一种油包水体系舒缓抗敏多肽组合物的制作方法

本发明属于美容多肽技术领域，涉及一种油包水体系舒缓抗敏多肽组合物。

背景技术：

随着人类社会的发展，人们的生活水平得到了极大的提高，然而环境污染也日益严重，导致皮肤问题层出不穷，其中皮肤敏感已经成为一种常见且发生率越来越高的皮肤问题。在体内外多种因素的综合作用下，皮肤屏障功能受损，皮肤感觉神经信号传入增强，耐受阈值降低，对外界微弱的刺激反应过度，激活皮肤不同的细胞类型诱导释放促炎细胞因子和趋化因子，血管反应性增强，导致血管扩张、炎症细胞浸润，从而导致皮肤出现红肿、灼热、紧绷感、瘙痒、干燥、脱屑等各类敏感皮肤不适症状。

对于敏感肌肤的护理，更应该使用天然、无刺激的产品。然而，目前市场上充斥着各种良莠不齐的护理产品，更有甚者添加了糖皮质激素等违禁成分，对消费者造成了巨大危害，因此开发功效显著、安全无刺激的抗敏产品已经成为当前化妆品研发的重点。多肽作为一种与机体同源，具有多种生理调节功能的活性物质，在美容化妆品行业逐渐受到广泛的关注，越来越多的被应用于改善敏感性肌肤的常见问题。

这些抗敏功效活性多肽都是水溶性成分，因此相应的多肽产品也大多是水基的，多肽溶解其中。然而，多肽在水溶液中容易发生降解，将多肽成分直接添加至水基产品中，由此带来的问题是多肽在产品中稳定性较差，使得原本具有高效活性的多肽无法充分发挥其应有的效果，而且多肽在产品中降解而产生的降解产物有可能对人体产生潜在的危害。此外，水溶性的物质难以透过皮肤屏障被吸收，也就难以充分发挥其舒缓抗敏功效。为了增加透皮吸收，达到预期的效果，需要增加投料量，由此会带来成本的上升。

因此，本领域急需一种稳定性好、安全性高、易于透皮吸收、制备工艺简单、成本低廉、适于工业化大生产、效果优异，能够弥补现有技术缺陷的舒缓抗敏产品。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于提供一种稳定性好、安全性高、易于透皮吸收、制备工艺简单、成本低廉、适于工业化大生产、效果优异的舒缓抗敏多肽组合物。

经过试验研究，本发明人发现将多肽成分分散于油相当中，形成油包水体系，体系中少量的水相可以减少多肽与水的接触，使其在水相中浓缩，有利于提高多肽的稳定性，并且局部更大浓度的多肽有利于发挥更好的舒缓抗敏功效；外部油相可以使多肽成分更好地透过皮肤屏障，促进吸收，从而赋予产品更优异的舒缓抗敏效果，由此形成了本发明。

本发明提供了一种油包水体系舒缓抗敏多肽组合物，包含舒缓抗敏多肽，所述多肽存在于水相当中，多肽质量百分浓度为0.0001％-5％，所述水相与油相形成油包水体系。

所述舒缓抗敏多肽选自一种或几种以下多肽，包括但不限于：棕榈酰三肽-8、棕榈酰四肽-7、乙酰基四肽-15、乙酰基四肽-40、乙酰基四肽-33、乙酰基二肽-1鲸蜡酯、乙酰基六肽-49。

本发明所述油相包含表面活性剂、油性润肤剂。

所述表面活性剂是peg-20三异硬脂酸甘油酯、peg-7甘油椰油酸酯、peg-6辛酸/癸酸甘油酯类、聚甘油-2异硬脂酸酯、聚甘油-4月桂酸酯中的一种或几种组合，各成分质量百分浓度为1％-10％。

