纳米超声造影剂及其制备方法与流程

本发明属于医学超声造影剂领域，尤其涉及一种纳米超声造影剂及其制备方法。

背景技术：

超声造影技术是当今医学影像学领域发展最快的技术之一，它是通过静脉或皮下注射超生微泡造影剂(超声微泡造影剂颗粒直径小于红细胞)，增强组织器官显像，达到提高超声诊断与鉴别疾病的目的。超声造影由于拥有无放射性辐射、操作简单方便、实时显像等优势，极具发展潜力。而超声造影剂是超声造影的发展基础与关键，随着超声造影剂的不断改进与革新，超声分子影像学也应运而生，利用超声微泡造影剂，可对体内组织器官围观病变进行分子水平成像，对疾病的诊断、治疗及药物递送系统的研发，均具有十分重要的意义。

近年来生物纳米技术的迅猛发展使超声成像在肿瘤诊断及治疗方面发生了重大变化。超声分子成像技术和生物纳米技术的结合使超声造影剂从微米级进入纳米级。目前临床常规使用的超声造影剂声诺维(sonovue)，又名注射用六氟化硫微泡，是有包膜包裹六氟化硫气体的微米级气泡，微泡平均直径2-4μm，能够自由通过肺循环，但毛细血管内皮间隙约为380-780nm，微泡并不能透过血管内皮，故只能在血管内进行血池成像，临床应用有一定局限性。与微米级超声造影剂相比，纳米级超声造影剂粒径更小，能够穿透血管内皮，若被靶向配体修饰则可在血管外特定的靶区聚集。肿瘤是超声造影的主要适应症，通常肿瘤新生血管结构不完善，基膜不完整，管壁薄且缺乏平滑肌层，血管通透性较正常血管明显升高，且肿瘤周围的淋巴循环不良，因此纳米级超声造影剂能通过epr效应(enhancedpermeabilityandretention)在肿瘤组织内积聚较长时间。研究表明，大多数肿瘤微血管管壁的最大孔径为380-780nm。因此，基于新型纳米级超声造影剂分子量小、穿透力强等优势，有可能克服常规超声造影剂的弊端，实现肿瘤的血管外显影。

现阶段研究较多的纳米级超声颗粒主要包括声学脂质体、氟碳纳米液滴、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)，plga)等。其中声学脂质体主要是通过对脂质体进行冻干处理，气体成分依靠大气压渗透获得；氟碳纳米液滴是通过纳米颗粒内部包裹可液气相变的液态氟碳材料，常温状态下氟碳材料为液态，颗粒为微纳米尺寸，通过激光或高强度超声等外部刺激后内部包裹的氟碳由液态转变为气态从而达到在超声下成像的目的。上述这些纳米颗粒在许多文献中都有报导，表现出超声成像和其他治疗性应用的潜力。但实践中不难发现，这些材料的制备过程繁琐，且制作过程中使用氯仿等对人体有害物质，生物安全性差。此外，声学脂质体由于其内部气体含量不一，且体内稳定性差易于泄漏，导致成像效果不佳；氟碳纳米液滴可有的超声成像性能，但其成像需要高强度超声的刺激使其相变转化为微泡，并不适用于多种疾病的成像。更重要的是，上述纳米颗粒都为化学方法合成，均存在粒径不均一，稳定性差、容易破裂、难以长期保存，细胞毒副作用大，制备工序复杂等问题。因此，我们仍需寻找一种声学响应性优良、稳定性佳、生物安全性高且制备工艺简便的纳米超声造影剂作为造影介质，同时达到超声成像图质量的最优化和生物安全性的最大化。

事实上，早在1969年生物学家就发现一些浮游微生物，如古细菌嗜盐杆菌、水华鱼腥藻和微囊藻等细胞结构内存在一种纳米级的蛋白质外壳包被的气囊结构-伪空胞(gasvesicles，gvs)。通过动态调节伪空胞的气囊数，微生物能够控制其浮力，加快上浮速度，使其能够得到更充足的光照和养分。这些gvs宽45-250nm，长100-600nm，呈纺锤形或长杆状，有着一定强度的蛋白质外壳包裹，可以用于超声成像，且研究发现生物合成的gvs在体外和体内均有很好的超声成像效果。然而，目前对合成gvs的微生物进行培养及其体内gvs的提取方法，得到的产泡微生物状态不佳，且提取过程中容易损失大量gvs，效率过低。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种纳米超声造影剂及其制备方法，旨在解决现有技术从培养的微生物中提取gvs时，提取过程中容易损失大量gvs，效率过低的问题。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明一方面提供一种纳米超声造影剂的制备方法，包括以下步骤：

