一种具有电刺激和促血管生成作用的神经修复载药系统的制备方法与流程

本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种具有生物电刺激和促血管生成作用的神经修复载药系统及其制备方法。

背景技术：

长久以来，外周神经损伤尤其是长节段神经缺损一直是神经科学研究里的重要课题，也是医学界亟待解决的难题之一。研究表明，虽然周围神经具有一定的再生能力，但这种再生能力的效能较低容易被周围的疤痕所阻挡，使再生轴突分散最终形成神经瘤。目前，自体神经移植被认为是治疗外周神经损伤的金标准。近年来，随着组织工程学的巨大发展，为周围神经再生带来了新希望。外周神经再生微环境的构建，对于神经损伤后的恢复起着至关重要的作用。现阶段如何有效利用组织工程学修复神经缺损并构建适宜的微环境，是周围神经再生相关领域的研究热点。

随着药物治疗、基因治疗、细胞治疗及组织工程学等技术的突破，周围神经损伤修复技术明显提高。从传统的外科疗法已逐渐改变为多技术、多学科的综合疗法。但由于神经组织高度分化、再生能力低等特点，周围神经损伤修复效果仍不理想。如何促进神经纤维再生、诱导再生神经纤维长入靶组织、加强再生神经纤维与靶组织突触的联系，以及如何降低不利于神经再生的炎性反应、选择有利于神经再生的细胞因子，一直是神经损伤修复研究领域亟待解决的问题。

组织工程系统已成为神经修复领域的热点，其可防止纤维瘢痕组织侵入避免神经瘤的形成，并利用远端神经趋化因子使轴突准确对合，有利于神经再生。神经组织工程的优势在于结合了神经导管和神经生长因子的优势。在导管性能方面，要求其降解能够和神经恢复同步且完全降解，有良好的组织相容性和无毒性，良好的物理机械性能和柔韧性，易于加工成型。在导管结构方面，要求其具有光滑的内表面，避免影响再生神经的生长并且易于细胞生长和黏附，管壁具有选择通透性、多孔性，具有三维网状多腔道立体结构，导管表面能负载生物活性因子从而促进神经生长。在导管功能方面，要求其具有电刺激性，能够从外周组织吸取营养物质。在神经生长因子方面，要求其能有效促进神经再生，提供营养物质，能有效加速神经在各阶段的生长。

电刺激已被证明有利于细胞和生长因子的表达，电刺激可使神经细胞轴突显著增长，可加快神经生长因子诱导的神经细胞分化，可促进神经重建和血管生长等生物过程，其在修复损伤神经中受到越来越多的关注。近期的一些研究还表明，低强度电刺激的效果等同于多种生长因子的作用，能有效增强损伤神经的再生。导电高分子材料作为神经修复材料的优势在于能够使神经恢复电刺激性促进神经再生，氧化石墨烯(go)作为一种导电高分子材料还没有用于神经导管的先例。与其他导电高聚物相比，go不仅具有良好的导电性能，同时具有生物可降解、易加工成型、低毒性以及优良的生物电活性等优点。

此外神经生长因子是一种具有神经元营养和促突触生长双重生物学功能的神经细胞生长调节因子，也是神经修复“微环境”中重要的生物活性物质之一。作为从生物体中提取出的一种生物制剂，神经生长因子对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生，以及功能特性的表达均具有重要的调控作用，极具发展潜力。血管内皮生长因子(vegf)又称血管通透因子，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用，能在神经再生过程中起良好的带动和促进作用。

已经公开的神经导管材料有很多。欧阳元明等人(cn108992712a、cn108939168a)通过3d打印或静电纺丝制得了氧化铈纳米神经导管和褪黑素神经导管，然后在其内部打印或静电纺丝形成了一层生物粘附物质。王欣宇等人(cn107349473a)以聚乳酸、丝素、壳聚糖等为原料，借助静电纺丝技术制得了双层结构的复合神经导管。其他类似技术参见cn103751839b、cn1126515c、cn102727931b等。与上述现有技术相比，本申请将两种不同的纳米纤维结构制备技术(静电纺丝、3d打印)有机结合起来，制得的复合导管在孔隙率、溶胀率和机械性能等方面更有优势，具有更好的取向结构利于引导神经再生。此外本申请还引入了前沿的导电物质应用电刺激治疗神经修复，以及很少有人研究的vegf作为神经生长因子促进神经修复。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有电刺激和促血管生成作用的神经修复载药系统的制备方法，该方法具体包括以下步骤：(a)将明胶溶液与壳聚糖溶液按照一定比例混合，再加入氧化石墨烯悬浮液，所得混合物经3d打印得到复合导管；(b)利用聚乳酸、神经生长因子、有机溶剂配制静电纺丝液，利用静电纺丝液制备复合管；(c)将步骤(b)制得的复合管套装在步骤(a)制得的复合导管外面得到复合神经导管，向复合神经导管内部空腔中填充血旺细胞即可。