所述油性润肤剂是氢化聚异丁烯、辛酸/癸酸甘油三酯、异壬酸异壬酯中的一种或几种组合，所述油性润肤剂的质量百分浓度为70％-90％。

所述油性润肤剂还可以包含植物油，所述植物油是山茶籽油、霍霍巴籽油、坚果油、太阳花籽油。

本发明所述油包水体系舒缓抗敏多肽组合物主要是制备皮肤外用的护肤产品或医用产品。

为了更有利于理解本发明，将皮肤敏感的原因、不同作用靶点的多肽作用机制说明如下：

1、皮肤敏感的原因

(1)促炎细胞因子生成，促使皮肤出现红肿热痛现象。皮肤受到紫外线等刺激，在紫外线的诱导下，阿片促黑皮质激素原(pro-opio-melano-cortin，pomc)和α-促黑色素细胞激素(α-msh)生成，后者进一步促进促炎细胞因子如白细胞介素-1(il-1)、白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-8(il-8)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的产生。其中，il-8是一种趋化性细胞因子，可以促进炎症细胞趋化和诱导细胞增殖。tnf-α是一种强效的促炎性细胞因子，促使血管通透性增加，导致皮肤出现水肿和红血丝。另一些内源性炎症因子如缓激肽、神经生长因子、前列腺素类(如pge2)、蛋白酶激活受体(如par-2，可导致血管舒张)也与炎症发生有关，可以导致皮肤出现红肿、刺痛、红血丝等敏感症状。

(2)皮肤耐受阈值下降，不能耐受一般正常环境因素，比正常皮肤具有更高的反应性，对各种刺激、疼痛等不适感觉提高。神经源高反应性通常与瞬时感受器电位香草酸受体1(trpv1)和神经肽的释放作用有关。trpv1是一种配体门控非选择性阳离子通道，与配体结合后引起ca²⁺内流，随后引起一系列的病理生理反应。trpv1可被各种外源性及内因性的物理及化学刺激所激发，如高温(超过43℃)、低ph值(酸性环境)以及辣椒素(辣椒的有效成分)，与炎症的发生相关，可传递疼痛信号；神经肽主要是降钙素基因相关肽(cgpr)。通过减少降钙素基因相关肽(cgpr)的数量，可降低神经元的刺激/兴奋，提高皮肤的耐受阈值，使皮肤对各种刺激、疼痛等不适感觉减弱。

2、多肽的作用机制

棕榈酰三肽-8(palmitoyltripeptide-8)，具有与α-msh相似的亲和性，易与黑色素皮质素受体1(mc1-r)结合，通过结合和激活mc1-r受体，能有效抑制uvb诱导的促炎因子白细胞介素-8(il-8)的释放，可以抑制炎症级联反应的前期步骤，有效地预防和减缓由化学刺激引发的炎症及症状，也可以干扰肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的生成，阻止水肿和红血丝等神经性皮炎症状，具有抗炎舒缓的作用。

棕榈酰四肽-7(palmitoyltetrapeptide-7，cas号：221227-05-0)，是免疫球蛋白igg中的一个片段，可以调控白细胞介素-6(il-6)的分泌。il-6参与皮肤慢性炎症反应，il-6的增加会加速皮肤衰老，棕榈酰四肽-7可以降低皮肤老化过程中il-6的水平，从而重新维持皮肤中细胞因子的平衡，显著消除皮肤炎症，减少糖基化损伤，以此发挥舒缓作用，延缓皮肤衰老，增加皮肤弹性及紧致度。

乙酰基四肽-15(acetyltetrapeptide-15)，作用于阿片μ受体，对受体具有高度选择性。其通过与受体结合，能减少人体产生的促炎介质降钙素基因相关肽(cgpr)的数量，降低神经对外界刺激的过度敏感，提高皮肤的耐受阈值，使皮肤对各种刺激、疼痛等不适感觉减弱，从而发挥舒缓抗敏作用。

乙酰基四肽-40(acetyltetrapeptide-40)，能够抑制由抗菌肽ll-37所引起的炎症反应，能减少白细胞介素-6(il-6)和白细胞介素-8(il-8)释放，减少细胞损伤及皮肤炎症损伤，减少炎症引起的面部红肿和毛细血管扩张。乙酰基四肽-33(acetyltetrapeptide-33)的作用机制与此类似。

