2018年从华南地区采集临床表现为喘气、胸膜炎、腹膜炎心包炎、关节炎或脑炎等特征的新鲜病猪，为断奶后1-2周保育期仔猪。
方法：无菌采集病猪肺脏、心血、关节液，分别接种于tsa培养基(含5％牛血清、0.002％nad和100μg/ml的林肯霉素)，在37℃培育箱中培养24-48小时，观察细菌菌落形态，并挑选可疑菌落进行纯培养，并对进行可疑菌株扩大培养后进行16srrna的鉴定，引物序列如下：
上游引物：5'-ggcttcgtcaccctctgt-3'；
下游引物：5'-gtgatgaggaggggtggtgt-3'；
16srrnapcr产物送上海生工生物工程有限公司测序。
结果：可疑菌落在金黄色葡萄球菌两侧有针尖大小、圆形、光滑湿润、无色透明、边缘整齐的菌落生长，离金黄色葡萄球菌愈近菌落较大，愈远菌落较小，呈现出明显的“卫星现象”，初步证实是副猪嗜血杆菌，对初步证实是副猪嗜血杆菌的测序鉴定，测序结果与genbank中已知序列进行blast比对，比对结果显示pcr获得的基因片段为822bp，与已知副猪嗜血杆菌的相似性在99～100％，确定分离到的菌株为副猪嗜血杆菌。
1.2副猪嗜血杆菌h23株、h24株的血清型鉴定
用副猪嗜血杆菌标准阳性血清进行凝集试验，结果显示有85株为副猪嗜血杆菌h23株为血清4型；110株为副猪嗜血杆菌h24株为血清5型，并用pcr方法对其进行血清型分型鉴定，引物序列如下：
4型上游引物：5'-ggttaagaggtagagctaagaatagagg-3'；
4型下游引物：5'-ctttccacaacagctctagaaacc-3'；
5型上游引物：5'-tagttggtatattattttct-3'；
5型下游引物：5'-agaatgcatctgtaccactaag-3'；
产物送上海生工生物工程有限公司测序，与genbank中已知序列进行blast比对，结果显示，h23株pcr获得的基因片段为320bp，与已知副猪嗜血杆菌血清4型的wcip基因的相似性为100％，确定分离到的h23株菌株为副猪嗜血杆菌血清4型；h24株的pcr获得的基因片段为560bp，与已知副猪嗜血杆菌血清5型的funk基因的相似性为100％，确定分离到的副猪嗜血杆菌h24株为副猪嗜血杆菌血清5型。
1.3副猪嗜血杆菌h23、h24株的毒力试验
用21日龄断奶仔猪25只，随机分5组，其中1组对照组，腹腔注射1ml无菌的生理盐水，其他4组注射不同剂量的h23、h24株，注射后连续观察2周，观察并记录其发病数和死亡数等情况。
副猪嗜血杆菌h23、h24株的毒力试验结果如表1，结果显示，腹腔注射2×109cfu、1×109cfu的副猪嗜血杆菌h23株后，5头试验断奶仔猪均发病，腹腔注射1×109cfu、5×108cfu的副猪嗜血杆菌h24株后，5头试验断奶仔猪均发病，试验结果表明副猪嗜血杆菌h23感染量为1×109cfu/只、副猪嗜血杆菌h24株感染量为5×108cfu/只。
表1副猪嗜血杆菌h23、h24菌株攻毒结果
2.猪链球菌s23株的分离鉴定和毒力试验
2.1猪链球菌s23株的分离和初步鉴定
动物：2016年-2018年从华南地区采集有脑膜炎、败血症、心内膜炎、多发性浆膜炎、支气管肺炎、关节炎的发病猪。
方法：无菌采集病猪心、肝、肺、脾、淋巴结等病变组织，分别接种于绵羊血琼脂平板，37℃生化培养箱中培养24-48小时，观察菌落形态，挑取菌落小，灰白透明，稍黏，间或有溶血环的单个可疑菌落进行革兰氏染色镜检，挑取单个疑似菌落再次划线接种于血平板进行纯化保菌，菌株扩大培养后进行gdh基因测序鉴定，使用的引物序列如下：
