用于睾丸激素促进的协同草药组合物的制作方法

1.本发明涉及一种协同草药组合物，其包含至少一种选自石榴的提取物和馏分的成分和至少一种选自可可的提取物和馏分的成分，用于改善人体内睾丸激素水平和/或减轻至少一种与人体睾丸激素水平低于正常水平相关的症状/状况。本发明还涉及改善人的睾丸激素水平的方法和/或减轻至少一种与人的睾丸激素水平低相关的症状的方法。


背景技术：

2.睾丸激素是一种主要由睾丸间质细胞产生的激素化学信使，并负责男性性征的正常发展。它是精子形成过程中必不可少的一种雄激素。睾丸激素是一种合成代谢激素，并已知可调节男性除精子产生外的多种功能，包括性欲，骨量，肌肉生长，肌肉强度，耐力，能量增加，情绪等。随着男性的年龄增长，血清睾酮水平逐渐降低，导致各种生理和心理变化，例如性欲减退，勃起功能丧失，腹部肥胖，肌肉质量和强度降低，疲劳，骨密度降低，情绪波动，积极性降低以及记忆力和注意力下降。
3.许多睾丸激素替代疗法可用于治疗患有睾丸激素缺乏症的男性，包括脱氢表雄酮(dhea)和草药产品，例如刺蒺藜。研究发现，睾丸激素水平低与镁、铁和锌的含量显著降低有关。因此，含有这些营养素的补充剂也可作为睾丸激素的促进剂。
4.公开专利wo2011026500a1公开了包含刺蒺藜和玛咖提取物的组合物，用于通过增加睾丸激素水平来治疗勃起功能障碍。
5.公开专利us 20140086999a1公开了一种生物活性的膳食补充剂，用于使男性的雄激素水平正常化，改善总体健康状况和减轻肥胖症，所述膳食补充剂包括白五叶的根和根茎，或白五叶的地上部分或它们的混合物；以及重量比例为20至80重量％的雄蜂幼虫。
6.另一个公开专利us 5543146a，公开了一种用于减轻与前列腺增大相关症状的饮食补充剂，其包含以下成分：南瓜籽，其含量为组合物重量的12.5％至25％；和占组合物重量1.875％至18.75％的锯棕榈提取物；占组合物重量6.25
‑
12.5％的臀果木提取物；占组合物重量3.125至6.25％的甘氨酸锌；以及赋形剂。男性睾丸激素水平降低的主要原因之一是其转化为雌二醇。芳香酶是负责将雄激素转化为雌激素的酶，特别是将睾丸激素转化为雌二醇的酶。已知体重增加和衰老会通过这种转化增加睾丸激素的损失。此外，已知男性中过量的雌二醇可导致与前列腺，男性乳房发育症和勃起/性欲/激素平衡有关的健康问题。已知芳香酶抑制剂会增加促黄体生成素(lh)，促卵泡激素(fsh)和睾丸激素的水平。因此，芳香酶抑制剂可以用作提高睾丸激素水平的工具。
7.从上述可以明显看出，在本领域中持续需要提供成本有效的包括用于改善精囊和血液中睾丸激素浓度的高效草药提取物的替代治疗方法。此外，本领域中需要提供最小的副作用的用于改善睾丸激素水平的更好的治疗选择，从而使该选择对于人类消费是安全的。


技术实现要素：

8.因此，本发明的目的是提供一种协同和安全的草药组合物，其包含至少一种选自石榴植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物中的成分和至少一种选自可可植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的成分，用于获取至少一种与增强体内合成代谢和雄激素活性有关的健康益处，选自改善血液和/或精囊中睾丸激素水平，能量水平，持续能量，活力，耐力，健康老化，细胞寿命，肌肉质量，肌肉力量性功能(性欲和勃起功能)和心理健康(情绪和注意力)；并减轻与人体内睾丸激素水平低有关的症状，例如性欲减退，勃起功能丧失，腹部肥胖，肌肉质量和强度下降，骨骼密度降低，动力下降，记忆力和注意力下降，并改善幸福感。
9.本发明的另一个目的是提供本发明的协同草药组合物在提高睾丸激素水平和治疗/减轻与睾丸激素水平低有关的症状中的用途。
10.本发明的进一步目的是提供获得至少一种与体内增强的合成代谢和雄激素活性相关的健康益处的方法，选自改善血流和/或精囊中的睾丸激素水平，能量水平，持续能量，活力，耐力，健康老化，细胞寿命，肌肉质量，肌肉强度性功能(性欲和勃起功能)和心理健康(情绪和注意力)；并减轻与人类睾丸激素水平低有关的症状，如性欲减退，勃起功能障碍，腹部肥胖，肌肉质量和强度下降，骨骼密度降低，动力下降，记忆力和注意力下降以及改善幸福感。
11.本发明的又一个目的是提供使用协同草药组合物在哺乳动物或温血动物中增加自然能量水平，体力活动，进攻和增加/稳定维持能量，耐力，精神警觉，肌肉质量和肌肉强度的方法。
12.本发明提供了具有协同作用的草药组合物，其包含选自石榴植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第一成分和选自可可植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第二成分的组合，以获得至少一种与体内增强的合成代谢和雄激素活性有关的健康益处，选自改善血液和/或精囊中睾丸激素水平，不断增加能量水平，持续的能量，活力，耐力，健康老化，细胞寿命，肌肉质量，肌肉强度的性功能(性欲和勃起功能)和心理健康(情绪和注意力)；减轻压力；并减轻与人类睾丸激素水平低有关的症状，如性欲减退，勃起功能丧失，腹部肥胖，肌肉质量和强度下降，疲劳，情绪波动，骨骼密度降低，动机降低以及记忆力和注意力下降并改善幸福感。
13.在一方面，本发明提供了协同草药组合物，其包含选自石榴植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第一成分与选自可可植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第二成分的组合，以获得至少一种与体内合成代谢和雄激素活性增强相关的健康益处，选自改善血液和/或精囊中的睾丸激素水平，能量水平，持续能量，活力，体力，健康老化，细胞寿命，肌肉质量，肌肉强度性功能(性欲和勃起功能)和心理健康(情绪和注意力)；减轻压力并减轻与人类睾丸激素水平低有关的症状，其中组合物任选地包含至少一种选自药学上可接受的赋形剂，药学上可接受的稀释剂和药学上可接受的载体的附加成分。
14.本发明的另一方面提供了协同草药组合物的用途，所述草药组合物包含选自石榴植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物中的第一成分和选自可可植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第二成分，以获得至
少一种与体内合成代谢和雄激素活性增强有关的健康益处，选自改善血液和/或精囊中的睾丸激素水平，能量水平，持续能量，活力，体力，健康老化，细胞寿命，肌肉质量，肌肉强度性功能(性欲和勃起功能)和心理健康(情绪和焦点)；并减轻人的压力和减轻与人体内睾丸激素水平低有关的症状。
15.本发明的另一方面提供了获得至少一种与体内增强的合成代谢和雄激素活性有关的健康益处的方法，所述健康益处选自改善睾丸激素水平，能量水平，持续能量，活力，耐力，健康老龄化，细胞寿命，肌肉质量，肌肉力量性功能(性欲和勃起功能)和心理健康(情绪和注意力)；并减轻人类的压力；以及治疗/缓解与睾丸激素水平低下相关的症状，例如性欲减退，勃起功能障碍，腹部肥胖，肌肉质量和强度降低，骨骼密度降低，积极性降低以及人的记忆力和注意力下降，其中所述方法包括向有需要的人补充有效剂量的组合物，所述组合物包含选自石榴的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第一成分和选自可可植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物中的第二组分，并可选地含有至少一种选自药学上可接受的赋形剂，药学上可接受的稀释剂和药学上可接受的载体的其他成分。
16.本发明的另一方面提供了增加哺乳动物或温血动物中自然能量水平，身体活动，进攻和增加/稳定维持能量，耐力，心理警觉，肌肉质量和/或肌肉强度的方法；其中所述方法包括向所述哺乳动物或温血动物补充有效剂量的组合物，所述组合物包含选自石榴植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第一成分和选自可可植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第二组分，并可选地包含至少一种选自药学上可接受的赋形剂，药学上可接受的稀释剂和药学上可接受的载体的附加成分。
17.在另一方面，本发明提供了协同草药组合物，其包含选自石榴植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第一成分和选自可可植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第二成分，并任选地结合选自具有睾丸激素增强活性或芳香酶抑制活性/或亚硝酸盐增强活性的植物中的提取物/馏分、活性化合物和植物化学物质或其混合物。
18.在另一方面，本发明提供了协同草药组合物，其包含选自石榴植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第一成分和选自可可植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第二成分，并任选地与微量营养素，如镁、锌和硼，以元素形式或含有这些元素的化合物结合；或者氨基酸，比如d
‑
天冬氨酸。
附图说明：
19.图i：条形图表示对照组(g1)，治疗组g2(组合物
‑
77：100mg/kg；p.o)和和g3(组合物
‑
78：100mg/kg；p.o)中第22天的血清睾丸激素水平(ng/ml)；每条代表平均值
±
s.e.m，n＝7。
20.图ii：条形图表示对照组(g1)，治疗组g2(组合物
‑
77：100mg/kg；p.o)和g3(组合物
