用于治疗颞颌关节退化的缓释组成物及方法与流程

本发明在美国政府的支持下，基于美国国家牙科和颅面研究所授予的r41de028215项目而完成。因此，美国政府可对本文所描述和请求保护的发明享有特定权利。

本申请主张于2018年6月22日提交的美国临时专利申请案62/688,545的优先权，上述临时专利申请案的内容通过引用整体并入本文。

本发明涉及用于治疗颞颌关节退化(tmj)的组成物和方法，包括tmj骨关节炎。

背景技术：

下面的讨论仅为帮助读者理解公开的内容，其旨并非为描述或构成其现有技术。

颞颌关节(tmj)是一个复杂的关节系统，对于咬合、咀嚼、呼吸和言语至关重要。tmj由肌肉、韧带、纤维软骨盘和髁的网络组成。颞颌关节创伤和退化性疾病，包括颞颌关节骨关节炎(oa)，会使人衰弱且影响生活质量。tmj疾病困扰着1000多万美国人，每年花费约40亿美元，是美国国家牙科和颅面研究所的研究重点之一。目前tmjoa的疗法通常为两种极端之一：缓和疼痛处理或侵入性手术。手术包括全关节置换，其失败率高。目前针对病理机制和促进先天组织再生的微创和定向tmj疗法还很匮乏。

解剖学上，颞颌关节髁契合于颞骨的盂状窝。椎间盘将关节空间分为下关节腔和上关节腔，分别有利于旋转和平移力学。称为关节囊的纤维膜围绕整个tmj，并将两个关节腔完全包围。髁和椎间盘的关节面由纤维软骨组成。与透明软骨不同，纤维软骨由纤维组织和软骨组织组成，分别提供抗张强度和抗压强度。tmj髁经过软骨内骨化，使软骨原基被再吸收并被骨骼取代。髁生长的特点是有良适定义的细胞成熟区，包括具有纤维软骨干细胞(fcscs)的表层区(sz)、含有异质细胞的多形区(pm)、具有软骨细胞的成熟区(mz)、具有最后分化的肥大软骨细胞的肥大区(hz)，以及再吸收软骨并形成骨骼的蚀骨区(ez)。

存在于tmj髁表层区(sz)的纤维软骨干细胞(fcscs)自我组织、植入受伤组织中，并再生软骨及血管化骨这两者。wnt/链蛋白信号诱导fcscs增殖并抑制其分化，而过度活化的wnt/链蛋白信号则会消耗fcscs并引发tmjoa。

透明质酸(ha)是一种非硫酸化的糖胺聚醣，广泛地存在于结缔组织的细胞外基质中。ha天然地存在于软骨和关节滑液中，在关节的健康中扮演着多重的关键作用。ha的长链对于连接软骨中的蛋白聚醣聚合体至关重要，其为关节力学提供结构支持。ha也与润滑素形成复合物，并促进关节润滑。在滑液中，ha调节抗疼痛及抗发炎的作用。此外，ha水凝胶的关节内注射已获fda批准以用于治疗膝骨关节炎。ha水凝胶具有生物降解性、非免疫原性，且已用于包封生长因子和分子，以提供数周的缓释。

注射透明质酸已被探讨作为一种用于tmjoa的可能疗法，但结果尚无定论。

聚(dl乳酸-乙醇酸共聚物)(plga)是由乙醇酸和乳酸共聚(或有时由各自的环状内酯共聚，如由乙醇酸和乳酸交酯共聚)而成的聚酯共聚物。plga有时也称为聚(dl乳酸交酯-乙交酯共聚物)。plga已用于输送活性剂给患者。请参见，例如：makadia等人的-polymers(basel).2011sep1；3(3):1377–1397.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc3347861/；koda等人的-journalofophthalmology,volume2017,articleid1598218,

https://www.hindawi.com/journals/joph/2017/1598218/；以及wu等人的-drugdeliveryvolume24,2017-issue1

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/10717544.2017.1381200，其通过引用整体并入本文。plga为市售可得的(例如从西格玛奥瑞奇公司商购)。

利用常驻干细胞的再生能力来修复tmj组织，代表了一种用于tmjoa的微创干细胞疗法。tmj纤维软骨干细胞(fcscs)存在于tmj髁表层区。移植的fcscs会自我组织、再生软骨和血管化骨，并植入受损的宿主组织中。参见embree等人的“利用内源性纤维软骨干细胞再生软骨并修复关节损伤”–naturecommun.doi:10.1038/ncomms13073(2016)，通过引用将其整体并入本文。