乙酰基二肽-1鲸蜡酯(acetyldipeptide-1cetylester，cas号：196604-48-5)，可显著减少前列腺素e2(pge2)的分泌和核转录因子kappab(nf-κb)信号。pge2能诱发炎症，促进局部血管扩张，引起红肿热痛等炎症症状；nf-κb是细胞中重要的转录调节因子，被活化后诱导多种基因的表达，产生多种细胞因子参与炎症反应。乙酰基二肽-1鲸蜡酯通过影响pge2的分泌和nf-κb信号，从而具有抗炎抗敏的作用。

乙酰基六肽-49(acetylhexapeptide-49)，可以抑制蛋白酶激活受体2(proteaseactivatedreceptor2,par-2)的活性。par-2是肥大细胞参与皮肤炎症和超敏反应的重要分子，乙酰基六肽-49通过抑制par-2活性来减轻皮肤炎症和舒缓皮肤瘙痒。

本发明从导致皮肤敏感的原因出发，利用多肽对皮肤的不同作用靶点，通过将多肽分散于油相体系，得到一种油包水体系舒缓抗敏多肽组合物。本发明相对于现有技术所取得的有益效果包括：

(1)将多肽溶于少量水相，分散于油相，形成油包水体系，提高了多肽的稳定性及使用安全性。

(2)多肽在水相中浓缩，使得局部活性成分浓度增加，有利于达到更优的舒缓抗敏效果。

(3)体系中的油相可以促进水溶性多肽的透皮吸收，同样的投料量可以达到更好的舒缓抗敏效果。

(4)本发明可以用更低的成本达到更优的舒缓抗敏功效，而且制备工艺简单，适于工业化大生产。

附图说明

图1多肽组合物油包水体系的显微图像(40*10倍)

图2多肽的体外累积透皮量和累积皮肤滞留量(24h)

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对发明作详细的说明，但并不只限于以下的实施例。

实施例制备实施例1-5和对比例1-5的组合物

实施例1-5和对比例1-5组合物的处方配比(百分含量)如下：

实施例1-5和对比例1-5组合物的制备方法：

1、准确称量原料5、6、7、8、9，加入处方量的原料1，充分溶解；

2、准确称量原料2、3、4，将其与步骤1所得溶液混合均匀，即得。采用生物数码显微镜观察实施例2的显微图像，结果见图1，在显微镜40*10倍下观察到许多大小均一的小液滴，均匀分布于油相，形成油包水体系。

测试例1稳定性试验

1.1仪器

恒温恒湿箱、高效液相色谱仪(hplc)

1.2试验样品

实施例1-5、对比例1-5

1.3试验依据

《中国药典》2015年版四部通则9001原料药与制剂稳定性试验指导原则

1.4试验条件与检验项目

加速试验：恒温恒湿箱40℃±2℃，rh75％±5％，分别于第1、2、3、6个月通过hplc检测各样品中多肽的含量，以评价其稳定性。

长期试验：恒温恒湿箱25℃±2℃，rh60％±10％，分别于第3、6、9、12、18、24、36个月通过hplc检测各样品中多肽的含量，以评价其稳定性。

1.5稳定性试验结果

实施例1-5、对比例1-5的样品在加速试验条件下放置6个月后，稳定性数据见下表1：

表1加速6个月的稳定性试验数据(含量应为标示量的95％-105％)

实施例1-5、对比例1-5的样品在长期试验条件下放置6个月后，稳定性数据见下表2：

表2长期6个月的稳定性试验数据(含量应为标示量的95％-105％)