‑
78：100mg/kg；p.o)中第22天的精子数量；每条代表平均值
±
s.e.m，n＝7。使用anova和dunnett的事后检验对数据进行分析。与正常对照组相比，*p<0.05，***p<0.001。
具体实施方式
21.睾丸激素是一种重要的雄性激素，主要由睾丸在leydig细胞中产生。它负责男性生殖组织的发育并促进继发性特征。在成年人中，睾丸激素在维持肌肉质量，肌肉强度，能量水平和骨骼质量，性功能和心理健康方面起着重要作用。睾丸激素水平增加会增强肌肉质量和肌肉强度；增加能量水平，改善性欲，勃起功能并改善幸福感。随着男性年龄的增长，睾丸激素水平逐渐下降，与此相关的不良反应被称为“男人更年期”，近年来受到了越来越多的关注。不良影响包括对性欲的渴望减少，勃起质量下降(尤其是夜间勃起)，情绪变化，智力和认知功能下降，疲劳,抑郁以及愤怒，肌肉质量和强度下降，能量水平下降，体毛减少，皮肤改变，勃起功能障碍，腹部肥胖，记忆力和注意力下降，骨量/矿物质密度降低，腹部脂肪量增加。
22.许多睾丸激素替代疗法可用于治疗患有睾丸激素缺乏症的男性，但每种疗法都有其自身的缺点。(睾丸激素替代疗法的益处和风险：综述，nazem bassil，saad alkaade，john e morley ther clin risk manag.2009；5：427
‑
448.在线发表于2009年6月22日)。
23.因此，本申请的发明人利用小鼠ma
‑
10间质细胞系和基于睾丸激素eia分析试剂盒(美国开曼化学)的elisa，在体外细胞模型中随机筛选了大量植物提取物和馏分的睾丸激素增强活性，并发现了来自石榴和可可的提取物和馏分均具有有效的睾丸激素促进活性的剂量依赖性。
24.石榴：石榴是石榴科的一种水果植物，当地称为anar。这是一种距今五千多年前在中东地区种植的古老植物。该植物遍布印度和孟加拉国。在阿育吠陀医学中，该植物以梵语名称“dalima”(水果)被描述为“血液净化剂”，用于治疗寄生虫感染，口疮(口腔溃疡)，腹泻和溃疡。石榴的果皮富含β
‑
胡萝卜素，钾，磷，钙和各种化学成分，如鞣花酸，鞣花单宁，石榴酸，类黄酮，花青素，花青苷和黄酮。石榴皮或果皮潜在的广泛治疗特性包括治疗和预防癌症，心血管疾病，糖尿病，牙齿疾病和勃起功能障碍，防止紫外线辐射；以及作为止泻和抗菌药。其他潜在的应用包括婴儿脑缺血，阿尔茨海默氏病，男性不育，关节炎，皮肤伤口和肥胖症。
25.可可：可可树较小，但在经济上很重要。它是梧桐科植物的常绿树，原产于美洲的热带地区。可可种子是多酚和可可碱的重要来源。种子用于制作可可块，可可粉，糖果，水粉和巧克力。可可提取物或其植物化学物质对血小板聚集，高血压，动脉粥样硬化，高血糖和高胆固醇血症，炎症，肝癌发生，dna损伤和致染色体断裂效应具有多种有益作用。
26.用于本发明的草药的来源如下：
‑
27.1)石榴皮的原材料是从安得拉邦，阿南斯布尔地区的科塔切鲁武曼达尔，科塔切鲁武村收集的。
28.2)可可种子原料是从阿斯瓦劳佩特，特伦甘纳种植获得的。
29.粉碎石榴果皮，并用各种溶剂提取提取粉末，例如采用乙醇，90％乙醇水溶液，80％乙醇水溶液，70％乙醇水溶液，50％乙醇水溶液，水，甲醇，50％甲醇水溶液，丙酮，50％丙酮水溶液和乙酸乙酯以分别获得乙醇提取物(p.g
‑
1)，90％的乙醇水溶液提取物(p.g
‑
2)，80％的乙醇水溶液提取物(p.g
‑
3)，70％的乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)，50％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
5)，水提取物(p.g
‑
6)，甲醇提取物(p.g
‑
7)，50％甲醇水溶液提取物(p.g
‑
8)，丙酮提取物(p.g
‑
9)，50％丙酮水溶液提取物(p.g
‑
10)和乙酸乙酯提取物(p.g
‑
11)。通过分
析型hplc方法将所述石榴果皮的提取物标准化为安石榴苷(i)，结果总结于表1中。安石榴苷(i)是鞣花单宁，其化学结构如下所示。
[0030][0031]
安石榴苷(i)的化学结构
[0032]
将可可种子粉碎，并用各种溶剂提取粉末，例如水，50％乙醇水溶液，乙醇，90％乙醇水溶液，70％乙醇水溶液，甲醇，50％甲醇水溶液，丙酮，50％丙酮水溶液和乙酸乙酯以分别获得水提取物(t.c
‑
1)，50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)，乙醇提取物(t.c
‑
3)，90％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
4)，70％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
5)，甲醇提取物(t.c
‑
6)，50％甲醇水溶液提取物(t.c
‑
7)，丙酮提取物(t.c
‑
8)，50％丙酮水溶液提取物(t.c
‑
9)和乙酸乙酯提取物(t.c
‑
10)。所述可可种子的提取物通过分析型hplc方法标准化为可可碱(ii)，结果总结于表2中。可可碱(ii)是可可中的主要生物碱(donald l.pavia，化学教育杂志，1973年，50，791
‑
792)及其化学结构如下所示。
[0033][0034]
可可碱的化学结构(ii)
[0035]
与用对照组处理的细胞相比，石榴提取物和可可提取物可有效提高小鼠ma
‑
10间质细胞中的睾丸激素水平。例如，石榴果皮70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)在治疗浓度为5μg/ml的情况下，睾丸激素含量比对照组高34.15％。类似地，可可种子水提取物(t.c
‑
1)和50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)在处理浓度为5μg/ml时的睾丸激素水平分别比对照组增加20.44％和48.24％。
[0036]
组合物
‑
1至组合物
‑
76是通过以不同的比例将选自石榴果皮的提取物中的第一成分与选自可可种子原料的提取物中的第二成分随机混合而制备的。与相应的单个成分相比，评价了如此获得的组合物(组合物
‑
1至76)的睾丸激素促进活性。来自体外睾丸激素测定的数据表明，与它们相应的单个成分相比，这些组合物出乎意料地具有提高睾丸激素水平的更好的功效，这表明从石榴中提取的单个的提取物或馏分与来源于可可的提取物或馏分组合时表现出协同作用的趋势。
[0037]
例如，石榴皮的0.16μg/ml的70％乙醇水提取物(p.g
‑
4)和0.04μg/ml的可可水提
取物(t.c
‑
1)在细胞测定中的睾丸激素浓度分别增加了7.10％和0.86％.以4：1的比例包含这两种提取物的组合物
‑
1在0.2μg/ml浓度下的睾丸激素含量增加了18.3％，这明显优于这两种成分的累加效果(7.10％+0.86％＝7.96％)，表明石榴皮70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可水提取物(t.c
‑
1)在提高睾丸激素水平方面具有协同作用。与表3中汇总的相应单个成分相比，由两种成分分别按3：1、2：1、1：1、1：2、1：3和1：4的比例组合得到的组合物
‑
2、3、4、5、6和7也显示出协同作用。
[0038]
在另一个示例中，0.16μg/ml的石榴皮70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和0.04μg/ml浓度的可可50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)在细胞试验中的睾丸激素浓度分别提高了7.10％和3.85％。以4：1比例包含这两种提取物的组合物
‑
8在0.2μg/ml浓度下的睾丸激素水平增加了25.74％，这明显优于这两种成分的累加效果(7.10％+3.85％＝10.95％)，表明石榴皮70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)可以协同提高睾丸激素水平。这两种成分以3：1，2：1、1：1、1：2、1：3和1：4的比例组合时也表现出协同作用，如表4所示的组合物
‑
9、10、11、12、13和14表现出的优异的睾丸激素增强作用。还测试了含有石榴和可可的其他提取物的相似组合物(c
‑
15至c
‑
76)的睾丸激素增强活性，发现它们具有协同作用，如表5至8所示。
[0039]
通过抑制芳香酶促进睾丸激素
[0040]
睾丸激素水平低的主要原因包括脑垂体和下丘脑腺体疾病，精神和身体压力，衰老，药物，并发疾病等。增加性冲动，性欲，增强肌肉强度和肌肉质量所需的睾丸激素水平超过正常水平，男性睾丸激素水平降低的另一个关键原因是其转化为雌二醇。芳香酶是负责将雄激素转化为雌激素，特别是将睾酮转化为雌二醇的酶。因此，芳香酶抑制剂可以用作抑制睾丸激素转化的工具，从而提高其在生物系统中的水平。已知添加芳香酶抑制剂会增加lh，促卵泡激素(fsh)和睾丸激素的水平。
[0041]
因此，本申请的发明人筛选了石榴皮和可可种子的提取物的芳香酶抑制活性。有趣的是，源自这两种植物材料的提取物均表现出有效的芳香酶抑制活性剂量依赖性。例如处理浓度为25μg/ml的石榴皮70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)显示抑制了40.15％的芳香酶。类似地，可可种子50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)在处理浓度25μg/ml下的芳香酶抑制率为20.9％。因此，很明显，石榴皮和可可的提取物/馏分可以通过抑制芳香酶来改善睾丸激素的水平。