由于细胞数量有限且缺乏血管供应，软骨的再生性不佳。因此，tmj损伤和慢性退化性疾病，包括tmj骨关节炎(oa)，会引起疼痛、功能障碍和不可逆的组织受损。tmj创伤/退化的临床治疗是有限的，且涉及缓和疗护或侵入性外科手术，这些手术往往会失败或造成进一步损伤。目前临床上尚无促进tmj再生的微创细胞疗法。向医学界提供这种疗法，将对患有tmj退化(如tmjoa)的患者带来显著益处。

技术实现要素：

本文提供用于治疗tmj退化的缓释组成物，包含：1)硬骨素和高分子量透明质酸、或2)包封在plga中的硬骨素、或3)与高分子量透明质酸共价连接的硬骨素。本文也提供通过施用其中一种具有治疗有效量的缓释组成物来治疗需要这种治疗的患者的所述tmj退化的方法。

所述组成物包含具有治疗有效浓度的硬骨素，其范围可以是5ng/100μl至约1mg/100μl的硬骨素和约0.1至10wt％的高分子量透明质酸或plga、优选约为50ng/100μl至5μg/100μl的硬骨素和约0.5至5wt％的高分子量透明质酸或plga，以及更优选约为1μg/100μl的硬骨素和约2wt％的高分子量透明质酸或plga。由标的组成物之一输送的硬骨素，其治疗有效量优选为10ng至10μg，但也可施用如治疗技术领域的技术人员所理解的其他量。

本发明优选的缓释组成物实质上由以下组成：1)硬骨素和高分子量透明质酸、或2)包封在plga中的硬骨素、或3)与透明质酸共价连接的硬骨素。

所述组成物可按本领域所理解的方式施用，通常是通过注射到tmj中。例如，请参见manfredini等人于2010年七月的cranio：颅颌关节实践期刊发表的28(3):166-76https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20806734，其整体并入本文。前文的一般描述和下文的详细描述为示例及说明作用，其旨在为本发明作进一步的解释。

附图说明

图1是硬骨素-透明质酸水凝胶中硬骨素的释放曲线。

图2是plga包封的硬骨素制剂中硬骨素的释放曲线。

图3示出透明质酸-硬骨素水凝胶对大鼠fcscs活性的体外评估。

图4是ha-硬骨素与组成物中的各个组分的活性比较。

图5示出ha-硬骨素水凝胶在兔损伤模型中的活性。

图6示出一种共轭硬骨素-ha组成物的合成路径。

图7示出从硬骨素-透明质酸水凝胶中释放的硬骨素的凝胶染色。

图8是共轭硬骨素-ha组成物中硬骨素的释放曲线。

具体实施方式

根据本发明，提供一种用于治疗tmj退化，特别是tmj骨关节炎的组成物，所述组成物包含具有高分子量透明质酸和硬骨素的水凝胶。所述组成物优选地实质上由高分子量透明质酸和硬骨素组成。本文还提供一种治疗需要这种治疗的患者的tmj退化(特别是tmj骨关节炎)的方法，所述方法包含将具有治疗有效量的硬骨素-透明质酸水凝胶注射到颞颌关节中。所述组成物可包含(或实质上由以下组成)约5ng/100μl至1mg/100μl的硬骨素和约0.1至10wt％的高分子量透明质酸、优选地约为50ng/100μl至5μg/100μl的硬骨素和约为0.5至5wt％的高分子量透明质酸，以及更优选地约为1μg/100μl的硬骨素和约为2wt％的高分子量透明质酸。实质上由硬骨素和高分子量透明质酸所组成的所述组成物中，其余部分为一或多种溶剂、载体等。

在本发明的另一实施例中，提供一种用于治疗tmj退化，特别是tmj骨关节炎的组成物，其包含plga包封的硬骨素制剂。本实施例的组成物优选地实质上由plga包封的硬骨素组成。本实施例也提供一种治疗需要这种治疗的患者的tmj退化(且特别是tmj骨关节炎)的方法，其包含将具有治疗有效量的plga包封的硬骨素注射到颞颌关节中。所述组成物可包含(或实质上由以下组成)：5ng/100μl至约1mg/100μl的硬骨素和约0.1至10wt％的plga、优选地约为50ng/100μl至5μg/100μl的硬骨素和约0.5至5wt％的plga，以及更优选地约为1μg/100μl的硬骨素和约为2wt％的plga。实质上由硬骨素和plga所组成的所述组成物中，其余部分是一或多种溶剂、载体等。