上游引物：5'-gcagcgtattctgtcaaaacg-3'；
下游引物：5'-ccatggacagataaagatgg-3'；
结果：与genbank中已知序列进行blast比对，测序结果显示猪链球菌s23株pcr获得的基因片段为689bp，与已知猪链球菌gdh基因的相似性在99-100％，确定分离到的菌株为猪链球菌。
2.2猪链球菌s23株的血清型鉴定
对初步证实是猪链球菌的200多株菌进行血清型鉴定，用猪链球菌标准阳性血清进行凝集试验，结果显示有62株为血清2型；并用pcr方法对其进行血清型分型鉴定，引物序列如下：
上游引物为：5'-ttcgtattaacttacttggcgt-3'；
下游引物为：5'-taaatccccatatgccaaatcc-3'；
pcr产物送上海生工生物工程有限公司测序，与genbank中已知序列进行blast比对，结果显示，s23株pcr获得的基因片段为450bp，与已知猪链球菌血清2型基因的相似性为99-100％，确定分离到的s23株菌株为猪链球菌血清2型。
2.3猪链球菌s23株的毒力试验
用21日龄断奶仔猪25只，随机分5组，其中1组对照组，静脉注射1ml无菌的生理盐水，其他4组注射不同剂量的s23株，注射后连续观察2周，观察并记录其发病数和死亡数等情况。
猪链球菌s23株的毒力试验结果如表2，结果显示，静脉注射1×109cfu、5×108cfu的猪链球菌s23株后，5头试验断奶仔猪均死亡，表明猪链球菌s23株最小致死量为5×108cfu/只。
表2猪链球菌s23株攻毒结果
3.猪多杀性巴氏杆菌p13株、p11株的分离鉴定和毒力试验
3.1猪多杀性巴氏杆菌p13株、p11株的分离和初步鉴定
动物：2013年-2018年从华南地区采集临床表现为有呼吸系统疾病症状的新鲜病猪病料。
方法：无菌采取病死猪的血液、呼吸道分泌物、局部水肿液、胸腔渗出液以及病变淋巴结、肝脏、脾脏等制成触片或者涂片，接种于新鲜血平板，37℃培养24小时，观察细菌菌落形态后，挑取露珠样的圆形，表面光滑、湿润的可疑小菌落，挑选革兰氏染色镜下两极着色的革兰氏阴性小杆菌的可疑小菌落，于新鲜血平板上纯化后保菌，并行猪多杀性巴氏杆菌特异性kmt基因的鉴定。使用的引物序列如下：
上游引物：5'-atccgctatttacccagtgg-3'；
下游引物：5'-gctgtaaacgaactcgccac-3'；
基因产物送上海生工生物工程有限公司测序，与genbank中已知序列进行blast比对，结果显示，pcr获得的基因片段为457bp，与已知猪多杀性巴氏杆菌kmt基因的相似性在99-100％，确定分离到的菌株为猪多杀性巴氏杆菌。
3.2猪多杀性巴氏杆菌p13、p11株的血清型鉴定
对初步证实是猪多杀性巴氏杆菌p13、p11株的100多株菌以荚膜群标准菌株定型血清进行猪多杀性巴氏杆菌荚膜群的鉴定，结果显示有60株猪多杀性巴氏杆菌p13株为荚膜a型，有5株猪多杀性巴氏杆菌p11为荚膜b型；并用pcr方法对其进行血清型分型鉴定，引物序列如下：
a型上游引物：5'-gatgccaaaatcgcagtcag-3'；
a型下游引物：5'-tgttgccatcattgtcagtg-3'；
b型上游引物：5'-catttatccaagctccacc-3'；
b型下游引物：5'-gcccgagagtttcaatcc-3'；
