新化合物的制作方法
发明领域
本发明涉及化合物、含有所述化合物的组合物、组合和药物以及它们的制备方法。本发明还涉及所述化合物、组合、组合物和药物的用途，例如用于治疗与α1抗胰蛋白酶相关的疾病和病症中的用途。
发明背景
许多人遗传疾病是由损害蛋白质折叠和运输的突变引起的。所述蛋白质可以以正常的量生产，但是由于它们受损的折叠可能导致问题。
α-1-抗胰蛋白酶或α1抗胰蛋白酶(a1at)是属于丝酶抑制蛋白超家族的蛋白酶抑制剂。它是在肝细胞和较小程度上在其它细胞中产生并分泌到血液中的蛋白质，在血液中它起到限制关键蛋白酶，尤其是嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的酶活性的作用。在其不存在时(例如在α-1-抗胰蛋白酶缺陷时)，包括嗜中性粒细胞弹性蛋白酶在内的关键蛋白酶的活性未被抑制，导致弹性蛋白和结缔组织的过度分解。在病理学上表现为这种现象的最常见组织是在肺中，其中肺结缔组织降解的增加通常导致呼吸并发症，例如肺气肿或慢性阻塞性肺病(copd)。更罕见的是，其它组织也可受a1at缺陷/功能障碍影响，例如皮肤。
在许多患者中，α-1-抗胰蛋白酶缺陷是由突变引起的，所述突变包括例如e342k(glu342lys)错义突变，本文称为z突变体(z-at)。突变体zα-1-抗胰蛋白酶形成聚合物，其在细胞中积累并可扰乱受影响组织的功能。在α-1抗胰蛋白酶缺陷中最常受聚合物积聚影响的器官是肝脏，其引起肝脏损伤，并且在严重的情况下发展到需要肝脏移植。a1at的聚合物也存在于其它组织中，包括血液、肺和皮肤。聚合物已显示为促炎的，并且可能有助于发现它们的组织中的病理学，特别是肺和皮肤。
目前对α-1-抗胰蛋白酶缺陷相关病症的治疗限于使用来源于人血浆的m-at(野生型α1抗胰蛋白酶蛋白)的蛋白替代疗法，通常每周给药一次。虽然这种疗法对包括肺气肿在内的肺病有效，但它对肝细胞er中聚合z-at的累积所引起的肝病没有作用。对于10-15％的z-at累及的肝病(包括纤维化、肝硬化和肝细胞癌)纯合子，肝移植是唯一可用的治疗选择。此外，聚合z-at在肺上皮中的积累对嗜中性粒细胞具有化学引诱物作用，这可能导致结缔肺组织的进一步破坏。因此，需要治疗与α-1-抗胰蛋白酶缺陷以及α-1-抗胰蛋白酶毒性积累相关的疾病状况的治疗剂和方法。
本发明人已经鉴定了能够调节α1抗胰蛋白酶、特别是突变z-at形式的化合物，防止其在肝脏中聚合，从而潜在地可用于治疗与α1抗胰蛋白酶、更特别是与α1抗胰蛋白酶的突变形式、特别是z-at相关的疾病，包括肝脏疾病。
本发明人特别鉴定了能够以防止蛋白质聚合的方式结合α1-抗胰蛋白酶并由此产生有益治疗效果的化合物。虽然之前已经结晶了α1-抗胰蛋白酶蛋白并研究了它们的三维结构，但发明人鉴定的化合物的结合位点先前尚未鉴定。如本文更详细讨论的，它是通过蛋白质和本发明化合物之间的相互作用形成的隐蔽结合位点，其特定位置和结构导致对蛋白质聚合的有益抑制。此外，本发明人已经鉴定了有助于产生相关隐蔽结合位点和其中化合物结合的特定结构基序。因此，本发明解决了长期以来对提供能够治疗由α1-抗胰蛋白酶聚合介导的疾病或病症的化合物的需求。
发明概述
在第一个方面，本发明提供了一种物质，其用于治疗由α1-抗胰蛋白酶聚合介导的疾病或病症的方法中，其中所述物质是：(a)能够抑制α1-抗胰蛋白酶聚合的化合物；或(b)其药学上可接受的溶剂化物、复合物、互变异构体、同位素标记的衍生物或前药。优选地，所述疾病或病症由z-α1-抗胰蛋白酶聚合介导，并且所述化合物能够抑制z-α1-抗胰蛋白酶聚合。该物质通常是小分子化合物，例如。
一种分子量为1000道尔顿或更小的化合物。