[0042]
然后，评价包含这两种提取物的组合物
‑
1至76(c
‑
1至c
‑
76)，以探索获得抑制芳香酶活性的协同功效的可行性，其中，每种提取物均来自石榴和可可。与它们相应的单个成分相比，这些组合物的体外芳香化酶测定数据出乎意料地显示出更好的抑制芳香化酶活性的功效。
[0043]
例如，石榴皮中20.0μg/ml的70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和5.0μg/ml的可可50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)在细胞测定中的芳香酶抑制率分别为22.15％和4.18％。以4：1的比例包含这两种提取物的组合物
‑
8在25.0μg/ml浓度下显示35.2％的芳香酶抑制作用，明显优于这两种成分的累加效果(22.15％+4.18％＝26.33％)，表明石榴皮70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)协同抑制芳香酶的活性。与表9中汇总的相应单个成分相比，当这两种成分分别以3：1、2：1、1：1、1：2、1：3和1：4获得组合物
‑
9、10、11、12、13和14时也表现出协同的芳香酶抑制作用。类似地，测试了包含石榴和可
可提取物的其他组合物(c
‑
15至c
‑
76)的芳香酶抑制活性，其协同结果总结在表10至13中。
[0044]
增强身体性能，能量水平，肌肉质量和肌肉强度
[0045]
能量的存在和维持是人类生活所有活动的基本要求和条件。atp负责为包括细胞运输，生物分子的产生和大分子功能在内的许多细胞功能提供化学能，这对于细胞的存在和生存至关重要。它为心肌(用于血液循环)和骨骼肌(用于全身运动所需的肌肉收缩)提供能量。肌肉细胞中已经存在的atp池对剧烈的身体活动(例如跑步，肌肉活动)的前5或6秒有益。在此之后，新的atp主要通过厌氧过程(糖酵解)和有氧代谢(通过糖酵解，柠檬酸循环以及电子转运/氧化磷酸化产生的细胞呼吸作用)产生。总体而言，atp可以激活肌肉收缩，以支持更长和更剧烈的身体活动。因此，至关重要的是在耐力运动中以及长时间和激烈的体育锻炼中增加细胞内能量源或atp含量。
[0046]
线粒体是通过氧化磷酸化作用而在细胞中产生能量(atp)的部位，通常被称为细胞的动力源。线粒体提供维持正常细胞功能和体内稳态所需的总atp的大部分。atp在骨骼肌功能中也起着关键作用，是运动的力量生成器。线粒体生物发生是通过已有的线粒体增殖在细胞中形成新线粒体的过程。线粒体的生物发生不仅伴随着数量的增加，而且还伴随着大小和质量的增加。线粒体的生物发生可以通过体育活动和包括草药成分在内的药理干预来诱导。pgc
‑
1α[ppar(过氧化物酶体增殖物
‑
激活的受体)
‑
γ共激活因子
‑
1α]是线粒体生物发生的主要调节剂。
[0047]
线粒体在有氧运动或其他身体活动中以atp的形式为肌肉细胞提供大部分能量。因此，产生更多和更好功能线粒体的线粒体生物发生可对细胞能量水平的增加和能量持续产生积极影响。线粒体易受老化的损害和损失，因为它们是主要的生物能机制和细胞中氧化应激的来源。另外，线粒体生物发生的能力也随着年龄的增长而降低。因此，线粒体生物发生的有效控制不仅对于维持能量产生而且对于促进健康衰老至关重要。因此，可以诱导线粒体生物发生(增殖，大小和质量)的植物提取物可能具有增强能量，能量维持，耐力，肌肉质量，肌肉强度和肌肉构建的潜力；并促进健康的衰老。
[0048]
蛋白质是肌肉，骨骼和软骨的主要组成部分；对肌肉生长和修复至关重要。蛋白质是利用氨基酸在细胞内通过mrna的转译过程合成的。因此，刺激肌肉蛋白质合成是增加肌肉质量的重要因素。mtor(雷帕霉素的哺乳动物靶标)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是蛋白质合成的主要调节剂。活化的mtor通过mrna翻译和核糖体合成的磷酸化关键调节剂来上调蛋白质合成。此外，mtor激活可增加肌肉特异性转录因子(如myod和myogenin)的产生。因此，激活mtor信号传导的植物提取物或膳食补充剂可能具有增强肌肉发育，肌肉质量，肌肉强度和耐力的潜力。
[0049]
基于以上信息，我们假设可以激活骨骼肌细胞中蛋白质合成/mtor信号传导和线粒体生物发生的草药提取物，馏分或其组合物/配方对于增加能量，持续能量，耐力水平，肌肉组织质量和肌肉力量具有理想的前景。因此，本申请的发明人随机筛选了大量植物提取物的m
‑
tor和线粒体生物发生活性。
[0050]
线粒体生物发生测定是通过使用细胞内elisa试剂盒在大鼠骨骼肌(l6)细胞中进行的。源自石榴皮和可可种子提取物的剂量依赖性地增加了线粒体生物发生。例如，在10ng/ml的给药处理浓度下，石榴皮中70％的乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)显示增加了5.17％的线粒体生物发生。同样，可可种子水提取物(t.c
‑
1)和50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)在
10ng/ml的处理浓度下分别显示线粒体生物发生增加6.04％和9.54％。
[0051]
与相应的单个提取物进行比较，评估了包含石榴皮和可可种子提取物的选定的组合物c
‑
1至c
‑
7，c8，c9，c
‑
11，c
‑
13，c
‑
16和c
‑
17，并且发现这些组合物表现出协同功效，如表14所示。
[0052]
还使用大鼠l6成肌细胞中的mtor磷酸化分析评估了单个的提取物和组合物。计算蛋白质印迹法中的磷酸
‑
mtor和mtor蛋白带的带强度。通过磷酸
‑
mtor/mtor之比获得的相对指数(任意值)显示与媒介物组对照(未处理)相比，每种治疗条件下mtor的磷酸化程度或mtor的活化程度。数据表明，如表15所示，源自石榴皮和可可种子的提取物及其组合物具有激活mtor的潜力。
[0053]
所选组合物在sprague dawley大鼠中的睾丸激素增强活性：本发明选定的的一些组合物，即包含石榴皮70％乙醇提取物(p.g
‑
4)和可可种子水提取物(t.c
‑
1)以及ultrasperse a淀粉，微晶纤维素和作为赋形剂的二氧化硅的组合物
‑
77(c
‑
77)以及包含石榴皮70％乙醇提取物(p.g
‑
4)和可可种子50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)以及麦芽糊精和作为赋形剂的二氧化硅的组合物
‑
78(c
‑
78)，评估了它们在体内增加雄性大鼠睾丸激素水平的功效。简而言之，使健康的雄性sprague dawley大鼠适应并随机分为三组(g1至g3)。治疗组动物每天在0.5％cmc水中补充一次c
‑
77(g2；100mg/kg)或c
‑
78(g3；100mg/kg；p.o.)，持续3周。对照组(g1)动物仅补充了媒介物(含0.5％cmc的水)。
[0054]
在第22天
nd
，从所有动物中采集血液样品；分离血清并使用市售的酶
‑
免疫测定试剂盒分析睾丸激素水平。在第22天，对动物实施安乐死，将尾附睾和宽大的输精管(两侧)切开，并将精液样本挤出到杜尔贝科(dulbecco)磷酸盐缓冲盐水中进行精液分析。精液分析包括总精子数量，活精子百分比，活动精子和形态正常的精子细胞。补充组合物
‑
77(g2)和组合物
‑
78(g3)的大鼠的血清睾丸激素显著增加(<0.05)，与对照组(g1)相比，第22天的血清睾丸激素水平分别提高了57％和155％。表16中总结了不同治疗组中的血清睾丸激素水平，并在图i中进行了描述。类似地，与表17中总结并在图ii中描述的对照组相比，治疗组还显示出改善的精液参数。这些观察清楚地表明，本发明的组合物c
‑
77和c
‑
78增加了实验大鼠中的雄激素活性和睾丸功能。
[0055]
前述内容证明了本发明包含选自石榴植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第一成分以及选自可可植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第二成分的组合的协同草药组合物有可能改善睾丸激素水平，能量水平，能量持续，活力，健康老化，细胞寿命，肌肉质量，肌肉强度，性功能(性欲和勃起功能)和心理健康(情绪和注意力)；以及减轻人的压力，减轻与人的睾丸激素水平低有关的症状，如性欲减退，勃起功能障碍，腹部肥胖，肌肉质量和强度降低，骨骼密度降低，积极性降低以及记忆力和注意力下降。
[0056]
因此，在一个重要的实施方案中，本发明提供了包含选自石榴植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第一成分以及选自可可植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第二成分的组合的协同草药组合物，以获得至少一种与身体中增强的合成代谢和雄激素活性有关的，且选自改善睾丸激素水平，能量水平，能量持续，活力，耐力，健康老化，细胞寿命，肌肉质量，肌肉强度性功能(性欲和勃起功能)和心理健康(情绪和注意力)的健康益处；并减轻人类的压力以及减轻与人类睾
丸激素水平低有关的症状，例如性欲减退，勃起功能丧失，腹部肥胖，肌肉质量和强度下降，疲劳，情绪低落，骨骼密度降低，积极性降低，并降低记忆力和注意力。
[0057]