pcr产物送上海生工生物工程有限公司测序，与genbank中已知序列进行blast比对，结果显示，p13株pcr获得的基因片段为1048bp，与已知猪多杀性巴氏杆菌荚膜a型基因的相似性为99-100％，确定分离到的p13株菌株为猪多杀性巴氏杆菌荚膜a型；p11株pcr获得的基因片段为758bp，与已知猪多杀性巴氏杆菌荚膜b型基因的相似性为99-100％，确定分离到的p11株菌株为猪多杀性巴氏杆菌荚膜b型。
3.3猪多杀性巴氏杆菌p13、p11株的毒力试验
各取用21日龄断奶仔猪50只，随机分10组，其中2组对照组，皮下注射1ml无菌的生理盐水，其他8组分别注射不同剂量的猪多杀性巴氏杆菌p13、p11株，注射后连续观察2周，观察并记录其发病数和死亡数等情况。
猪多杀性巴氏杆菌p13、p11株毒力试验结果如表3，结果显示，皮下注射1×1010cfu猪多杀性巴氏杆菌p13株后，5头试验断奶仔猪均死亡，皮下注射5×108cfu猪多杀性巴氏杆菌p11株后，5头试验断奶仔猪均死亡，表明猪多杀性巴氏杆菌p13株的最小致死量为1×1010cfu/只、猪多杀性巴氏杆菌p11株最小致死量为5×108cfu/只。
表3猪多杀性巴氏杆菌p13、p11株攻毒结果
实施例2一种副猪嗜血杆菌、猪链球菌和猪多杀性巴氏杆菌病的三联灭活疫苗的制备
1.生产用种子制备
一级种子繁殖：将冻干副猪嗜血杆菌血清4型h23株(gdmccno：60722，保藏地方：广东省微生物菌种保藏中心)、副猪嗜血杆菌血清5型h24株(gdmccno：60723，保藏地方：广东省微生物菌种保藏中心)接种于含5％小牛血清中和0.002％nad的tsa中，将冻干猪链球菌血清2型s23株(gdmccno：60724，保藏地方：广东省微生物菌种保藏中心)接种于含5％小牛血清的tsa中，将猪多杀性巴氏杆菌荚膜a型p13株(gdmccno：60720，保藏地方：广东省微生物菌种保藏中心)、猪多杀性巴氏杆菌荚膜b型p11株(gdmccno：60721，保藏地方：广东省微生物菌种保藏中心)接种于含5％小牛血清的tsa中，置36-37℃生化培养箱培养18-24小时选取生长良好的单菌落，再接种于tsb营养培养基中，在生化培养箱36-37℃培养14-18小时，作为一级种子，并于2-8℃保存，传代不超过5代。
二级种子繁殖：分别取上述副猪嗜血杆菌血清4型h23株、副猪嗜血杆菌血清5型h24株、猪链球菌血清2型s23株、猪多杀性巴氏杆菌荚膜a型p13株、猪多杀性巴氏杆菌荚膜b型p11株的一级种子接种于tsb含5％小牛血清中，其中副猪嗜血杆菌血清4型h23株、副猪嗜血杆菌血清5型h24株接种于含5％小牛血清和0.002％nad的tsb培养基中，36-37℃培养12-16小时，按现行《中国兽药典》附录取样作纯粹检验合格后作为二级种子，立即置2-8℃保存，使用期不超过4日。
2.制苗用培养基：商售tsb液体培养基。
3.制苗用菌液制备
按培养量的1-2％分别接种副猪嗜血杆菌血清4型、副猪嗜血杆菌血清5型、猪链球菌血清2型、猪多杀性巴氏杆菌荚膜a型、猪多杀性巴氏杆菌荚膜b型的二级种子液，36-37℃培养12-20小时。
4.纯粹检验：菌液培养完成后，现行《中国兽药典》附录作纯粹检验，应纯粹。
5.活菌计数：按现行《中国兽药典》附录作活菌计数，计数结果作为配苗时参考的培养菌数。
6.灭活：分别取经步骤2培养获得的副猪嗜血杆菌血清4型、副猪嗜血杆菌血清5型、猪链球菌血清2型、猪多杀性巴氏杆菌荚膜a型、猪多杀性巴氏杆菌荚膜b型的二级种子液，按总量的0.1％-0.15％缓慢加入β-丙内酯溶液，经4℃灭活72小时，期间搅拌数次，再于37℃水浴2小时，将灭活剂进行水解。或按菌液总量的0.4％缓慢加入甲醛溶液，经37℃灭活24小时，期间颠倒混匀灭活液数次。按现行《中国兽药典》附录作灭活检查，应无菌生长。