请求保护的组成物中使用的plga优选是具有平均分子量约为30,000至60,000da的50:50共聚物，但如本技术领域所理解的，也可以使用具有其他单体比例以及其他分子量范围的共聚物，包括85:15、65:35和75:25的乳酸/乙醇酸，以及约为7000至240,000da的平均分子量。

在本发明的另一实施例中，提供一种用于治疗tmj退化，特别是tmj骨关节炎的组成物，所述组成物包含与高分子量透明质酸共价连接的硬骨素。本实施例的组成物优选地实质上由与高分子量透明质酸共价连接的硬骨素所组成。还提供了一种治疗需要这种治疗的患者的tmj退化(且特别是tmj骨关节炎)的方法，所述方法包含将具有治疗有效量的硬骨素-透明质酸注射到颞颌关节中。所述组成物可包含(或实质上由以下组成)：5ng/100μl至约1mg/100μl的硬骨素和约0.1至10wt％的高分子量透明质酸、优选地约为50ng/100μl至5μg/100μl的硬骨素和约为0.5至5wt％的高分子量透明质酸，以及更优选地约为1μg/100μl的硬骨素和约为2wt％的高分子量透明质酸。实质上由硬骨素和高分子量透明质酸所组成的所述组成物中，其余部分为一或多种溶剂、载体等。

在包含(或实质上由以下组成)与透明质酸共价连接的硬骨素(所组成的)的组成物实施例中，可以通过使用如在化学技术领域中是众所周知的合适的连接剂通过硬骨素的胺基和高分子量透明质酸的羧基来将硬骨素与透明质酸连接，以完成所述连接。所述连接可以通过以下进行，例如将具有游离醛基的含胺连接剂与透明质酸反应，以与透明质酸的羧酸基团形成酰胺键，然后将缩醛基水解成游离的羧酸基团，再通过氰基硼氢盐将硬骨素与游离的羧基连接。优选的连接剂是4-氨基丁醛-二乙缩醛(4-abada)，但可以使用如本领域已知的其他合适的连接剂。请参见例如du等人的biomacromolecules2014,15,1097-1114。合适的连接剂可从科学供应公司(例)如西格玛奥瑞奇公司轻易取得。

应当理解，请求保护的组成物和方法并不限于所描述的特定实施例，并且可以据此变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而无意于进行限定。本技术的范围将仅由所附权利要求书限制。

如本文所使用的某些术语可以具有以下定义的含义。如说明书和权利要求书中所使用的，单数形式的“一个”、“一种”和“所述”包括单数和复数的引用，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一个细胞”包括单个细胞和多个细胞，包括其混合物。

如本文所使用的术语“包含”旨在表示所述组成物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。“实质上由...组成”用于界定组成物和方法时，应指排除对组成物或方法具有任何重要意义的其他要素。“由...组成”是指对于请求保护的组成物和实质方法的步骤，排除其他成分中的微量元素。由这些过渡术语中的每一个定义的实施例都在本发明的范围内。因此，旨在方法和组成物可包括额外的步骤和组分(包含)，或者选择性地包括无显著性的步骤和组成(实质上由...组成)，或者可只旨在说明所述方法步骤或组成(由...组成)。

如本文所使用的“约”是指正负10。

如本文所使用的“可选择的”或“任选地”，是指随后描述的事件或情况可能发生或没发生，并且所述描述包含所述事件或情况发生或没发生的例子。

如本文使用的术语“个体”、“患者”或“受试者”可以是个体生物、脊椎动物、哺乳动物(例如牛、犬、猫或马)或人类。在一个优选的实施例中，所述个体、患者或受试者为人类。

如本文所使用的短语“治疗有效量”和“治疗水平”是指治疗材料在受试者或患者中的剂量或血浆浓度，所述剂量或血浆浓度为需要治疗的受试者或患者所施用的治疗材料提供了特定的药理作用，即减少、改善或消除tmj退化。要强调的是，即使本领域技术人员认为这种剂量是治疗有效量，药物的治疗有效量或治疗水平也不会一直有效地治疗tmj退化。治疗有效量可根据受试者的年龄和体重，和/或受试者的病况而有所不同。由标的组成物之一输送的硬骨素，其治疗有效量优选为10ng至10μg，但也可施用如治疗技术领域的技术人员所理解的其他量。