在另一个重要的实施方案中，本发明提供了包含选自石榴植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第一成分以及选自可可植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第二成分的组合的协同草药组合物，其任选地包含至少一种选自包含生物制剂；药学上可接受的活性成分，维生素，矿物质；药学上或营养学上或饮食上可接受的赋形剂，载体或稀释剂的附加组分，用于获得至少一种与身体中增强的合成代谢和雄激素活性有关的选自改善睾丸激素水平，能量水平，能量持续，活力，耐力，健康老化，细胞寿命，肌肉质量，肌肉强度性功能(性欲和勃起功能)和心理健康(情绪和注意力)的健康益处；并减轻人类的压力以及减轻与人类睾丸激素水平低有关的症状，例如性欲减退，勃起功能丧失，腹部肥胖，肌肉质量和强度下降，疲劳，情绪低落，骨骼密度降低，积极性降低，并降低记忆力和注意力。
[0058]
在另一个实施方案中，本发明提供如上所述的一种或多种组合物，用于获得至少一种与身体中增强的合成代谢和雄激素活性有关的选自改善睾丸激素水平，能量水平，能量持续，活力，耐力，健康老化，细胞寿命，肌肉质量，肌肉强度性功能(性欲和勃起功能)和心理健康(情绪和注意力)的健康益处；并减轻人类的压力及减轻与人类睾丸激素水平低有关的症状，例如性欲减退，勃起功能丧失，腹部肥胖，肌肉质量和强度下降，疲劳，情绪低落，骨骼密度降低，积极性降低，并降低记忆力和注意力，其中用于制备组合物中提取物和馏分使用的溶剂可以选自但不限于c1
‑
c5醇，例如乙醇，甲醇，正丙醇，异丙醇；和酮，如丙酮，甲基异丁基酮；氯化溶剂，如二氯甲烷和氯仿，水及其混合物；c1
‑
c7烃，例如己烷；酯如乙酸乙酯等及其混合物。
[0059]
在另一个实施方案中，本发明提供了如上所述的一种或多种组合物，其中所述协同组合物任选地包含选自生物试剂，药物活性成分，维生素，矿物质；药学上或营养上或饮食上可接受的赋形剂，载体或稀释剂的组中的至少一种附加的组分。
[0060]
在另一个实施方案中，本发明提供如上所述的一种或多种组合物，用于获得至少一种与身体中增强的合成代谢和雄激素活性有关的选自改善睾丸激素水平，能量水平，能量持续，活力，耐力，健康老化，细胞寿命，肌肉质量，肌肉强度，性功能(性欲和勃起功能)和心理健康(情绪和注意力)的健康益处；并减轻人类的压力及减轻与人类睾丸激素水平低有关的症状，例如性欲减退，勃起功能丧失，腹部肥胖，肌肉质量和强度下降，疲劳，情绪低落，骨骼密度降低，积极性降低，并降低记忆力和注意力，其中用于制备提取物的植物部位可以选自叶，茎，嫩茎，嫩枝，地上部分，整个果实，果皮，种子，头状花序，根，树皮，硬木或整个植物或其混合物。
[0061]
在另一个实施方案中，本发明提供了如上所述的一种或多种组合物，用于获得至少一种与身体中增强的合成代谢和雄激素活性有关的选自改善睾丸激素水平，能量水平，能量持续，活力，耐力，健康老化，细胞寿命，肌肉质量，肌肉强度性功能(性欲和勃起功能)和心理健康(情绪和注意力)的健康益处；并减轻人类的压力和减轻与人类睾丸激素水平低有关的症状，例如性欲减退，勃起功能丧失，腹部肥胖，肌肉质量和强度下降，疲劳，情绪低落，骨骼密度降低，积极性降低，并降低记忆力和注意力，其中提取物或馏分被标准化为至少一种提取物或馏分中的植物化学参考标记化合物或生物活性标记。
[0062]
在另一个实施方案中，本发明提供了获得与体内增强的合成代谢和雄激素活性有关的至少一种健康益处的方法，所述益处选自改善睾丸激素水平，能量水平，持续能量，活力，耐力，健康衰老，细胞寿命，肌肉质量，肌肉强度的性功能(性欲和勃起功能)和心理健康(情绪和注意力)；并减轻压力以及减轻与睾丸激素水平低下有关的症状，例如性欲减退，勃起功能丧失，腹部肥胖，肌肉质量和强度下降，疲劳，情绪波动，骨骼密度降低，积极性降低以及记忆力和注意力下降，其中所述方法包括向所述人类受试者补充有效剂量的协同草药组合物，所述草药组合物包含选自石榴植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第一成分以及选自可可植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第二成分的组合。
[0063]
在另一个实施方案中，本发明提供了获得至少一种与体内增强的合成代谢和雄激素活性有关的健康益处的方法，所述健康益处选自改善哺乳动物或温血动物中睾丸激素水平，能量水平，持续能量，活力，体力，健康衰老，细胞寿命，肌肉体重，肌肉力量，性功能(性欲和勃起功能)和心理健康(情绪和注意力)；并减轻压力；并减轻与睾丸激素水平低下相关的症状，例如性欲减退，勃起功能丧失，腹部肥胖，肌肉质量和强度降低，疲劳，情绪波动，骨骼密度降低，积极性降低以及记忆力和注意力下降，其中所述方法包括用治疗有效剂量的协同草药组合物补充或治疗所述哺乳动物或温血动物，所述草药组合物包含选自石榴植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第一成分以及选自可可植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第二成分的组合，并任选包含至少一种选自药学上可接受的赋形剂，药学上可接受的稀释剂和药学上可接受的载体的附加成分。
[0064]
在另一个示例性实施方案中，本发明的协同草药组合物包含选自石榴植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第一成分以及选自可可植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第二成分的组合；可进一步与生物制剂以及一种或多种药学或营养学上可接受的赋形剂，载体以及选自单糖的稀释剂混合，例如葡萄糖，右旋糖，果糖，半乳糖等；二糖类，例如但不限于蔗糖，麦芽糖，乳糖，乳果糖，海藻糖纤维二糖，壳二糖等；诸如淀粉之类的碳水化合物和诸如羧基乙酸淀粉钠，预糊化淀粉，可溶性淀粉之类的改性淀粉以及诸如但不限于ultrasperse a&ultra
‑
tex 4的其他改性淀粉；由淀粉或糖原水解产生的糊精，例如黄色糊精，白色糊精，麦芽糊精等；多元醇或糖醇，例如但不限于山梨糖醇，甘露糖醇，肌醇，木糖醇，异麦芽酮糖醇等；纤维素基衍生物，例如但不限于微晶纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟乙基纤维素等；硅酸盐，例如但不限于硅酸铝镁，铝硅酸镁盐，滑石粉，胶体二氧化硅等；金属硬脂酸盐，例如但不限于硬脂酸钙，硬脂酸镁，硬脂酸锌等；柠檬酸，酒石酸，苹果酸，琥珀酸，乳酸，l
‑
抗坏血酸等有机酸；脂肪酸酯和聚山梨酸酯，天然树胶，例如但不限于阿拉伯胶，角叉菜胶，瓜尔胶，黄原胶等；维生素b组，烟酰胺，泛酸钙，氨基酸，蛋白质，例如但不限于酪蛋白，明胶，果胶，琼脂；有机金属盐，例如但不限于氯化钠，氯化钙，磷酸二钙，硫酸锌，氯化锌等；单独或组合使用上述成分的天然色素，调味剂，i级和ii级防腐剂以及水性，酒精，水醇，有机溶液。
[0065]
在另一个实施方案中，本发明的组合物可以配制成选自干粉形式，液体形式，饮料，食品，饮食补充剂或任何合适形式的剂型，例如片剂，胶囊剂或软咀嚼剂或软糖熊。
[0066]
在本发明的另一个实施方案中，可以将上述公开的组合物配制为营养/饮食补充
剂，其可以被考虑/制成健康食品剂型或特定健康用途的食品如巧克力或营养棒的固体食品，如奶油或果酱，或凝胶以及饮料等的半固体食品，例如清凉饮料，速溶饮料，体育运动员的功能性饮料，个人的锻炼和肌肉锻炼，乳酸菌饮料，滴剂，糖果，口香糖，软糖，酸奶，冰淇淋，布丁，小红豆果冻，果冻，饼干，茶，软饮料，果汁，牛奶，咖啡，谷类食品，小吃等。
[0067]
在另一个实施方案中，本发明提供了协同草药组合物，其包含选自石榴植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第一成分以及选自可可植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第二成分的组合，其中第一成分的重量在组合物中以10％
‑
90％的范围内变化并且第二成分的重量在90％
‑
10％的范围内变化。
[0068]
在又一个实施方案中，本发明提供了协同草药组合物，其中组合物标准化为安石榴甙的浓度范围为组合物重量的0.1％至20％，可可碱的浓度范围为组合物重量的0.1％至10％。
[0069]
在另一个方面，本发明的协同草药组合物包括选自石榴植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第一成分以及选自可可植物部分的提取物，馏分，活性化合物和植物化学物质或其混合物的第二成分的组合，并可选地与微量营养素混合，如镁，锌和硼的元素或包含这些元素的化合物；或氨基酸，例如d
‑
天门冬氨酸。
[0070]
在另一个实施方案中，本发明的组合物可以通过包括纳米技术，微囊化，胶体载体系统和其他药物递送系统的技术来利用控释聚合物基包衣以控释片剂的形式递送以获得所需的治疗效益。
[0071]
本领域普通技术人员将理解，可以在不脱离本发明的广泛发明构思的情况下对上述实施例进行改变。因此，应理解，本发明不限于在此公开的特定实施例或示例，而是旨在涵盖在说明书中所限定的本发明的目的和范围内的修改。所提供的实施例说明了本发明，但不应认为它们以任何方式限制本发明的范围。
[0072]
实施例
[0073]
示例1：石榴乙醇和乙醇水溶液提取物的制备
[0074]
将石榴果皮(100g)粉碎，并将粉末用乙醇(700ml)在室温下提取1小时。过滤提取液，用过的原料在相似条件下用乙醇(2
×
500ml)重新提取两次。将合并的提取物过滤并在真空下浓缩以获得乙醇提取物残余物(p.g
‑
1；17.5g)。
[0075]
石榴果皮的90％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
2；16.5g)，80％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