获取能够自主合成伪空胞的浮游微生物，进行传代培养，富集所述浮游微生物；

将富集的所述浮游微生物置于培养基中，静置处理，收集浮在所述培养基上层的浮游微生物；

在所述浮游微生物中加入裂解液，混匀处理后，在离心力为280g～320g、温度为3℃～5℃的条件下进行第一次离心处理，离心时间为3.5h～4.5h，收集含有所述浮游微生物和乳白色伪空胞的上层混合液；在所述上层混合液中加入2～3倍体积的tmc裂解液，混匀处理后在离心力不高于300g、离心时间不长于3h的条件下进行第二次离心处理，裂解目标微生物，并收集上层乳白色的伪空胞；对剩余的溶液重复裂解液裂解-离心处理的操作，直至上层漂浮物全部为乳白色伪空胞；其中，离心处理的步骤中，后一次离心处理的离心力低于前一次离心处理的离心力，且后一次离心处理的离心时间短于前一次离心处理的离心时间。

本发明另一方面提供一种纳米超声造影剂，所述纳米超声造影剂由上述纳米超声造影剂的制备方法制备获得。

本发明提供的纳米超声造影剂的制备方法，将能够自主合成伪空胞的浮游微生物进行传代培养，并通过静置筛选收集产泡的浮游微生物。在所述浮游微生物中加入裂解液，混匀处理后，在离心力为280g～320g、温度为3℃～5℃的条件下进行第一次离心处理，离心时间为3.5h～4.5h。在此条件下，混合溶液分成三层，分别为上层含浮游微生物及以及部分浮游微生物裂解产生的乳白色gvs的上层混合液、中层培养基、以及下层浮游微生物裂解产生的细胞废物及培养基杂质。通过第一次离心处理，可以将微生物培养体系中的大量杂质进行去除，并达到初步裂解浮游微生物的目的，为浮游微生物的完全裂解提供良好的条件。进一步的，在所述上层混合液中加入2～3倍体积的裂解液，混匀处理后在离心力不高于300g、离心时间不长于3h的条件下进行第二次离心处理，通过低渗冲击法使没有裂解的浮游微生物充分释放出乳白色gvs，并富集在混合液上层；对剩余的溶液重复加入裂解液-离心处理的操作，直至离心处理后的下层溶液无色透明，上层漂浮物全部为乳白色伪空胞。本发明通过先除杂后多次裂解的方式，可以提高裂解效率，并充分提取浮游微生物中的gvs，提高gvs的提取率；同时，采用逐步缩减离心强度的多重离心方式进行分离纯化，降低离心处理对gvs的影响，减少提取纯化过程中gvs的损失，进一步提高gvs的提取率，得到高纯高产的gvs。

通过本发明方法制备得到的纳米超声造影剂，不仅制备得到的样品生物纳泡(伪空泡)产量更大，声学响应性高，超声成像效果好，能在二维模式及contrast模式下清晰显影；而且提高了超声造影的生物安全性能和稳定性能，储存时间更长，使纳米超声造影剂的产业化成为可能，有着广阔的发展前景。

本发明提供的纳米超声造影剂，来源于浮游微生物的伪空胞，由生物壳蛋白包裹空气构成，其不仅声学响应性高，超声成像效果好，能在二维模式及contrast模式下清晰显影；而且具有较高的超声造影的生物安全性能和稳定性能，储存时间更长，使纳米超声造影剂的产业化成为可能，有着广阔的发展前景。

附图说明

图1为本发明实施例1与对比例1提供的提供浮游微生物培养方法培养得到的浮游微生物效果图；

图2为本发明实施例2提供的从微生物中提取并纯化出纳米造影剂的步骤示意图；

图3为本发明实施例3制备的微生物合成纳米造影剂材料halogvs的透射电镜图。

图4为本发明实施例3制备的微生物合成纳米造影剂材料halogvs的粒径分布及电位图；

图5为本发明本发明实施例4配置的微生物合成纳米造影剂的contrast模式成像图的体外超声成像图；

图6为本发明本发明实施例4配置的微生物合成纳米造影剂体外超声成像的a,u值定量分析图；

图7为本发明本发明实施例4配置的微生物合成纳米超声造影剂的细胞毒性分析图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