优选地，所述化合物能够通过诱导在α1-抗胰蛋白酶蛋白结构内形成隐蔽结合位点而结合α1-抗胰蛋白酶，所述α1-抗胰蛋白酶包含seqidno:1的序列。例如，该结合位点可以位于所述α1-抗胰蛋白酶的β-折叠-a和β-折叠-b之间，其中：所述β-折叠-a包含对应于seqidno:1的残基140-144、111-121、181-191、330-340和292-299的氨基酸；所述β折叠-b包含对应于seqidno:1的残基228-231、236-244、248-256、369-376、381-389和49-53的氨基酸。更优选地，所述结合位点位于对应于下列各项的氨基酸链之间：(a)seqidno:1的残基191-194；(b)seqidno:1的残基288-293；(c)seqidno:1的残基371-374；(d)seqidno:1的残基249-253；和(e)seqidno:1的残基240-243；以及任选地(f)seqidno:1的残基338-341。所述结合位点可包含seqidno:1的w194、y244、l291、p289、f252、k290、i293、l338、i340、f372和m374中的一个或多个。
优选地，所述化合物对m-α1-抗胰蛋白酶的kd小于约250nm，所述m-α1-抗胰蛋白酶包含seqidno:2的序列。优选地，所述化合物对z-α1-抗胰蛋白酶的kd小于约25nm，所述z-α1-抗胰蛋白酶包含seqidno:3的序列。优选地，所述化合物对z-α1-抗胰蛋白酶的kd至少比所述化合物对m-α1-抗胰蛋白酶的kd低十倍，所述m-α1-抗胰蛋白酶包含seqidno:2的序列，所述z-α1-抗胰蛋白酶包含seqidno:3的序列。
所述化合物可以包含式(ia)的四价结构部分
其中所述化合物能够通过在以下之间形成氢键而结合包含seqidno:1的序列的α1-抗胰蛋白酶：(i)羟基i和seqidno:1的l291羟基i和seqidno:1的l291；(ii)nh基ii和seqidno:1的p289；和(iii)羰基iii和seqidno:1的y244，例如，所述化合物可以包含式(ib)的二价结构部分
其中：所述化合物能够通过在以下之间形成氢键而结合包含seqidno:1的序列的α1-抗胰蛋白酶：(i)羟基i和seqidno:1的l291羟基i和seqidno:1的l291；(ii)nh基ii和seqidno:1的p289；和(iii)羰基iii和seqidno:1的y244；r4选自氢、c1-5烷基、c2-5链烯基、c2-5炔基和c1-4烷氧基；且r5选自氢、c1-5烷基、c2-5链烯基、c2-5炔基和c1-4烷氧基。任选地r5是氢。任选地r4是c2-4烷基、c2-4链烯基、c2-4炔基或c1-3烷氧基。任选地r4是正丙基。
更具体地，所述化合物可包含式(ic)的单价结构部分
其中：所述化合物能够通过在以下之间形成氢键而结合包含seqidno:1的序列的α1-抗胰蛋白酶：(i)羟基i和seqidno:1的l291；(ii)nh基ii和seqidno:1的p289；和(iii)羰基iii和seqidno:1的y244；r4和r5如上文所定义；且r6是取代或未取代的芳基或杂芳基，能够与seqidno:1的w194的侧链堆叠(stacking)。任选地，r6是取代或未取代的4-氧化吲哚基。例如，任选地r6是式r6′的基团
其中r1选自h、f、ch3、ch2ch3、ch2ch2ch3、ch(ch3)2、nh2、nhch3、n(ch3)2、oh、cl、br和i。任选地r1选自h、f、ch3、nh2、oh和cl。例如任选地r1选自h和f。
更具体地，所述化合物可以具有式(id)的结构
其中：所述化合物能够通过在以下之间形成氢键而结合包含seqidno:1的序列的α1-抗胰蛋白酶：(i)羟基i和seqidno:1的l291；(ii)nh基ii和seqidno:1的p289；和(iii)羰基iii和seqidno:1的y244；r4和r5如上文所定义；r6如上文所定义；且r7是取代或未取代的芳基或杂芳基。
任选地r7是取代或未取代的苯基。例如，
任选地r7是式r7′的基团
其中：r2选自ch3、cl、ch2ch3、ch2ch2ch3、ch(ch3)2、nh2、nhch3、n(ch3)2、oh、sh、cn、f、br和i；且r3选自f、cl、cn、ch3、ch2ch3、ch2ch2ch3、ch(ch3)2、nh2、nhch3、n(ch3)2、oh、br、i和sh。任选地，r2选自ch3、cl、nh2、oh、sh、cn和f；且r3选自f、cl、cn、ch3、nh2、oh和sh。例如，任选地r2选自ch3和cl；且r3选自f、cl和cn。