由表1及表2的结果可知，在加速试验及长期试验6个月后，实施例1的多肽含量没有出现显著变化，仍在质量标准范围之内，而对比例1的多肽含量出现明显下降，说明多肽在油包水体系中具有更好的稳定性。同理，通过实施例2与对比例2、实施例3与对比例3、实施例4与对比例4、实施例5与对比例5不同试验结果之间的比较可知，不同种类的多肽在油包水体系的稳定性均比处于水基体系的稳定性好，水基体系中多肽含量在加速试验及长期试验6个月后出现了不同程度的下降，多肽含量的降低必然导致其功效的下降，甚至可能产生有害的降解产物，对人体具有潜在危害。因此，活性多肽分散于油包水体系可以提高其稳定性和安全性，在相同投料量的情况下可以取得更优异的舒缓抗敏效果。

测试例2体外累积透皮量及累积皮肤滞留量试验

2.1仪器

智能药物透皮扩散试验仪、高效液相色谱仪(hplc)

2.2试验样品

实施例1、对比例1

2.3试验方法

采用垂直式franz扩散池法评价样品的透皮性能。将sd大鼠腹部的离体皮肤固定于扩散池接受室和供给室之间，取1g样品于供给室的皮肤表面，有效扩散面积3.14cm²，接收池中加入生理盐水作为接收液，排净气泡使真皮一侧与接收液完全接触，32℃、300r/min搅拌扩散。分别于4h、8h、12h、16h、20h、24h取接收液0.5ml，并及时补充等量恒温空白接收液。经hplc测定接收液中多肽的浓度，按以下公式计算不同时间的多肽单位面积累积透皮量：

其中：qn为累积透皮量；cn为该次取样时接收液中多肽浓度；v为接收池中生理盐水体积；ci为第1次至上次取样时接收液中多肽浓度；vi为每次取样体积；a为有效扩散面积。

24h后，取下皮肤，超纯水洗去样品残液后剪碎，加入超纯水匀浆处理，超声5min，10000r/min离心10min，取上清液经hplc法检测，按以下公式计算多肽单位面积皮肤滞留量：

qs＝cs×v/a

其中，qs为累积滞留量；cs为取样时间点测得的皮肤样品液中多肽质量浓度；v为上清液体积；a为有效扩散面积。

2.4试验结果

实施例1、对比例1在24h透皮扩散试验之后，样品中多肽的体外累积透皮量及累积皮肤滞留量如图2所示。

图2结果显示，实施例1的多肽成分经24h的累积透皮量为66.48μg/cm²，累积皮肤滞留量为35.26μg/cm²，对比例1的多肽成分经24h的累积透皮量为25.73μg/cm²，累积皮肤滞留量为6.14μg/cm²。由此可知，多肽直接溶于水基体系中，由于皮肤屏障的限制，水溶性的多肽难以透过皮肤屏障，其透皮量及皮肤滞留量均较低，而经分散在油相当中，借助油相与皮肤屏障的相似相溶原理，多肽更易于透皮吸收，而且多肽成分溶于少量水相，使得油包水体系中局部多肽浓度更高，浓度梯度增大也有利于促进透皮吸收。对比试验结果表明，多肽分散在油包水体系，其透皮量及皮肤滞留量均显著提高，尤其是皮肤滞留量提高更加明显，可以在皮肤中蓄积，形成活性成分储库，从而可以更加有效且持久地发挥舒缓抗敏作用。

测试例3抗炎试验

3.1材料与仪器

nctc细胞(来自正常人类皮肤的角质形成细胞)，dmem培养基，胎牛血清，浓度10^-11m的α-msh，实施例1-5的样品，酶标仪，人白细胞介素-8(il-8)elisa(酶联免疫吸附测定)试剂盒，二氧化碳培养箱

3.2试验方法

nctc细胞加入dmem培养基(含5％胎牛血清)，置于含5％co2，湿度为95％，恒温37℃的二氧化碳培养箱中培养，培养48h后更换培养液，待细胞长满培养瓶，取出弃去培养液，加入消化液约3ml，以覆满瓶底为限，约2-3min后，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，加入dmem培养基终止反应，并制备成单细胞悬液。

nctc细胞经uvb辐照处理，在含有α-msh、实施例1-5的样品以及pbs的培养基中分别培养24h。用pbs(ph7.2-7.4)稀释细胞悬液。通过反复冻融，使细胞破坏并释放出细胞内成份。离心，仔细收集上清备用。