7.浓缩：将灭活后的上述五种菌液经浓缩后，用0.9％nacl溶液或pbs重悬菌体，使细菌含量相当于灭活前活菌数为5×109cfu/ml。
8.配苗：取上述经灭活浓缩的副猪嗜血杆菌血清4型h23株、副猪嗜血杆菌血清5型h24株、猪链球菌血清2型s23株、猪多杀性巴氏杆菌荚膜a型p13株和b型p11株菌液按体积比1:1:1:1:1混合，将灭活浓缩的抗原与纳米铝胶或常规氢氧化铝胶、无菌0.9％生理盐水、硫柳汞混合于乳化机充分搅拌，混合，所述疫苗组分如表4。
表4灭活疫苗组分
注：“/”表示未添加。
9.半成品检验：经灭活加佐剂后，按现行《中华人民共和国兽药典》附录取样作无菌检验，应无菌生长。
10.分装：经无菌检验合格后，进行组批分装，分装时搅拌均匀，分装，盖上瓶盖，并压铝盖。
实施例3三联灭活疫苗的无菌检验和安全检验
材料：疫苗1和疫苗2。其中分别按照两种灭活方式灭活各菌液制备疫苗2，按照疫苗2组分制备，制备方法同实施例2。
第一种灭活方式采用β-丙内酯溶液作为灭活剂灭活各菌液，具体方式为：按菌液总量的0.1％-0.15％缓慢加入β-丙内酯溶液，经4℃灭活72小时，期间搅拌数次，再在37℃水浴2小时，将灭活剂进行水解；
第二种灭活方式为采甲醛溶液作为灭活剂灭活各菌液，具体方式为：按菌液总量的0.4％缓慢加入甲醛溶液，经37℃灭活24小时，期间颠倒混匀灭活液数次。
疫苗1灭活采用β-丙内酯溶液作为灭活剂灭活各菌液，具体方式为：按菌液总量的0.1％-0.15％缓慢加入β-丙内酯溶液，经4℃灭活72小时，期间搅拌数次，再在37℃水浴2小时，将灭活剂进行水解；
1、无菌检验
按现行《中国兽药典》附录取样作无菌检验，结果显示各灭活疫苗均应无菌生长。
2、靶动物安全检验
用体重18-22g的spf昆明小鼠，每组10只，分别皮下注射体积0.5ml灭活剂不同的疫苗2，观察10日；同时用21日龄断奶仔猪，随机分组，每组5只，各颈部肌肉注射双倍疫苗剂量4ml，其余10头为对照组，观察14日。
3、结果
按现行《中国兽药典》附录取样作无菌检验结果见表5，结果显示各灭活疫苗均无菌生长，表明各疫苗无菌检验合格。
表5无菌检验结果
靶动物安全检验结果见表6，结果显示小鼠各皮下注射疫苗0.5ml，小鼠全部健活，表明疫苗安全可靠；断奶仔猪肌肉注射灭活剂不同的疫苗结果如表5所示，断奶仔猪全部健活，体温精神饮食正常，注射采用β-丙内酯灭活疫苗的奶猪局部无不良反应，剖杀后，各脏器无异常病变，而注射采用甲醛灭活疫苗后，有2头断奶仔猪注射部位出现红疹、皮下结节并有接触性过敏，表明注射β-丙内酯灭活的疫苗安全性好，故效力检用疫苗采用β-丙内酯灭活。
表6灭活剂不同的疫苗的靶动物安全检验
对断奶仔猪注射双倍佐剂不同的疫苗结果如表7，结果显示，注射采用纳米铝为佐剂的疫苗，其局部无不良反应，剖杀后，各脏器无异常病变，而注射用常规氢氧化铝胶佐剂疫苗的断奶仔猪注射部位有2例出现红疹、皮下结节，表明纳米铝为佐剂的疫苗吸收较好，无不良反应。
表7佐剂不同的疫苗的靶动物安全检验
实施例4三联灭活疫苗的效力检验
1材料与方法
材料：疫苗1和疫苗2
方法：选择健康易感的21日龄断奶仔猪75头，随机分为3组，2个免疫组和1个对照组，每组25头。免疫组首免分别肌肉注射疫苗1和疫苗2各2ml，含1个注射剂量，21天后按同样操作二免，二免后14天，分别用猪嗜血杆菌h23株(hps-4)、副猪嗜血杆菌h24株(hps-5)、猪链球菌2型s23株(ss-2)、猪多杀性巴氏杆菌p13株(pm-a)和猪多杀性巴氏杆菌p11株(pm-b)毒株进行攻毒，攻毒后观察14天统计结果。免疫组断奶仔猪4/5以上保护，对照组断奶仔猪4/5以上发病，判为免疫合格。