进一步的，步骤(a)中明胶溶液的配制方法具体如下：将明胶与去离子水混合后静置，待明胶溶胀后将混合物加热至40-60℃并充分搅拌，得到质量分数为10％-30％的明胶溶液。

进一步的，步骤(a)中壳聚糖溶液的配制方法为：将壳聚糖与乙酸水溶液混合，常温下搅拌均匀即可。配制得到的壳聚糖溶液中壳聚糖的质量分数不超过10％，乙酸质量分数为1％-5％。

进一步的，步骤(a)中氧化石墨烯悬浮液的配制方法具体如下：冰浴条件下，将天然石墨粉、硝酸钠加入到浓硫酸中，再加入一定量高锰酸钾，保持低温搅拌1-5h后升温至30-40℃继续搅拌0.5-2h，然后向混合物中加入适量去离子水并升温至80-98℃继续搅拌0.5-1h，待混合物自然冷却后加入双氧水终止反应，固液分离后将滤饼洗涤至中性并干燥，最后将得到的固体分散在去离子水中先超声剥离再离心分离，得到质量分数为1％-5％的氧化石墨烯悬浮液。

更进一步的，天然石墨粉、硝酸钠、高锰酸钾、浓硫酸的用量比为1.0g:0.1-2g:1-10g:10-30ml。

进一步的，步骤(a)中明胶溶液、壳聚糖溶液、氧化石墨烯悬浮液的体积用量比为5-20:5-20:1。

进一步的，步骤(b)中静电纺丝液的制备方法具体如下：将聚乳酸溶于有机溶剂，再加入神经生长因子，搅拌0.5-2h后超声脱气10min以上即可。该静电纺丝液中聚乳酸的质量分数为5％-20％，神经生长因子的加入量不超过聚乳酸质量的0.1％。

更进一步的，所述有机溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、三氯甲烷、六氟异丙醇中的任意一种，所述神经生长因子具体为vegf。

进一步的，步骤(b)中利用静电纺丝液制备复合管的条件如下：金属喷头与接收板之间的距离为(10-20)cm，电压(9-12)kv，负电压(1-5)kv，正电压流速(0.5-3)ml/h。静电纺丝所得复合管使用前需充分真空干燥。

本发明的另一目的在于提供一种按照上述方法制得的神经修复载药系统。

本发明制得的神经修复载药系统(复合神经导管)是多孔状的，具有三维网状立体结构，其内表面光滑易于细胞生长粘附，多孔结构使其能够从外周组织中吸取营养物质利于神经再生。本发明所选用的天然高分子材料明胶、壳聚糖、聚乳酸都具有良好的生物相容性以及无毒性，并且聚乳酸一方面能够实现导管的力学性能要求，避免神经生长过程中导管坍塌；另一方面还能保证导管柔韧性，不阻碍神经再生；最后聚乳酸还能够满足导管所需要的良好性能，保证导管材料的可加工性。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下几个方面：(1)将导电共聚物go引入到神经导管材料中，使其具有弱导电性，符合人体生理电流所需，有助于加速神经修复；(2)选用了聚乳酸、明胶、壳聚糖、go等多种生物相容性好的材料进行复合，弥补了单一材料性能上的不足，引入的vegf生长因子能够最大程度仿生人体内细胞外基质微环境，从加速微血管再生方向促进神经修复，以期提高神经损伤修复的质量；(3)制得的神经导管满足神经生长所需要的电刺激条件，同时又具备传统导管必须具备的优异生物相容性，其机械强度能够满足支撑神经断处的生理环境，引入的静电纺丝技术保证了纳米级别的取向纤维结构，更适合细胞生长有利于周围神经再生。

附图说明

图1为本发明大鼠神经修复实验结果图。

具体实施方式

为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合具体实施例进行进一步说明。

实施例1

将1.0g天然石墨粉、0.5g硝酸钠加入到三口烧瓶中，将三口烧瓶置于冰浴条件下并缓慢加入23ml浓硫酸，持续搅拌15min后再缓慢加入4g高锰酸钾，保持系统温度不超过20℃继续搅拌2h。移除冰浴后将三口烧瓶内的混合物加热到35℃并持续搅拌1.5h，接着缓慢加入46ml去离子水，维持体系温度在98℃剧烈搅拌30min。将三口烧瓶置于空气中自然冷却，向其中加入140ml去离子水以及10ml双氧水终止反应，此时烧瓶内的悬浮液变成亮黄色。离心分离后，依次用质量分数为5％的hcl水溶液、去离子水充分洗涤滤饼至中性或接近中性，接着冷冻干燥得到棕色氧化石墨烯固体。将该固体分散到去离子水中，得到浓度为1g/l的悬浮液。利用超声对悬浮液中的氧化石墨烯进行剥离，得到氧化石墨纳米片，10000r/pm转速下离心30min除去未剥离氧化石墨，得到质量分数为1％的go悬浮液。