用il-8elisa试剂盒，按照说明书的操作步骤，加样、温育、洗涤、加酶、温育、洗涤、显色、终止反应后，用酶标仪在450nm波长下测定各孔光密度值(od值)，通过标准曲线计算样品中il-8的含量。将α-msh组、实施例1-5组分别与空白组比较，计算相对于空白组的il-8释放量，经其余各组样品处理后的il-8释放量变化百分比。

3.3测试结果

相对于空白组的il-8释放量，经α-msh组、实施例1-5组处理后的il-8释放量变化百分比结果见下表3。

表3各组试验样品处理后il-8的释放量变化百分比

由表3结果可知，相对于空白组，经实施例1处理后，uvb照射所诱导的炎症介质il-8的释放减少了41.36％，表明多肽具有类似于α-msh的功效，能够减少由uvb照射所引起的炎症介质il-8的释放，从而抑制神经性炎症反应。此外，在活性成分浓度保持一致的条件下，随着多肽种类的增多，il-8释放量变化百分比逐渐增大，能够更加明显地减少il-8的释放，说明不同多肽之间具有显著的协同作用，从而可以达到更优的抗炎效果。

测试例4评价舒缓抗敏效果的临床试验

4.1受试者

330名身体健康的志愿者，年龄范围25-30岁，这些志愿者脸上有明显的红肿、发炎、发痒等现象，且久久不能治愈。将这些志愿者随机分成11组，平均每组30人。

4.2试验样品

实施例1-5，对比例1-5，以安慰剂作为空白对照。

4.3试验方法

每天早晚洁面后，分别使用实施例1-5、对比例1-5、安慰剂样品，早晚各涂抹一次，连续使用4周。在治疗前后详细记录患者的客观症状。

4.4疗效评价指标

从客观指标来评价样品的舒缓抗敏效果。

客观评价指标如下：a、以红肿、干燥、脱屑等临床症状为评价标准，按照轻重程度进行评分，无上述症状、轻度、中度、重度分别评为0-3分。

4.5试验结果

各组志愿者使用前后的客观评价分值情况见表4。

表4各组志愿者使用前后的客观评价分值情况

由表中数据可知，相对于安慰剂组，在活性多肽存在的条件下，实施例1-5及对比例1-5在使用4周后，各组志愿者的客观评价分值均出现不同程度的降低，表明志愿者的皮肤红肿发炎等症状有所改善，多肽具有舒缓抗敏作用。比较实施例1与对比例1的评分结果，在多肽种类及用量均相同的情况下，使用4周后，实施例1志愿者的客观评价分值更低，而且降低的幅度更大，评价分值降低了27.63％，由此可见实施例1的舒缓抗敏效果明显优于对比例1，说明多肽分散于油相体系，更易于透皮吸收，从而发挥更加优异的舒缓抗敏效果，而且多肽成分溶于少量水相，使得油包水体系中局部多肽浓度更高，这也有利于多肽更好地发挥舒缓抗敏功效。同理，通过实施例2与对比例2、实施例3与对比例3、实施例4与对比例4、实施例5与对比例5不同评分结果及评分变化百分比之间的比较可知，不同种类的多肽在油包水体系的舒缓抗敏效果均比处于水基体系的舒缓抗敏效果好。此外，在活性成分浓度保持一致的条件下，随着多肽种类的增多，使用4周后，相应志愿者的客观评价分值也下降得更多，说明不同多肽可以从不同的作用靶点发挥功效，各多肽之间具有显著的协同作用，从而可以达到更优异的舒缓抗敏效果。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细的说明，但是不表示本发明的具体实施是局限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或是替换，都应视为属于本发明的保护范围。