2结果
各菌株攻毒结果如表8，结果显示，疫苗1和疫苗2经副猪嗜血杆菌h23株、副猪嗜血杆菌h24株、猪链球菌2型s23株、猪多杀性巴氏杆菌p13株、猪多杀性巴氏杆菌p11株攻毒后，结果均表现出免疫组断奶仔猪4/5以上保护，对照组断奶仔猪4/5以上发病或死亡，表明疫苗1和疫苗2在副猪嗜血杆菌4型和5型、猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌a型和b型菌株效力检验均合格，其中采用纳米铝佐剂的疫苗2对上述五种菌株效力检验均达到5/5保护(100％)，而采用常规氢氧化铝佐剂的疫苗1对上述五种菌株效力检验均达到4/5保护(80％)，表明采用纳米铝佐剂的疫苗比采用常规氢氧化铝佐剂的疫苗作用效果强。
表8疫苗效力检验结果
实施例5副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪多杀性巴氏杆菌病三联灭活疫苗与单联灭活疫苗、二联灭活疫苗效力检验比较
1.材料：疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗6、疫苗7和疫苗8
2.方法
选择健康易感的21日龄断奶仔猪，免疫组首免分别肌肉注射疫苗2ml，含1个注射剂量，21天后按同样操作进行二免，二免后14天，用用副猪嗜血杆菌4型和5型、猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌a型和b型的各个强毒株进行攻毒；攻毒后观察14天统计结果，试验分组及攻毒菌株如表9。
表9实验分组及攻毒菌株
3.结果
副猪嗜血杆菌、猪链球菌、猪多杀性巴氏杆菌三联灭活疫苗与单联灭活疫苗、二联灭活疫苗效力检验比较结果见表10，结果显示，三联灭活疫苗、单联灭活疫苗和二联灭活疫苗在副猪嗜血杆菌4型、猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌a型和b型菌株强毒攻毒时，对断奶仔猪免疫保护率没有明显差异，但是在副猪嗜血杆菌5型和猪多杀性巴氏杆菌b型菌株强毒攻毒时，三联灭活疫苗对断奶仔猪免疫保护率上优于单联灭活疫苗和二联灭活疫苗；在副猪嗜血杆菌5型和猪多杀性巴氏杆菌b型菌株攻毒部分，三联灭活疫苗对断奶仔猪免疫保护率均为10/10，而二联灭活疫苗保护率对断奶仔猪免疫保护率均为9/10，因此在副猪嗜血杆菌5型和猪多杀性巴氏杆菌b型菌株攻毒的免疫效率上，三联灭活疫苗优于二联灭活疫苗和单联灭活疫苗。从接种剂量比较，三联灭活疫苗一针注射2ml，而单联灭活疫苗或二联灭活疫苗至少打2针共4ml，故本发明提供的三联灭活疫苗使用更为方便、省时省力。
表10副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪多杀性巴氏杆菌病三联灭活疫苗与单联灭活疫苗、
二联灭活疫苗效力检验比较比较
由上述免疫攻毒试验结果可以看出，相对单联、二联灭活疫苗，本发明提供的副猪嗜血杆菌病、猪链球菌病、猪多杀性巴氏杆菌病三联灭活疫苗均能对副猪嗜血杆菌、猪链球菌、猪多杀性巴氏杆菌攻毒提供很好的免疫保护，说明本发明提供的三联灭活疫苗具有良好的保护作用。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。