本发明实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本发明实施例说明书公开的范围之内。具体地，本发明实施例说明书中所述的重量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。

本发明实施例提供了一种纳米超声造影剂的制备方法，包括以下步骤：

s01.获取能够自主合成伪空胞的浮游微生物，进行传代培养，富集所述浮游微生物；

s02.将富集的所述浮游微生物置于培养基中，静置处理，收集浮在所述培养基上层的浮游微生物；

s03.在所述浮游微生物中加入裂解液，混匀处理后，在离心力为280g～320g、温度为3℃～5℃的条件下进行第一次离心处理，离心时间为3.5h～4.5h，收集含有所述浮游微生物和乳白色伪空胞的上层混合液；在所述上层混合液中加入2～3倍体积的裂解液，混匀处理后在离心力不高于300g、离心时间不长于3h的条件下进行第二次离心处理，裂解目标浮游微生物，并收集上层乳白色的伪空胞；对下层溶液重复加入tmc裂解液-离心处理的步骤，直至离心处理后的上层漂浮物全部为裂解出的乳白色伪空胞；其中，离心处理的步骤中，后一次离心处理的离心力低于前一次离心处理的离心力，且后一次离心处理的离心时间短于前一次离心处理的离心时间。

本发明实施例提供的纳米超声造影剂的制备方法，将能够自主合成伪空胞的浮游微生物进行传代培养，并通过静置筛选收集产泡的浮游微生物。在所述浮游微生物中加入裂解液，混匀处理后，在离心力为280g～320g、温度为3℃～5℃的条件下进行第一次离心处理，离心时间为3.5h～4.5h。在此条件下，混合溶液分成三层，分别为上层含浮游微生物及以及部分浮游微生物裂解产生的乳白色gvs的上层混合液、中层培养基、以及下层浮游微生物裂解产生的细胞废物及培养基杂质。通过第一次离心处理，可以将微生物培养体系中的大量杂质进行去除，并达到初步裂解浮游微生物的目的，为浮游微生物的完全裂解提供良好的条件。进一步的，在所述上层混合液中加入2～3倍体积的tmc裂解液，混匀处理后在离心力不高于300g的条件下进行第二次离心处理，通过低渗冲击法使没有裂解的浮游微生物充分释放出乳白色gvs，并富集在混合液上层；对下层溶液重复加入tmc裂解液-离心处理的步骤，直至离心处理后的上层漂浮物完全为裂解出的乳白色伪空胞，且下层溶液无色透明。本发明通过先除杂后多次裂解，可以提高裂解效率，并充分提取浮游微生物中的gvs，提高gvs的提取率；同时，采用逐步缩减离心强度的多重离心方式进行分离纯化，降低离心处理对gvs的影响，减少提取纯化过程中gvs的损失，进一步提高gvs的提取率，得到高纯高产的gvs。

通过本发明实施例方法制备得到的纳米超声造影剂，不仅制备得到的样品生物纳泡(伪空泡)产量更大，声学响应性高，超声成像效果好，能在二维模式及contrast模式下清晰显影；而且提高了超声造影的生物安全性能和稳定性能，储存时间更长，使纳米超声造影剂的产业化成为可能，有着广阔的发展前景。

具体的，上述步骤s01中，获取能够自主合成伪空胞的浮游微生物，此处，所述自主合成伪空胞的浮游微生物是指能够在微生物体内自主合成被纳米级的蛋白质外壳包被的气囊结构-伪空胞的微生物，该类微生物由于能够通过调节体内伪空胞的气囊数，因此能够控制浮力，实现浮游。本发明优选实施例中，所述浮游微生物选自嗜盐杆菌等浮游细菌或淡水浮游藻类，其中，所述淡水浮游藻类包括微囊藻、束丝藻、水华鱼腥藻。上述浮游微生物都能在体内自主合成伪空胞，且具有较高的生物安全性，提取过程中不会造成操作安全隐患，更重要的是，可以从源头提高gvs的生物安全性，提高其作为纳米超声造影剂时的使用安全性。