将1.0g明胶(glt)、适量去离子水加入到三角锥瓶后室温静置30min，待明胶充分溶胀后将三角锥瓶转入60℃水浴中加热，充分振荡直到明胶完全溶解，得到质量分数为20％的明胶水溶液。将1.0g壳聚糖(cs)溶解在质量分数为3％的乙酸溶液中，配制成质量分数为3％的壳聚糖溶液。将10ml壳聚糖溶液转移至磁力搅拌器上匀速搅拌3-4h，然后与10ml明胶溶液混合搅拌2h，再加入1mlgo悬浮液继续搅拌1h。所得混合液转入3d打印仪器中，按照程序打印得到特定形状的glt/cs/go导管。

将1.2g聚乳酸(pla)溶于适量二氯甲烷中并搅拌1h，得到质量分数为10％的电纺溶液。将0.5mgvegf掺入到电纺溶液中，磁力搅拌0.5-2h后超声脱气10min。将掺有vegf的电纺溶液加入到10ml注射器中，将注射器与21g不锈钢喷头连接起来，设定喷头与接收板之间距离为15cm，在电压9-12kv、负电压3kv、正电压流速1.0ml/h的条件下进行静电纺丝。所制得的样品真空干燥24h，以便排出残留有机溶剂，最终得到pla/vegf管。按照同样的方法，在不添加vegf的情况下静电纺丝制备pla神经导管，用作大鼠对照实验。

分别切取1.5cm长的pla/vegf管和1.2cm长的glt/cs/go导管，将pla/vegf管套在glt/cs/go导管外面。组装得到的复合管置于紫外照射下灭菌，然后转移到细胞房中进行血旺细胞培养，最后取部分血旺细胞填充在复合导管内部空腔(即glt/cs/go内部)，得到神经修复载药系统。

实施例2

本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：go悬浮液的浓度由1％变为2％，明胶水溶液的浓度由20％变为15％，壳聚糖溶液的浓度由3％变为4％，三者混合的比例不变。

实施例3

本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：go悬浮液的浓度由1％变为3％，明胶水溶液的浓度由20％变为15％，壳聚糖溶液的浓度由3％变为4％，三者混合的比例不变。

实施例4

本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于：go悬浮液的浓度由1％变为2％，明胶水溶液的浓度由20％变为25％，壳聚糖溶液的浓度由3％变为4％，三者混合的比例不变。

为充分了解制得的神经修复载药系统的性能，严格按照国家及国际准则进行了大鼠实验，具体过程如下：

准备健康成年雄性sd大鼠20只，按照随机数字表法分为abcd4组，每组5只。氯胺酮腹腔注射麻醉下，对大鼠右股后外侧行纵形切口，自臀部间隙进入坐骨神经。a组(空白对照组)手术切断坐骨神经后不做任何处理，术后缝皮包扎伤口；b组(自体神经移植组)于大腿中段切取坐骨神经干10-12mm，手术后用切取的自体神经进行原位神经移植术，然后缝皮包扎伤口；c组(pla组)于大腿中段切取坐骨神经干10-12mm，手术后用实施例1制备的常见的pla神经导管桥接修复，两神经断端各插入导管内1mm，保留神经缺损10mm间隙，以9-0丝线缝合管壁与神经外膜，每端3-4针；d组(pla/go/glt组)于大腿中段切取坐骨神经干10-12mm，手术后用实施例1制备的复合神经修复载药系统桥接修复，两神经断端各插入复合导管内1mm，保留神经缺损10mm间隙，以9-0丝线缝合管壁与神经外膜，每端3-4针。术后分笼统一标准饲养。

第1、2、3周对各组大鼠进行行为学功能性分析，得到大鼠足迹图。移植完成后分别于第1、2、3周采集各组大鼠术侧脚印，结果如图1所示。由图1结合3周后各组大鼠术侧脚印实际伸张情况可知：pla/go/glt组和自体神经移植组的大鼠脚印形态接近，明显优于空白对照组和pla组，其脚印较宽且五指正常伸展。这说明本发明方法制得的pla/go/glt复合神经导管对大鼠坐骨神经缺损的修复具有较好的效果。