3；27.0g)，70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4；35.7g)和50％乙醇水溶液提取物(p.g)
‑
5；38.0g)通过采用与上述类似的提取步骤分别使用90％乙醇水溶液，80％乙醇水溶液，70％乙醇水溶液和50％乙醇水溶液作为提取溶剂而获得。
[0076]
示例2：石榴水提取物的制备
[0077]
将石榴果皮(100g)粉碎，并在室温下用水(700ml)提取粉末1小时。过滤提取液，并在相似条件下用水(2
×
500ml)将用过的原料再次提取两次。将合并的提取物过滤并在真空下浓缩以获得水提取物的残余物(p.g
‑
6；38.5g)。
[0078]
示例3：石榴的甲醇和甲醇水溶液提取物的制备
[0079]
将石榴果皮(100g)粉碎，并将粉末在室温下用甲醇(700ml)提取1小时。过滤提取液，用过的原料在相似的条件下用甲醇(2
×
500ml)提取两次。将合并的提取物过滤并在真
空下浓缩以获得甲醇提取物的残余物(p.g
‑
7；25.0g)。
[0080]
采用50％甲醇水溶液作为提取溶剂，采用同样的方法，得到石榴果皮的50％甲醇水溶液提取物(p.g
‑
8；34.4g)。
[0081]
示例4：石榴的丙酮和丙酮水溶液提取物的制备
[0082]
将石榴果皮(100g)粉碎，并将粉末用丙酮(700ml)于室温提取1小时。过滤提取物，用过的原料在相似条件下用丙酮(2
×
500ml)再提取两次。将合并的提取物过滤并在真空下浓缩以获得丙酮提取物的残余物(p.g
‑
9；4.2g)。
[0083]
采用50％丙酮水溶液作为提取溶剂，采用类似的方法，得到了石榴皮50％丙酮水溶液提取物(p.g
‑
10；47.6g)。
[0084]
示例5：石榴的乙酸乙酯提取物的制备
[0085]
将石榴果皮(100g)粉碎，并将粉末用乙酸乙酯(700ml)在室温下提取1小时。过滤提取液，用过的原料在相似条件下用乙酸乙酯(2
×
500ml)提取两次。将合并的提取物过滤并在真空下浓缩以获得乙酸乙酯提取物的残余物(p.g
‑
11；1.1g)。
[0086]
示例6：石榴提取物的标准化
[0087]
通过分析型hplc方法将石榴的各种提取物标准化为安石榴甙，结果总结于表1中。
[0088]
表1：
[0089][0090]
示例7：可可种子水提取物的制备
[0091]
将可可种子(100g)粉碎，并在室温下用水(700ml)提取粉末1小时。过滤提取液，并在相似条件下用水(2
×
500ml)将用过的原料再次提取两次。将合并的提取物过滤并真空浓缩，得到水提取物的残余物，为粉末(t.c
‑
1；11.3g)。
[0092]
示例8：可可种子乙醇和乙醇水溶液提取物的制备
[0093]
将可可种子(100g)粉碎，并将粉末用50％乙醇水溶液(700ml)在室温下提取1小
时。过滤提取液，用过的原料在相似条件下用50％乙醇水溶液(2
×
500ml)再提取两次。将合并的提取物过滤并在真空下浓缩以获得50％乙醇水溶液提取物的残余物(t.c
‑
2；9.9g)。
[0094]
分别使用乙醇，90％乙醇水溶液和70％乙醇水溶液作为提取溶剂采用相似的提取步骤获得可可种子的乙醇提取物(t.c
‑
3；4.4g)，90％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
4；4.5g)和70％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
5；8.3g)。
[0095]
示例9：可可种子甲醇和甲醇水溶液提取物的制备
[0096]
将可可种子(100g)粉碎，并将粉末用甲醇(700ml)在室温下提取1小时。过滤提取液，用过的原料在相似条件下用甲醇(2
×
500ml)提取两次。将合并的提取物过滤并在真空下浓缩以获得甲醇提取物的残余物(t.c
‑
6；5.8g)。
[0097]
可可种子的50％甲醇水溶液提取物(t.c
‑
7；10.0g)通过类似的步骤得到，使用50％甲醇作为提取溶剂。
[0098]
示例10：可可种子丙酮和丙酮水提物的制备
[0099]
粉碎可可种子(100g)，并在室温下用丙酮(700ml)提取粉末1h。过滤提取物，用过的原料在相似条件下用丙酮(2
×
500ml)再提取两次。将合并的提取物过滤并在真空下浓缩以获得丙酮提取物的残余物(t.c
‑
8；27.5g)。
[0100]
可可种子的50％丙酮水提物(t.c
‑
9；13.5g)是通过使用50％丙酮作为提取溶剂的类似方法获得的。
[0101]
示例11：可可种子乙酸乙酯提取物的制备
[0102]
将可可种子(100g)粉碎，并将粉末用乙酸乙酯(700ml)在室温下提取1小时。过滤提取液，用过的原料在相似条件下用乙酸乙酯(2
×
500ml)提取两次。将合并的提取物过滤并在真空下浓缩以获得乙酸乙酯提取物(t.c
‑
10；28.5g)。
[0103]
示例12：可可种子提取物的标准化
[0104]
通过分析型hplc方法将可可种子的各种提取物标准化为可可碱，结果总结于表2中。
[0105]
表2：
[0106][0107]
示例13：包含石榴皮的70％乙醇水溶液提取物和可可种子水提取物的组合物的制备。
[0108]
组合物
‑
1(c
‑
1)：通过以4∶1的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可水提取物(t.c
‑
1)来制备组合物
‑
1。
[0109]
组合物
‑
2(c
‑
2)：通过以3∶1的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可水提取物(t.c
‑
1)来制备组合物
‑
2。
[0110]
组合物
‑
3(c
‑
3)：通过以2∶1的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可水提取物(t.c
‑
1)来制备组合物
‑
3。
[0111]
组合物
‑
4(c
‑
4)：通过将石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可水提取物(t.c
‑
1)以1∶1的比例混合来制备组合物
‑
4。
[0112]
组合物
‑
5(c
‑
5)：通过以1∶2的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可水提取物(t.c
‑
1)来制备组合物
‑
5。
[0113]
组合物
‑
6(c
‑
6)：通过以1：3的比例混合石榴70％乙醇水溶液(p.g
‑
4)和可可水提取物(t.c
‑
1)来制备组合物
‑
6。
[0114]
组合物
‑
7(c
‑
7)：通过以1∶4的比例混合石榴70％乙醇提取物(p.g
‑
4)和可可水提取物(t.c
‑
1)来制备组合物
‑
7。
[0115]
示例14：包含石榴皮的70％乙醇水溶液提取物和可可种子的50％乙醇水溶液提取物的组合物的制备。
[0116]
组合物
‑
8(c
‑
8)：通过以4∶1的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)来制备组合物
‑
8。
[0117]
组合物
‑
9(c
‑
9)：通过以3∶1的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)来制备组合物
‑
9。
[0118]
组合物
‑
10(c
‑
10)：通过以2∶1的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)来制备组合物
‑
10。
[0119]
组合物
‑
11(c
‑
11)：通过以1∶1的比例将石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)混合来制备组合物
‑
11。
[0120]
组合物
‑
12(c
‑
12)：通过以1∶2的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)来制备组合物
‑
12。
[0121]
组合物
‑
13(c
‑
13)：通过以1∶3的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)来制备组合物
‑
13。
[0122]
组合物
‑
14(c
‑
14)：通过以1∶4的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)来制备组合物
‑
14。
[0123]
示例15：包含石榴皮70％乙醇水溶液提取物，和可可种子90％乙醇水溶液或70％乙醇水溶液提取物的组合物的制备。
[0124]
组合物
‑
15(c
‑
15)：通过以4∶1的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可90％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
4)来制备组合物
‑
15。
[0125]
组合物
‑
16(c
‑
16)：通过以3∶1的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可90％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
4)来制备组合物
‑
16。
[0126]
组合物
‑
17(c
‑
17)：通过以2∶1的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可90％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