能够自主合成伪空胞的浮游微生物，来源于提取出来的新鲜菌液，但作为产业化生产时，所述浮游微生物通常来源于实现提取并冻存保管的微生物原液。

本发明实施例中，对所述浮游微生物进行传代培养，为所述浮游微生物快速生长提供良好的环境，提高微生物状态。

在优选实施例中，获取能够自主合成伪空胞的浮游微生物，进行传代培养的步骤，包括：

s011.获取能够自主合成伪空胞的浮游微生物原液，加入经消毒处理的微生物培养基中形成培养液，在温度为37℃～42℃、转速为120rpm～160rpm的条件下无菌培养，直至培养液变为粉白色；

s012.将所述培养液分成多份后，补充新鲜的培养基继续培养，直至培养液再次变为粉白色，重复步骤0～n次，富集所述浮游微生物，其中，所述n为自然数。

上述步骤s011中，提供能够自主合成伪空胞的浮游微生物原液和用于培养所述浮游微生物的培养基，将所述培养基进行消毒处理，杀灭培养基中的微生物，为所述浮游微生物的培养提供安全环境。其中，消毒处理采用常规的高温高压消毒处理。在一些实施例中，将所述浮游微生物加入经高温高压消毒处理的微生物培养基中形成培养液中，控制微生物原液和培养基的体积比，使加入所述微生物原液后的培养液中，微生物的菌体浓度为2×10⁵cfu/m～2×10⁶cfu/ml。此时，培养基中浮游微生物的含量在合适范围内，可以保证浮游微生物在营养相对充足、菌体密度核实的条件下进行快速生长。若加入所述微生物原液后的培养液中，浮游微生物的浓度低于2×10⁵cfu/ml，则由于菌体过稀，而菌体过稀的浮游微生物难以快速生长；若加入所述微生物原液后的培养液中，浮游微生物的浓度高于2×10⁶cfu/ml，则细菌培养后期培养基含量相对较低，微生物的营养难以供给快速增长的浮游微生物的需求，同样会降低浮游微生物的培养质量。作为一个具体实施例，控制微生物原液和培养基的体积比为1:100-1:250，将所述浮游微生物加入经消毒处理的微生物培养基中形成培养液中。

进一步的，在温度为37℃～42℃、转速为120rpm～160rpm的条件下无菌培养，直至培养液变为粉白色，培养时间约为10天。此时，所述浮游微生物处于指数生长期前期，数量上呈快速生长趋势，且本身具有较好的生长活力和菌体质量，因此，选择此时将所述浮游微生物进行富集后传代处理，并补充新鲜培养基，在维持微生物良好活性的同时，达到扩大培养、产业化的目的。此外，通过该方法，也可以实现对优势浮游微生物的筛选。

在具体优选实施例中，将所述浮游微生物加入经消毒处理的微生物培养基中培养的条件为：在温度为42℃、转速为130rpm的条件下无菌培养，直至培养液变为粉白色，培养时间约为10天。

上述步骤s012中，将富集的所述培养液进行传代处理，具体的，将所述培养液分成多份后，补充新鲜的培养基继续培养，可以提高培养液中的营养成分，去除菌体代谢产生的废物，从而降低对所述浮游微生物生长的抑制作用，促进所述浮游微生物的快速增加，并获得产泡(生产伪空胞)更佳的所述浮游微生物。传代培养直至培养液再次变为粉白色，重复该传代步骤0～n次，从而短时间内富集更多浮游微生物，实现产业化。在一些实施例中，将所述培养液分成2-4份后，补充新鲜的培养基继续培养，从而获得更加的培养效率，能够富集更多的浮游微生物。可以重复传代的步骤1-3次，高效富集更多浮游微生物。

通过上述方法培养所述浮游微生物，得到的浮游微生物状态更佳，并且能产业化量产。

作为一个具体优选实施例获取能够自主合成伪空胞的浮游微生物，进行传代培养的步骤，包括：

获取能够自主合成伪空胞的浮游微生物原液，加入经消毒处理的微生物培养基中形成培养液，使培养液中微生物的菌体浓度为2×10⁵cfu/m～2×10⁶cfu/m，在温度为42℃、转速为130rpm的条件下无菌培养，直至培养液变为粉白色；将所述培养液分成两份，分别补充新鲜的培养基后继续培养，直至培养液再次变为粉白色，重复步骤0～n次，富集所述浮游微生物，其中，所述n为小于等于3的自然数。