如本文针对tmj退化或tmj骨关节炎所使用的术语“疗法”或“治疗”是指减轻、改善或消除疾病或病症的一或多种症状或影响。请参见例如kalladka等人的j.indianprosthodont.soc(2014年1月至3月)14(1):6-15，将其整体内容并入本文。

“治疗反应”是指至少一种tmj退化的测量指标的改善。

如本文所使用的，术语“高分子量透明质酸”或“hmwha”是指平均分子量约大于800kda，优选地约为800kda至8000kda、更优选地约为1000kda至6000kda、再更优选地约为1500kda至4000kda，最优选地约为2000kda的透明质酸，而术语“低分子量透明质酸”或“lmwha”是指平均分子量小于约800kda、优选地约为100kda至800kda、最优选地约为500kda的透明质酸。

下列缩写可在本文中使用：牛血清白蛋白(bsa)、磷酸盐缓冲盐水(pbs)、硬骨素(sost)、聚乳酸-乙醇酸(plga)、聚乙烯醇(pva)、透明质酸(ha)、颞颌关节(tmj)、高分子量透明质酸(hmha)、骨关节炎(oa)、纤维软骨干细胞(fcsc)、分钟(min)和秒(sec)、酶联免疫吸附测定(elisa)、4-氨基丁醛二乙缩醛(4-abada)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、辣根过氧化物酶(hrp)、3,3',5,5'-四甲基苯扎丁(tmb)、杜贝可氏改良的依格氏培养基(dmem)、胎牛血清(fbs)、乙二胺四乙酸(edta)、核糖核酸(rna)、脱氧核糖核酸(dna)、互补dna(cdna)。

可以使用如本领域所理解的已知载体将组成物配制成用注射施用的制剂。

用于各种剂型的药理学上可接受的载体是本领域已知的。例如，用于固体制剂的赋形剂、润滑剂、黏合剂和崩解剂是已知的；用于液体制剂的溶剂、增溶剂、助悬剂、等渗剂、缓冲剂和舒缓剂是已知的。在一些实施例中，药学组成物包括一或多种附加组分，诸如一或多种防腐剂、抗氧化剂、稳定剂等。请参见：《雷明顿–药学科学与实践》，第21版，lippincott(2006)，将其整体内容并入本文。

本发明的一方面，在本文中公开了一种治疗需要这种治疗的患者的tmj退化(包括tmj骨关节炎)的方法，所述方法包含对所述患者施用具有治疗有效量的本发明组成物。

举出下列实施例来说明本发明。应当理解，本发明不限于示例中所描述的特定条件或细节。本文所引用的所有印刷出版物通过引用的方式具体并入。

实验内容

1)高分子量透明质酸-硬骨素水凝胶的合成

合成过程中使用了以下材料：高分子量透明质酸钠(ha)(平均分子量2000kda)(lifebiomedical公司，目录号：ha2m)、3％bsapbs、硬骨素(sost)(r&dsystems公司，目录号：1406-st-025/cf)、1ml注射器(bdtuberculinsyringes产品，14-826-87)、5mlfalcon圆底丙烯管(fisherscientific公司，目录号：14-959-11a)，以及即时密封灭菌袋(fisherbrand公司，#01-812-54)。

3％bsapbs的制备：将1.5g的bsa溶于50ml的无菌pbs中，并在tc罩中使用0.45um孔径的注射器过滤器进行无菌过滤，以得到配于pbs溶液中的3％bsa。

2％硬骨素hmwha水凝胶和对照组的制备：通过将25ug的sost添加到上面所制备的125ul的3％bsa/pbs中来重组sost，以生成200ug/ml的sost溶液。通过漩涡振荡将0.06g的hmwha溶解在上面所制备的3ml的sost溶液中，然后在4℃静置直至完全溶解。针对hmwha对照组，通过漩涡振荡将0.06g的hmwha溶解在3ml的3％bsapbs中，并在4℃静置至完全溶解。针对sost对照组，将上述步骤1中所制备的22.5ul的200ug/ml重组sost溶解在3ml的3％bsapbs中。低分子量ha组成物是由类似的方法制备而成的。