4)来制备组合物
‑
17。
[0127]
组合物
‑
18(c
‑
18)：通过以1∶1的比例将石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可90％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
4)混合来制备组合物
‑
18。
[0128]
组合物
‑
19(c
‑
19)：通过以1∶2的比例将石榴石70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可90％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
4)混合来制备组合物
‑
19。
[0129]
组合物
‑
20(c
‑
20)：通过以1∶3的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可90％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
4)来制备组合物
‑
20。
[0130]
组合物
‑
21(c
‑
21)：通过以1∶4的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可90％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
4)来制备组合物
‑
21。
[0131]
组合物
‑
22(c
‑
22)：通过以4∶1的比例将石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可70％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
5)混合来制备组合物
‑
22。
[0132]
组合物
‑
23(c
‑
23)：通过以3∶1的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可70％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
5)来制备组合物
‑
23。
[0133]
组合物
‑
24(c
‑
24)：通过以2∶1的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可70％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
5)来制备组合物
‑
24。
[0134]
组合物
‑
25(c
‑
25)：通过以1∶1的比例将石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可70％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
5)混合来制备组合物
‑
25。
[0135]
组合物
‑
26(c
‑
26)：通过以1∶2的比例将石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可70％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
5)混合来制备组合物
‑
26。
[0136]
组合物
‑
27(c
‑
27)：通过以1∶3的比例将石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可70％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
5)混合来制备组合物
‑
27。
[0137]
组合物
‑
28(c
‑
28)：通过以1∶4的比例将石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可
可70％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
5)混合来制备组合物
‑
28。
[0138]
示例16：包含石榴皮70％乙醇水溶液提取物和可可种子的甲醇或50％甲醇或丙酮或50％丙酮或乙酸乙酯水溶液提取物的组合物的制备。
[0139]
组合物
‑
29(c
‑
29)：通过将石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可甲醇提取物(t.c
‑
6)以2∶1的比例混合来制备组合物
‑
29。
[0140]
组合物
‑
30(c
‑
30)：通过以1：1的比例将石榴70％的乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可甲醇提取物(t.c
‑
6)混合来制备组合物
‑
30。
[0141]
组合物
‑
31(c
‑
31)：通过以1∶2的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可甲醇提取物(t.c
‑
6)来制备组合物
‑
31。
[0142]
组合物
‑
32(c
‑
32)：通过以2∶1的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可50％甲醇提取物(t.c
‑
7)来制备组合物
‑
32。
[0143]
组合物
‑
33(c
‑
33)：通过以1∶1的比例将石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可50％甲醇提取物(t.c
‑
7)混合来制备组合物
‑
33。
[0144]
组合物
‑
34(c
‑
34)：通过以1∶2的比例将石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可50％甲醇提取物(t.c
‑
7)混合来制备组合物
‑
34。
[0145]
组合物
‑
35(c
‑
35)：通过以2∶1的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可丙酮提取物(t.c
‑
8)来制备组合物
‑
35。
[0146]
组合物
‑
36(c
‑
36)：通过以1：1的比例将石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可丙酮提取物(t.c
‑
8)混合来制备组合物
‑
36。
[0147]
组合物
‑
37(c
‑
37)：通过以1∶2的比例将石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可丙酮提取物(t.c
‑
8)混合来制备组合物
‑
37。
[0148]
组合物
‑
38(c
‑
38)：通过以2∶1的比例将石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可50％丙酮水溶液提取物(t.c
‑
9)混合来制备组合物
‑
38。
[0149]
组合物
‑
39(c
‑
39)：通过以1∶1的比例将石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可50％丙酮水溶液提取物(t.c
‑
9)混合来制备组合物
‑
39。
[0150]
组合物
‑
40(c
‑
40)：通过以1：2的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可50％丙酮水溶液提取物(t.c
‑
9)来制备组合物
‑
40。
[0151]
组合物
‑
41(c
‑
41)：通过以2∶1的比例混合石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可乙酸乙酯提取物(t.c
‑
10)来制备组合物
‑
41。
[0152]
组合物
‑
42(c
‑
42)：通过以1∶1的比例将石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可乙酸乙酯提取物(t.c
‑
10)混合来制备组合物
‑
42。
[0153]
组合物
‑
43(c
‑
43)：通过以1∶2的比例将石榴70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)和可可乙酸乙酯提取物(t.c
‑
10)混合来制备组合物
‑
43。
[0154]
示例17：包含石榴皮的乙醇或50％乙醇水溶液或水提取物和可可种子乙醇或水或50％乙醇水溶液提取物的组合物的制备。
[0155]
组合物
‑
44(c
‑
44)：通过以2：1的比例混合石榴乙醇提取物(p.g
‑
1)和可可乙醇提取物(t.c
‑
3)来制备组合物
‑
44。
[0156]
组合物
‑
45(c
‑
45)：通过以1：1的比例混合石榴乙醇提取物(p.g
‑
1)和可可乙醇提取物(t.c
‑
3)来制备组合物
‑
45。
[0157]
组合物
‑
46(c
‑
46)：通过以1∶2的比例混合石榴乙醇提取物(p.g
‑
1)和可可乙醇提取物(t.c
‑
3)来制备组合物
‑
46。
[0158]
组合物
‑
47(c
‑
47)：通过以2∶1的比例混合石榴乙醇提取物(p.g
‑
1)和可可水提取物(t.c
‑
1)来制备组合物
‑
47。
[0159]
组合物
‑
48(c
‑
48)：通过以1：1的比例将石榴乙醇提取物(p.g
‑
1)和可可水提取物(t.c
‑
1)混合来制备组合物
‑
48。
[0160]
组合物
‑
49(c
‑
49)：通过以1：2的比例混合石榴乙醇提取物(p.g
‑
1)和可可水提取物(t.c
‑