使用该种方法培养并提取的纳米气泡gvs粒径微小且均一，稳定性高，能够穿透血管内皮，并因epr效应在肿瘤组织中积聚，长期超声显影。

上述步骤s02中，将富集的所述浮游微生物置于培养基中，静置处理，此时，浮游微生物为了得到更充足的光照和养分，通过动态调节伪空胞的气囊数控制其浮力，加快上浮速度，从而浮在培养基的上层，收集浮在所述培养基上层的浮游微生物，由此，实现优势产泡浮游微生物的筛选。

作为优选实施例，将富集的所述浮游微生物置于培养基中，静置处理，收集浮在所述培养基上层的浮游微生物的步骤包括：

s021.将富集的所述浮游微生物置于经消毒处理的分液容器中，静置3-4天，直到分液容器中的液体上层出现浮游微生物层，从所述分液容器中分离出上层优势浮游生物层及下层培养液。

该步骤中，将富集的所述浮游微生物置于经消毒处理的分液容器中，所述分液容器可将经静置后浮在液体上层的浮游微生物层从培养基中分离出来，优选但不限于分液漏斗。为了给所述浮游微生物层提供良好的产泡环境，并充分获取产泡效能高的浮游微生物，将盛装浮游微生物的分液容器静置处理，该期间不能移动、晃动或震荡分液容器，静置时间为3-4天。此时，体内含有较多气囊结构的优势浮游微生物群体上浮，集中在液层表面。通过分离上层优势浮游生物层及下层培养液，收集浮在所述培养基上层的优势浮游生物层，可以筛选得到体内含有较多气囊结构的优势浮游微生物群体。

s022.将下层培养液再次倒入清洗后的分液容器中，静置处理，直到分液容器中的液体上层出现浮游微生物层，再次从培养液中分离出优势群体，重复该步骤1～3次。

进一步优选的，在步骤s021收集优势浮游生物层后，将下层培养液再次置于清洗后的分液容器中，重复静置处理的步骤，再次从培养液中筛选出优势群体，此步骤根据培养液量可以重复2-4次。其中，清洗后的分液容器可以为经消毒处理后的分液容器。实验发现，尽管第一次静置处理能够富集大量优势浮游微生物，但是，将静置筛选后的下层培养液再次静置处理后，仍能有大量产泡微生物上浮。通过多次静置处理能够大大提高每批浮游微生物中气囊的产量，缩短气囊的获取时间，提高效率，节省成本。

上述步骤s03中，在所述浮游微生物中加入裂解液，混匀处理后，进行第一次离心处理。第一次离心处理用于将混合体系进行纯化，将培养基中的杂质、以及纯化过程中少了浮游微生物裂解产生的细胞废物进行去除，纯化浮游微生物及其gvs的纯度。具体的，第一次离心处理的条件为：在离心力为280g～320g、温度为3℃～5℃的条件下，离心时间为3.5h～4.5h。更优选的，第一次离心处理的条件为：在离心力为300g、温度为4℃的条件下，离心时间为4h。通过上述条件的第一次离心处理，可以将容器中的混合体系离心分为三层，依次为：浮游微生物及乳白色gvs的上层、培养基中层、裂解的细胞废物及培养基杂质构成的下层，且下层物质紧密黏附在容器底部。分离中下层物质，收集上层漂浮裂解物中加入等量pbsbuffer保存。其中，中下层物质可以通过注射器吸出。

本发明实施例中，所述裂解液选用tmc裂解液、质量百分含量为10％～50％的蔗糖溶液。优选的，所述裂解液选用裂解效果更优秀的tmc裂解液。所述tmc裂解液为包含10mmtris-hcl，2.5mmmgcl2和2mmcacl2，且ph为7.5的混合溶液。

优选的，在所述浮游微生物中加入裂解液的步骤中，按照浮游微生物与所述裂解液的体积比为1:(1～1.5)的比例，在所述浮游微生物中加入tmc裂解液。此时，由于第一次离心处理的步骤主要是为了去除培养基杂质及初步裂解，所以加入tmc裂解液量并不需要过大。若tmc裂解液含量过高，离心后溶液体系更为复杂，不仅难以实现高效分离，而且由于gvs对气压冲击较敏感，上述离心条件及过度震荡都容易造成gvs的破裂，损失大量的gvs，因此，此处，通过调控浮游微生物与所述tmc裂解液的体积比为1:(1～1.5)，在控制裂解液用量的同时使微生物细胞高效裂解。更优选的，按照浮游微生物与所述tmc裂解液的体积比为1:1的比例，在所述浮游微生物中加入tmc裂解液。即在所述浮游微生物中加入tmc裂解液的步骤中，在所述浮游微生物中加入等体积的tmc裂解液。