下方评估了由上面的制备而成的下列测试组：

载液：0.1ml的3％bsapbs

sost：0.1ml的1.5ug/mlsost。

22.5ulx(200ug/mlsost重组体)/3ml的3％bsapbs

hmwha：0.1ml的2％ha。

(配于3ml的3％bsapbs中的0.06g的hmwha)

hmwha-sost：配于hmwha中的0.1ml的2ug/mlsost。

(配于3ml的2ug/mlsost中的0.06g的hmwha)

2)plga微球的合成(用sost进行包封)：将250mg的50∶50plga(sigma)溶解在1ml的二氯甲烷中。通过将2ml的异丙醇溶于98ml的蒸馏水中以制备100ml的2％异丙醇。将上面制备的1ml的plga溶液与10ug的硬骨素在50ul的pbs中混合，并以高速漩涡振荡1分钟。将2ml的1％pva水溶液混合到上面制备的plga/pbs溶液中，漩涡振荡1分钟，然后在排气罩中以450rpm的转速将所得混合物添加到100ml的0.1％pva中。将100ml的2％异丙醇加入所得组成物中并整体搅拌2小时，然后将整体进行过滤以收集微球，用蒸馏水洗涤三次，收集在50ml试管中并保存在液态氮中30分钟，以生成包封在plga微球中的sost。最后，将微球冻干并保存在-20℃。

3)共轭hmwha-sost的制备(如图6所示)：将50mg的高分子量透明质酸钠盐(ha)(lifebiomedical，目录号：ha2m)溶解在20ml的4℃蒸馏水中，并储存在4℃中12小时。将上述的ha溶液转移到小烧杯中，在搅拌中加入7.2mg的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)、4.4mg的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)和6.56mg的4-氨基丁醛二乙缩醛(4-abada)，再继续搅拌18小时。将所得溶液转移至15mleppendof离心管中，并加入10ml的无水乙醇。在3000rpm的速度离心10分钟后，倾析出上清液，并用75-25乙醇/水溶液洗涤凝胶状固体，再次离心并小心地倾析出剩余的上清液。使用50-50乙醇/水溶液将剩余的固体洗涤、进行第三次离心，并倾析出上清液。将所得材料进行冻干。将1mg醛化的冻干ha溶解在1ml的0.01m磷酸中，并用0.01m的磷酸将所得溶液稀释50倍，以产生水解ha。在搅拌中将5μg的硬骨素和1mg的nabh3cn加入5ml的水解ha中，用2mnaoh溶液将所得组成物的ph调至6.0，并继续搅拌24小时，然后将所得材料冻干。

评估

硬骨素-透明质酸水凝胶与硬骨素释放曲线。在上述程序之后，将硬骨素(1μg，r&d1406-st/cf)于2％高分子量透明质酸(hmwha，2000kda，lifecorebiomedical公司)或2％和3％低分子量透明质酸(lmwha，500kda，lifecorebiomedical公司)中进行混合。将水凝胶置于具有0.4μm的孔径聚酯膜插件(fisherscientific公司，07-200-161)的12mm上方，并在37℃下的pbs中以12孔培养盘进行培育。依照制造商的指示，在每个指定的时间点使用定量夹心酶免疫分析技术来测量硬骨素的浓度，以绘制累积释放曲线。简而言之，将标准品或样品(100μl)添加到每个槽孔中，并在37℃下进行2h的培育，然后在37℃下使用生物素化抗人体硬骨素的一次抗体进行1h的处理。针对抗体检测，在37℃下将100μl的hrp-亲和素放置1h。洗涤后，在37℃下将tmb受质添加到每个槽孔中15至30分钟，然后添加50μl的终止液。使用微盘分析仪在450nm下测定每个槽孔的光密度(od)。通过每个样品的od值与标准曲线的比较来计算硬骨素的浓度。

如图1所示，高分子量透明质酸-硬骨素水凝胶在42天的试验期内展现了硬骨素的缓释，而低分子量透明质酸的组成物仅在几天内就迅地速释放了实质上为全部的硬骨素。如图7所示，从高分子量透明质酸-硬骨素水凝胶中释放的硬骨素在37℃下培育三周后没有出现降解。这种硬骨素的缓释和在37℃下长时间的稳定性是意料之外以及惊人的。根据供应商的建议，硬骨素通常在低温下储存，以避免可能的分解。产品数据表指明了重组材料在2到8℃下1个月的稳定性。

plga包封的硬骨素释放曲线。将上面制备的plg硬骨素微球放置在37℃下pbs中的transwell上，并根据制造商的指示，使用硬骨素人体elisa试剂盒(赛默飞世尔公司)测量在时段内硬骨素的浓度。计算出的释放曲线如图2所示，plga硬骨素微球在29天的时段内进行硬骨素的缓释。