1)来制备组合物
‑
49。
[0161]
组合物
‑
50(c
‑
50)：通过以2∶1的比例混合石榴50％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
5)和可可乙醇提取物(t.c
‑
3)来制备组合物
‑
50。
[0162]
组合物
‑
51(c
‑
51)：通过以1∶1的比例将石榴50％乙醇水溶液(p.g
‑
5)和可可乙醇提取物(t.c
‑
3)混合来制备组合物
‑
51。
[0163]
组合物
‑
52(c
‑
52)：通过以1∶2的比例将石榴50％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
5)和可可乙醇提取物(t.c
‑
3)混合来制备组合物
‑
52。
[0164]
组合物
‑
53(c
‑
53)：通过以2∶1的比例混合石榴50％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
5)和可可水提取物(t.c
‑
1)来制备组合物
‑
53。
[0165]
组合物
‑
54(c
‑
54)：通过以1∶1的比例将石榴50％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
5)和可可水提取物(t.c
‑
1)混合而制备组合物
‑
54。
[0166]
组合物
‑
55(c
‑
55)：通过以1∶2的比例将石榴50％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
5)和可可水提取物(t.c
‑
1)混合而制备组合物
‑
55。
[0167]
组合物
‑
56(c
‑
56)：通过以2∶1的比例将石榴水提取物(p.g
‑
6)和可可50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)混合来制备组合物
‑
56。
[0168]
组合物
‑
57(c
‑
57)：通过以1：1的比例将石榴水提取物(p.g
‑
6)和可可50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)混合来制备组合物
‑
57。
[0169]
组合物
‑
58(c
‑
58)：通过以1∶2的比例将石榴水提取物(p.g
‑
6)和可可50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)混合来制备组合物
‑
58。
[0170]
组合物
‑
59(c
‑
59)：通过以2∶1的比例将石榴水提取物(p.g
‑
6)和可可水提取物(t.c
‑
1)混合来制备组合物
‑
59。
[0171]
组合物
‑
60(c
‑
60)：通过以1：1的比例将石榴水提取物(p.g
‑
6)和可可水提取物(t.c
‑
1)混合来制备组合物
‑
60。
[0172]
组合物61(c
‑
61)：通过以1∶2的比例将石榴水提取物(p.g
‑
6)和可可水提取物(t.c
‑
1)混合来制备组合物
‑
61。
[0173]
示例18：含有石榴皮的甲醇，50％甲醇水溶液或丙酮或50％丙酮水溶液或乙酸乙酯提取物和可可种子50％乙醇水溶液或水提取物的组合物的制备。
[0174]
组合物
‑
62(c
‑
62)：通过以2∶1的比例将石榴甲醇提取物(p.g
‑
7)和可可50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)混合来制备组合物
‑
62。
[0175]
组合物
‑
63(c
‑
63)：通过以1：1的比例将石榴甲醇提取物(p.g
‑
7)和可可50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)混合来制备组合物
‑
63。
[0176]
组合物
‑
64(c
‑
64)：通过以1∶2的比例将石榴甲醇提取物(p.g
‑
7)和可可50％乙醇
水溶液提取物(t.c
‑
2)混合来制备组合物
‑
64。
[0177]
组合物
‑
65(c
‑
65)：通过以2∶1的比例混合石榴50％甲醇水溶液提取物(p.g
‑
8)和可可水提取物(t.c
‑
1)来制备组合物
‑
65。
[0178]
组合物
‑
66(c
‑
66)：通过以1∶1的比例将石榴50％甲醇水溶液提取物(p.g
‑
8)和可可水提取物(t.c
‑
1)混合来制备组合物
‑
66。
[0179]
组合物
‑
67(c
‑
67)：通过以1∶2的比例混合石榴50％甲醇水溶液提取物(p.g
‑
8)和可可水提取物(t.c
‑
1)来制备组合物
‑
67。
[0180]
组合物
‑
68(c
‑
68)：通过以2∶1的比例混合石榴丙酮提取物(p.g
‑
9)和可可50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)来制备组合物
‑
68。
[0181]
组合物
‑
69(c
‑
69)：通过以1：1的比例将石榴丙酮提取物(p.g
‑
9)和可可50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)混合来制备组合物
‑
69。
[0182]
组合物
‑
70(c
‑
70)：通过以1：2的比例混合石榴丙酮提取物(p.g
‑
9)和可可50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)来制备组合物
‑
70。
[0183]
组合物
‑
71(c
‑
71)：通过以2∶1的比例将石榴50％丙酮水溶液提取物(p.g
‑
10)和可可水提取物(t.c
‑
1)混合来制备组合物
‑
71。
[0184]
组合物
‑
72(c
‑
72)：通过以1：1的比例将石榴50％的丙酮水溶液提取物(p.g
‑
10)和可可水提取物(t.c
‑
1)混合而制备组合物
‑
72。
[0185]
组合物
‑
73(c
‑
73)：通过以1∶2的比例混合石榴50％丙酮水溶液提取物(p.g
‑
10)和可可水提取物(t.c
‑
1)来制备组合物
‑
73。
[0186]
组合物
‑
74(c
‑
74)：通过将石榴乙酸乙酯提取物(p.g
‑
11)和可可水提取物(t.c
‑
1)以2：1的比例混合来制备组合物
‑
74。
[0187]
组合物
‑
75(c
‑
75)：通过将石榴乙酸乙酯提取物(p.g
‑
11)和可可水提取物(t.c
‑
1)以1：1的比例混合来制备组合物
‑
75。
[0188]
组合物
‑
76(c
‑
76)：通过以1：2的比例混合石榴乙酸乙酯提取物(p.g
‑
11)和可可水提取物(t.c
‑
1)来制备组合物
‑
76。
[0189]
示例19：组合物的配方
[0190]
组合物
‑
77(c
‑
77)：组合物
‑
77是通过在乙醇/水的存在下，将60g石榴皮70％乙醇水溶液提取物(p.g
‑
4)，15g可可水提取物(t.c
‑
1)，10g的ultrasperse a，13g的微晶纤维素和2g的二氧化硅混合，然后干燥以得到组合物。
[0191]
组合物
‑
78(c
‑
78)：组合物
‑
78是通过在乙醇/水存在下，将60g石榴皮70％乙醇水溶液提取物p.g
‑
4)，15g可可50％乙醇水溶液提取物(t.c
‑
2)，23g麦芽糊精和2g二氧化硅混合，然后进行干燥得到组合物。
[0192]
示例20：睾丸激素测定的一般程序
[0193]
评价了草药提取物及其组合物在ma
‑
10小鼠间质细胞系(at.cc，manassas，va，usa)中诱导睾丸激素产生的能力。将细胞在添加有15％马血清和20mm hepes的dmem：f12培养基(atcc，manassas，va，usa)存在下于0.1％明胶包被的烧瓶中在co2培养箱中于37℃培养。将相同数量的细胞铺在明胶包被的96孔细胞培养板的每个孔中，并使其附着过夜。洗涤的细胞补充无血清的dmem：f12培养基，并用不同浓度的测试样品处理并进一步孵化48小时。接受0.2％dmso的培养孔被视为媒介物对照组，而促黄体生成素被用作阳性对照组。收
集培养上清液，在10000g下于4℃澄清5分钟，并使用特定的市售elisa试剂盒进行睾丸激素评估。
[0194]
elisa是根据制造商的规程，使用睾丸激素eia试剂盒(开曼化学，美国密歇根州安阿伯)进行的。该试验基于睾丸激素和睾丸激素
‑
乙酰胆碱酯酶(ache)偶联物(睾丸激素示踪剂)之间竞争有限量的睾丸激素抗体。含有ache底物的ellman试剂可用于检测酶的活性。酶反应产物的颜色为黄色，在412nm处强烈吸收。颜色的强度与结合在孔上的睾丸激素示踪剂的量成正比，与测试样品中可用的睾丸激素成反比。50微升无细胞培养上清液的样品用于估计睾丸激素的含量。根据规程，用一组已知浓度的睾丸激素标准绘制标准曲线。报道的测定试剂盒的灵敏度为6pg/ml。结果总结在表3
‑
8中。
[0195]
表3：包含石榴皮70％乙醇提取物和可可种子水提取物的组合物的睾丸激素活性。
[0196][0197]
表4：包含石榴皮的70％乙醇提取物和可可种子50％乙醇水溶液提取物的组合物的睾丸激素活性。
[0198][0199][0200]
表5：包含石榴皮70％乙醇提取物和可可种子90％乙醇水溶液提取物或70％乙醇水溶液提取物的组合物的睾丸激素活性。
[0201][0202]
表6：包含石榴皮的70％乙醇提取物和可可种子甲醇水溶液或50％丙酮水溶液或乙酸乙酯提取物的组合物的睾酮活性。
[0203][0204][0205]
表7：包含石榴皮乙醇或50％乙醇水溶液或水提取物和可可种子乙醇或水或50％乙醇水溶液提取物的组合物的睾丸激素活性。
[0206][0207][0208]
表8：包含石榴皮甲醇或50％甲醇水溶液或50％丙酮水溶液或乙酸乙酯提取物和可可种子50％乙醇水溶液或水提取物的组合物的睾丸激素活性。