作为优选实施例，将裂解液特别是tmc裂解液先加入到上述步骤s02收集完浮在所述培养基上层的浮游微生物后的容器中，洗涤粘附在分液容器壁上的微生物后，再将洗涤液加入分离出的浮游微生物中，充分混匀。

进一步的，将经第一次离心处理后分离形成的上层混合液收集后，加入2～3倍体积的裂解液，进行第二次离心处理。所述第二次离心处理加入在上层混合液中加入过量的裂解液，通过低渗冲击法，裂解所述浮游微生物，释放所述浮游微生物体内的伪空胞。由于该步骤加入裂解液后，浮游微生物体内的伪空胞大量释放，而伪空胞气囊内压力较大，容易破裂，因此，本发明实施例需要控制离心条件，至少保证离心力不高于300g、离心时间不长于3h。

收集上层乳白色的伪空胞后，对剩余的溶液重复裂解液裂解-离心处理的操作，直至上层漂浮物全部为乳白色伪空胞。其中，“解液裂解-离心处理”的操作是指与“在所述上层混合液中加入2～3倍体积的裂解液，混匀处理后在离心力不高于300g、离心时间不长于3h的条件下进行第二次离心处理，裂解目标浮游微生物，并收集上层乳白色的伪空胞”相同的操作步骤。其中，离心处理的步骤中，后一次离心处理的离心力低于前一次离心处理的离心力，且后一次离心处理的离心时间短于前一次离心处理的离心时间。本发明实施例采用逐渐降低离心能量及缩短离心时间的方法对gvs进行纯化，可以显著减少纯化过程中gvs的损失。对下层溶液重复加入tmc裂解液-离心处理的步骤，直至离心处理后的下层溶液无色透明，上层漂浮浮游微生物完全裂解为乳白色gvs，充分收集浮游微生物释放的gvs，提高gvs的产量。

本发明实施例中，进一步优选的，将收集的伪空胞置于试样管中，并用pbs缓冲液保存。为了避免试样管的盖子在盖合过程中，gvs受气的冲击而破裂，本发明实施例使用封口膜如封口胶对所述试样管的管口进行密封。采用该方式，省去开关盖子的步骤，从而可以避免开关试样管的上盖产生的气压冲击对gvs造成破损，延长gvs的保存时间。

综上，本发明实施例内能够自合成蛋白质外壳包裹的含空气气囊结构-伪空胞(gvs)的浮游微生物，通过低渗冲击方法对微生物细胞进行裂解，使gvs释放，再使用低速离心方法对其进行分离纯化，所获的纳米级超声造影剂gvs因其内含有空气，在超声辐照下能成为散射介质，有良好的声学响应性能，能超声显像。

本发明实施例过程中，所采用的试剂如tmc裂解液均为常见无机盐溶液，对生物无害，因此，可以提高微生物合成纳米超声造影剂的安全性能。

作为本发明最佳实施例，所述纳米超声造影剂的制备方法，包括以下步骤：

获取能够自主合成伪空胞的浮游微生物原液，加入经高温高压消毒处理的微生物培养基中形成培养液，使培养液中微生物的菌体浓度为2×10⁵cfu/m～2×10⁶cfu/m，在温度为42℃、转速为130rpm的条件下无菌培养，直至培养液变为粉白色；将所述培养液分成两份，分别补充新鲜的培养基后继续培养，直至培养液再次变为粉白色，重复步骤0～n次，富集所述浮游微生物；

将富集的所述浮游微生物置于干净的分液容器中，静置3-4天，直到分液容器中的液体上层出现浮游微生物层，从所述分液容器中分离出上层优势浮游生物层及下层培养液；将下层培养液再次倒入清洗干净的分液容器中，静置处理，直到分液容器中的液体上层出现浮游微生物层，再次从培养液中分离出优势群体，重复该步骤1～3次，收集浮在所述培养基上层的浮游微生物；