共轭硬骨素-ha释放曲线。将10μg的共价连接ha-sost溶解在0.5ml的pbs中。在图8所示的每个指示时间点，取出0.25ml的溶液并用等量的pbs替换。将每个已替换的样品的10μl以elisa试剂盒(赛默飞世尔公司)的200μl的稀释缓冲液中进行稀释，并用硬骨素人体elisa试剂盒(赛默飞世尔公司)来测定硬骨素的含量。结果如图8所示，硬骨素连接剂透明质酸中的硬骨素在30天的时段内缓释。

纤维软骨干细胞(fcsc)的分离和培养。从8周大的spraguedawley大鼠身上解剖tmj纤维软骨，用分散酶ii/胶原蛋白酶i(4mg/ml，3mg/ml)将其进行消化并在37℃下摇动。每20分钟收集一次细胞，直到所有纤维软骨组织都被消化为止。将纤维软骨干细胞的单细胞悬浮液在基础培养基中培养4到6天(5％co2，37℃)，所述基础培养基由添加有20％批选胎牛血清(fbs，gibcoes细胞fbs，10439-024)、谷维素(invitrogen35050-061)、青霉素-链霉素(invitrogen15140-163)，以及100mm的2-巯基乙醇(gibco)的dmem(invitrogen11885-092)所组成。用胰蛋白酶-edta(gibco)脱附细胞，并在p1处进行平盘培养。在含有2％fbs的培养基中的fcscs使用含有混合于含有2％高分子量透明质酸(hmwha)中的硬骨素、或单独的2％hmw-ha、或硬骨素(50ng/ml)，或pbs的transwell中处理2、7和10天。

如图3所示，通过tnf-α和il-1β的水平测量，高分子量透明质酸-硬骨素水凝胶能诱导大鼠fcscs分化，但不会引起炎症。如图4所示，与单独使用硬骨素相比，高分子量透明质酸-硬骨素水凝胶诱导fcscs分化为软骨并减少炎症。

rna分离与qrt-pcr。从纤维软骨干细胞(invitrogen12183018a)中纯化总rna，并以dnasei(ambionam2222)将所述总rna进行基因组dna的去除。使用nanodrop来测定rna的数量和纯度。使用rna样品(260/280>1.8)来取得cdna(bioradam2222)。通过使用大鼠引物的sybrgreenpcrmastermix(appliedbiosystems4309155)来进行acan、runx2、axin2、wnt3a、tnf-α、ilβ的定量rt-pcr。将基因表达水平标准化为管家基因gapdh。结果显示于图3及图4中。

兔颞颌关节(tmj)损伤模型。对13只3至4个月大的新西兰白兔通过双侧手术来诱发颞颌关节损伤。在颧骨上方建立一个斜切口。将组织抬高并回缩以进入tmj上关节空间，并将椎间盘向后方回缩。在椎间盘下放置一个骨膜升降器，以免髁受到伤害。使用打孔活检以在tmj椎间盘的外侧部分形成2.5mm的穿孔。释放椎间盘后退时，没有椎间盘附着物被切断，且椎间盘复位至其正常解剖位置。每隔一周(n＝3)或每月(n＝4)将兔子在对侧进行一次单侧ha-硬骨素水凝胶及ha注射治疗，或者每隔一周(n＝3)或每月(n＝3)将兔子在对侧进行一次单侧硬骨素和pbs注射治疗。8周后，牺牲所有的兔子。

如图5所示，由兔损伤模型中高分子量透明质酸-硬骨素水凝胶治愈了tmj盘穿孔，可以预测其在人体的影响。请参见：embree等人的“兔子先导研究中，tmj盘穿孔后的软组织骨化和髁状软骨退化试验研究”2015年4月；3(4):629-639,doi:10.1016j.joca.2014.12.015，将其整体并入本文。

尽管本发明的组成物和方法已经在本公开中通过说明性实施例进行了描述，但是应当理解本发明不限于此，在不背离所附权利要求书所定义的发明教示的情况下，可以做出本领域技术人员已知的变化。