[0209][0210]
示例21：芳香酶抑制试验的一般程序
[0211]
如samson等人所述(samson m.等人，j.steroid biochem.mol.biol.2009，116，154
‑
159)，使用修饰的完整细胞在培养基中确定芳香酶的抑制作用。简而言之，从培养瓶中收获胎盘绒毛膜癌(jeg
‑
3)细胞(atcc；目录号htb
‑
36)，将40000个细胞/孔接种到含200μl emem(hi
‑
media；目录号al047s)中)+5％木炭剥离的fbs(thermo fisher；cat#12676011)培养基的96孔板上，并在co2培养箱中培养48小时。孵育后，向旧培养基中补充150μl新鲜emem+5％木炭剥离的fbs培养基。用不同浓度的测试样品处理细胞，并在co2培养箱中孵育1小时(预处理)。孵育后，除载体对照组(cells+0.2％dmso)以外的所有细胞均用50nm的4
‑
雄烯
‑
3,17
‑
二酮(induction；sigma cat#46033
‑
250mg)，和芳香化酶底物处理，并在co2培养箱中孵育48小时。48小时后，将培养板以270xg离心10分钟，并收集无细胞的上清液，并储存在
‑
80℃的冰箱中直至分析。根据制造商的规程，使用arbor分析(目录号k031
‑
h5)的eia试剂盒对雌酮进行酶免疫分析(eia)。通过以下公式计算芳香酶的抑制百分比：
[0212]
芳香酶的抑制百分比＝[(诱导中的雌酮的归一化浓度)
‑
(测试样品中的雌酮的归一化浓度)]/(诱导中的雌酮的归一化浓度)
×
100。结果示于表9
‑
13。
[0213]
表9：包含石榴皮70％乙醇提取物和可可种子50％乙醇水溶液提取物的组合物的芳香酶抑制活性。
[0214][0215]
表10：包含石榴皮的70％乙醇提取物和可可种子90％乙醇水溶液或70％乙醇水溶液提取物的组合物的芳香酶抑制活性。
[0216][0217]
表11：包含石榴皮的70％乙醇提取物和可可种子甲醇水溶液或50％丙酮水溶液或乙酸乙酯水溶液的组合物的芳香酶抑制活性。
[0218]
[0219][0220]
表
‑
12：包含石榴皮乙醇或50％乙醇水溶液或水提取物和可可种子乙醇或50％乙醇水提取物的组合物的芳香酶抑制活性。
[0221]
[0222][0223]
表13：包含石榴皮甲醇或50％甲醇水溶液或50％丙酮水溶液或乙酸乙酯提取物和可可种子50％乙醇水溶液提取物的组合物的芳香酶抑制活性。
[0224][0225]
示例22：线粒体生物发生测定
[0226]
线粒体生物发生测定是按照制造商的规程，使用从abcam(cambridge，uk；cat#ab110217)获得的细胞内elisa试剂盒进行的。在每个孔中同时测量两种线粒体蛋白的水平。这两种蛋白质分别是不同的氧化磷酸化酶复合物的亚基，一种蛋白质是复合物iv(cox
‑
1)的亚基i，它是线粒体dna(mtdna)编码的，另一种是复合物ii(sdh
‑
a)的70kda亚基，它是核dna(ndna)编码的。对于该测定，将补充有10％fbs的dmem培养基(sigma cat#d7777)中的大鼠骨骼(l6)细胞(at.cc，manassas，va；目录号crl
‑
1458)接种(10000个细胞/孔)于96孔的聚l
‑
赖氨酸包被的板中，在co2培养箱中于37℃下培养过夜。第二天，除去培养基，并用不同浓度的各个测试样品处理细胞。每天重复治疗，直至第3天。接受0.2％dmso的培养孔被认
为是媒介物对照组。处理期后，将细胞用4％多聚甲醛固定并用一抗(cox
‑
1和sdh
‑
a)进行探测。碱性磷酸酶(ap)和辣根过氧化物酶(hrp)标记的二抗分别用于sdh
‑
a和cox
‑
1。最后，添加ap/hrp显影液，并在多模式分光光度计(spectramax 2e)中测量405nm和600nm的吸光度。计算所有治疗的(cox
‑
1)与(sdh
‑
a)信号比，以分析治疗效果。使用以下公式计算线粒体生物发生量相对于对照组的增加百分比：
[0227][0228]
结果列于表14。
[0229]
表14：含有石榴皮的70％乙醇提取物和可可种子水或50％乙醇水溶液或90％乙醇水溶液提取物的组合物的线粒体生物发生增加。
[0230][0231][0232]
示例23：mtor磷酸化测定的通用程序
[0233]
在蛋白质印迹分析中评估mtor磷酸化：将大鼠l6成肌细胞(在2ml中的6x105细胞/
孔)接种在60mm细胞培养皿中，并在5％co2的潮湿气氛中于37℃保持在含有10％fbs的dmem培养基中。第二天，将细胞替换为无血清dmem培养基，并再维持18小时。在无血清dmem培养基(总体积为1ml)中用不同浓度的测试样品处理细胞，并在co2培养箱中于37℃孵育120分钟。0.2％dms o处理的细胞用作媒介物对照组。
[0234]
免疫印迹：孵育后，将细胞培养皿放在冰盘上，并用1xpbs洗涤两次。七十微升裂解缓冲液(10mm tris
‑
hcl ph 7.4、150mm nacl，1mm edta，1mm苯甲基磺酰氟，10μg/ml抑肽酶，10μg/ml亮肽素，1％triton x
‑
100、1mm naf，1mm na3vo4，0.5％脱氧胆酸钠和1μm抑肽素)加入每个培养皿中，并超声处理30秒。匀浆后，将样品在4℃下以16128xg离心10分钟，以沉淀未破碎的细胞和细胞核。收集上清液，并使用pierce bca蛋白测定试剂盒(thermo scientific cat#23225)对蛋白质进行定量。对蛋白质样品进行sds
‑
page，并使用湿印迹法将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。简而言之，将22μg的蛋白质上样到丙烯酰胺凝胶上(分离度为7.5％)，并在100v下运行约1小时40分钟。在运行结束时，通过将转移系统置于4℃腔室(100v 2小时)以将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。转移后，将膜在含0.05％tween20(tbst)的0.1m tris缓冲盐水中洗涤，并在superblock封闭缓冲液(thermo scientific cat#37535)中封闭，并持续搅拌30分钟。将该膜在tbst中与识别磷酸
‑
mtor(磷酸化位点：ser2448；cell signaling technology cat#2971)和mtor(cell signaling technology cat#2983)蛋白的一级抗体在搅拌下于4℃孵育16小时。将膜洗涤3次，并与过氧化物酶亲和山羊抗兔二抗(jackson immunoresearch cat#111
‑
035
‑
045；1：10000稀释)一起在室温及搅拌下孵育1小时，然后在tbst中洗涤3次，每次5分钟。使用化学发光底物(thermo scientific cat#34080)检测免疫反应性条带，并使用bio
‑
rad分子成像仪(model：chemidoc xrs+)捕获图像。通过在室温下孵育1小时，将膜上的mtor磷光体和mtor抗体剥离，并用抗β
‑
肌动蛋白抗体(sigma cat#a4700
‑
100ul；1：10000稀释液)重新探测，并捕获图像。使用carestream mi软件计算磷酸
‑
mtor和mtor蛋白条带的强度，并使用β
‑
肌动蛋白进行归一化。通过磷酸
‑
mtor(pmtor)和mtor谱带强度之比计算mtor活化。在媒介物对照组中获得的pmtor/mtor比例基础上，计算了各个成分或组合物的相对mtor活化。表15列出了mtor活化的增加量(pmtor/mtor)。
[0235]
表15：包含石榴皮70％乙醇提取物和可可种子50％乙醇水溶液提取物的组合物的mtor活化增加。
[0236]
[0237][0238]
示例24：在sprague dawley大鼠中体内评估组合物
‑
77(c
‑
77)和组合物
‑
78(c
‑
78)促进睾丸激素的作用。
[0239]
方法：使雄性sprague dawley大鼠适应，将21只动物随机分为三组(g1至g3)。治疗组动物每天在10ml媒介物(0.5％cmc钠水溶液)中补充c
‑
77(g2；100mg/kg)或c
‑
78(g3；100mg/kg；po)，持续3周，每天一次。对照组(g1)仅补充10ml媒介物。从所有动物中采集血液样本；在第22天分离血清并通过elisa分析睾丸激素水平。
[0240]
在处死之日，即在第22天，对动物实施安乐死，将尾附睾和输精管(两侧)切开，并将精液挤出到dulbecco磷酸盐缓冲盐水中进行精液分析。
[0241]
结果表示为平均值
±
s.e.m。使用一种方差分析方法对数据进行统计分析，然后进行dunnett事后检验，以使用graphpad prism v5.01(graphpad software，inc.，ca，usa)对所有组与正常对照组(g1)进行比较。p<0.05被认为具有统计学意义。在整个治疗期间，所有组之间均未观察到异常的临床体征和体重差异，表明测试项目c
‑
77和c
‑
78的安全性。与对照组相比，治疗组在第22天的血清样品中睾丸激素水平升高。表16总结了不同治疗组所表现出的睾丸激素水平，并在图i中进行了描述。类似地，与表17总结并在图ii中所描述的对照组相比，所有治疗组的精液参数均得到了改善。
[0242]
表
‑
16：血清睾丸激素水平(ng/ml)
[0243][0244]
数据表示为平均值
±
s.e.m.n＝7；*表示相对于g1的显著性(p<0.05)，单向方差分析，然后是dunnett的事后测试vs g1
[0245]
表17：精液参数
[0246][0247]
数据表示为平均值
±
s.e.m.n＝7。