在所述浮游微生物中加入等体积的将tmc裂解液，混匀处理后，在离心力为300g、温度为4℃的条件下进行第一次离心处理，离心时间为4h，使混合溶液分成三层，收集含有所述浮游微生物和乳白色伪空胞的上层混合液；在所述上层混合液中加入2倍体积的tmc裂解液，混匀处理后进行第二次离心处理，裂解目标浮游微生物，并收集上层乳白色的伪空胞；对下层溶液重复加入tmc裂解液-离心处理的步骤，直至离心处理后的上层漂浮物全部为裂解出的乳白色伪空胞，且下层溶液无色透明；且离心处理的步骤中，后一次离心处理的离心力低于前一次离心处理的离心力，且后一次离心处理的离心时间短于前一次离心处理的离心时间；

将所述伪空胞置于试样管，并用pbs缓冲液保存，使用封口膜对所述试样管进行密封。

本发明实施例方法在培养过程中不易受污染，并且采用低渗冲击方法裂解提取，其具有优良的生物降解性、生物相容性和无毒性，并且培养条件设置简便，提取纯化过程简单，可大规模量产。

本发明实施例制备得到的伪空胞气囊结构，由一定强度的蛋白质外壳包裹空气形成，宽45nm-250nm，长100nm-600nm，呈纺锤形或长杆状，可应用于超声成像造影。超声波遇见壳蛋白包裹气体形成的气囊时就会发生散射，出现云雾状的回声；并且，由于其粒径均一微小、稳定性高，在注射入血池后，能够穿透血管内皮，并且因epr效应在肿瘤组织中积聚，在超声二维及造影模式下皆能清晰显影，且对比明显、影像清晰，在超声下较长时间显影，是优秀的新一代纳米级超声造影剂，为纳米级超声造影材料的临床应用另辟蹊径。

相应的，本发明实施例提供了一种纳米超声造影剂，所述纳米超声造影剂由上述纳米超声造影剂的制备方法制备获得。

本发明实施例提供的纳米超声造影剂，来源于浮游微生物的伪空胞，由生物壳蛋白包裹空气构成，其不仅声学响应性高，超声成像效果好，能在二维模式及contrast模式下清晰显影；而且具有较高的超声造影的生物安全性能和稳定性能，储存时间更长，使纳米超声造影剂的产业化成为可能，有着广阔的发展前景。

下面结合具体实施例进行说明。

实施例1

浮游微生物的培养方法：

获取盐古菌(halobacteriumsp.npc-1)1ml接种至高盐细菌培养基形成培养液，使培养液中微生物的菌体浓度为2×10⁶cfu/m，在温度为42℃、转速为130rpm的条件下无菌培养，直至培养液变为粉白色；将所述培养液分成两份，分别补充新鲜的培养基后继续培养，直至培养液再次变为粉白色，富集所述浮游微生物。

对比例1

浮游微生物的培养方法，与实施例1的不同之处在于，在温度为42℃、转速为100rpm的条件下无菌培养后，直接富集所述浮游微生物，不进行“将所述培养液分成两份，分别补充新鲜的培养基后继续培养，直至培养液再次变为粉白色”的操作。

对比例1提供的传统培养方法与实施例1提供的改进培养方法所培养得到的halo细菌静置后对比情况可见图1，其中，(a)为实施例1提供的改进培养方法所培养得到的halo细菌；(b)为对比例1提供的改进培养方法所培养得到的halo细菌。由图1可见，按实施例1方法培养的浮游微生物，菌液上层呈现大量漂浮优势菌；而按对比例1传统培养的浮游微生物，菌液上层漂浮优势菌较少。

实施例2

优势浮游微生物的筛选方法：

结合图2，将实施例1培养后的halo菌液倒入分液漏斗中，绝对静置约3-4天(不能震动或移动)，直到菌液上层漂浮一层粉白色环状层，此层为菌体内含有较多气囊结构的优势菌群。打开分液漏斗下面阀门，将位于漏斗底部最下层的沉淀(培养基杂质、死细菌等)放出弃去，分离出上层优势漂浮菌至50ml离心管中，并保留中层的非优势菌液。彻底清洗分液漏斗后，将中层非优势菌液再次倒入其中，继续静置3-4天，重复上述筛选步骤，重复静置筛选3次。

实施例3

将实施例2中分离出上层漂浮的细菌环至50ml离心管①中，并向分液漏斗中加入与放出细菌环等体积的tmc裂解液(10mmtris-hcl，2.5mmmgcl2和2mmcacl2，ph7.5)，洗涤黏附在分液漏斗瓶壁上的漂浮菌，并加入到离心管①中，轻柔上下颠倒将管中细菌液与裂解液充分混匀，于温度为4℃、离心力为300g的条件下离心4h。离心后可见管中物质分为三层(上层漂浮菌液、中层澄清培养基、下层裂解的细胞废物及培养基杂质，下层物质紧密黏附在管底)。使用注射剂将中层澄清培养基尽量吸净后，将管中剩下物质倒入新的离心管②中。向离心管①中加入适量pbs(约5-6ml)轻柔洗涤黏附在管壁上的漂浮细菌层(注意不要破坏黏附在管底的杂质)，将洗涤液一同倒入离心管②中。将离心管②中液体分装至2mlep管中，每管1.2ml，于温度为4℃、离心力为250g的条件下离心3.5h，此次离心后可见ep管上层白色环状层，为裂解出来的气囊，即纳米气泡halogvs。离心后使用注射器尽量抽净下层澄清溶液，并补入新鲜pbs至1.2ml继续离心，直至离心管下层溶液完全呈澄清无色透明为止。注意每次离心逐渐减低离心转速(如150-250g)，缩短离心时间，并且使用封口膜(paraflim)代替ep管盖子，避免离心能量过大及气压冲击破坏gvs，放入4℃冰箱保存，最长可保存1年以上。

实施例3制备的制备的halogvs的透射电镜图如图3所示，由图可见，halogvs完整，且粒径大小均匀；halogvs的粒径分布及电位图如图4所示，由图可见，所提取的gvs尺寸分布集中在100-400nm，粒径微小。

实施例4

提供实施例3中制备的halogvs，通过加入或去除适量pbsbuffer(去除pbs时需要使用带针注射器插入ep管底部吸取下层pbsbuffer)调定halogvs的浓度，通过酶标仪(波长设定500nm)测定od值(若使用96孔板，每个孔加入100μl样品)，配置od值分别为0.5、0.7、1.0的3个浓度梯度。halogvs造影剂浓度还可以使用纳米颗粒计数仪等进行测定。

测试例1

使用vevo2100超声成像仪对装满halogvs的琼脂仿体孔进行造影，探头对准加样孔。分别在4个孔内加入200μl样品，第1孔内加入pbs作为空白对照，第2-4孔内分别加入实施例4中制备的od值为0.5、0.7、1.0的微生物合成气囊造影剂，加样前充分振荡摇匀，并在二维超声模式下及造影模式下观察其造影情况及测定其回声强度(探头设定：b-mode模式21mhz、contrast成像模式18mhz)。不同浓度微生物合成纳米造影剂体contrast模式成像图的体外超声成像图如图5所示；不同浓度微生物合成纳米造影剂体外超声成像的a,u值定量分析如图6所示。由图5、图6可见，pbs对照孔内在b-mode及contrast模式下都无明显回声，平均回声强度a,u为od500＝0.5、0.7、1.0的造影剂在两个模式下都能清晰成像，平均回声强度a,u随着浓度的增加而提高，分别为1338、3501、4425，在此浓度范围内，浓度越高，超声成像效果越理想。

测试例2

该实施例说明将微生物合成纳米气囊超声造影剂halogvs与sd大鼠骨髓间充质干细胞共孵育6h，检测纳米材料对细胞的毒性。

在96孔板中种植sd大鼠骨髓间充质干细胞(每孔5000个细胞，3个复孔)，铺板过夜。将实施例4配置的od值为0.5、0.7、1.0的造影剂每孔各10微升加入190微升干细胞完全培养基中，混匀后加入96孔板中，与干细胞在37℃恒温培养箱中共同孵育8h。孵育后，弃去培养基，加入100微升cck-8试剂，37℃环境下反应约30min后，使用分光光度计测量吸光度，检测生物合成纳米超声造影剂对细胞的活性影响。不同浓度微生物合成纳米超声造影剂的细胞毒性分析如图7所示，图7表明：当造影剂孵育浓度为0.5-1.0时，对细胞活性没有明显影响，具有良好的生物安全性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。