例如，所述化合物可以具有式(i)的结构
其中：r1选自h、f、ch3、ch2ch3、ch2ch2ch3、ch(ch3)2、nh2、nhch3、n(ch3)2、oh、cl、br和i；r2选自ch3、cl、ch2ch3、ch2ch2ch3、ch(ch3)2、nh2、nhch3、n(ch3)2、oh、sh、cn、f、br和i；且r3选自f、cl、cn、ch3、ch2ch3、ch2ch2ch3、ch(ch3)2、nh2、nhch3、n(ch3)2、oh、br、i和sh。
任选地在式(i)中:r1选自h、f、ch3、nh2、oh和cl；r2选自ch3、cl、nh2、oh、sh、cn和f；且r3选自f、cl、cn、ch3、nh2、oh和sh。例如，任选地:r1选自h和f；r2选自ch3和cl；且r3选自f、cl和cn。例如，任选地:r1是h，r2是ch3，且r3是f；或r1是h，r2是ch3，且r3是cl；或r1是f，r2是cl，且r3是cn；或r1是f，r2是cl，且r3是f。
本发明还提供了如上定义的物质。更进一步，本发明提供了一种鉴定候选药物化合物的方法，所述方法包括：使所述候选药物化合物与包含seqidno:1的序列的α1-抗胰蛋白酶接触，以在所述候选药物化合物与所述α1-抗胰蛋白酶之间形成复合物；解析复合物的结构；和确定在复合物中，候选药物化合物是否存在于如上定义的结合位点。
在更进一步的方面，本发明提供了下面的实施方案[1]至[11]。
[1]化合物:(a)其具有式(i)的结构:
其中：r1是h，r2是ch3，且r3是f；或r1是h，r2是ch3，且r3是cl；或r1是f，r2是cl，且r3是cn；或r1是f，r2是cl，且r3是f；或
(b)是其药学上可接受的溶剂合物、复合物、互变异构体、同位素标记的衍生物或前药。
[2]用于治疗法的如[1]中所定义的化合物。
[3]如[1]中所定义的化合物，其用于治疗由α1抗胰蛋白酶介导的疾病或病症。
[4]药物组合物，其包含如[1]中所定义的化合物和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂。
[5]治疗个体中由α1抗胰蛋白酶介导的疾病或病症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如[1]中所定义的化合物。
[6]如[1]中所定义的化合物在制备用于治疗由α1抗胰蛋白酶介导的疾病或病症的药物中的用途。
[7]组合，其包含如[1]中所定义的化合物和至少一种另外的治疗剂。
[8]组合，其包含如[1]中所定义的化合物和至少一种另外的治疗剂，所述组合用于治疗，特别是用于治疗由α1抗胰蛋白酶介导的疾病或病症。
[9]组合，其包含如[1]中所定义的化合物和至少一种另外的治疗剂，所述组合用于治疗由α1抗胰蛋白酶介导的疾病或病症。
[10]治疗由α1抗胰蛋白酶介导的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的人施用治疗有效量的组合，所述组合包含[1]中定义的化合物和至少一种另外的治疗剂。
[11]包含如[1]中所定义的化合物和至少一种其它治疗剂的组合在制备用于治疗由α1抗胰蛋白酶介导的疾病或病症的药物中的用途。
附图简述
图1是本发明的代表性化合物与α1-抗胰蛋白酶蛋白之间形成的结晶复合物的代表性图像，如实施例2中更详细描述。
图2是本发明的代表性化合物与α1-抗胰蛋白酶蛋白之间形成的结晶复合物的一部分的代表性图像，如实施例2中更详细描述的(具体地，该部分含有该蛋白质与本发明的化合物之间的结合位点)。
图3是本发明的代表性化合物在蛋白质的结合位点的二维可视化示意图，突出了一些包含结合位点的氨基酸残基，以及与化合物形成显著分子间相互作用(例如氢键)的蛋白质内的部分化学结构(以虚线显示)，如实施例2中更详细描述。
发明详述
定义
如本文所用，烷基是直链或支链饱和烃基。在一个实例中，烷基含有1至5个碳原子。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基和新戊基。
如本文所用，链烯基是含有一个或多个(例如一个)碳碳双键的直链或支链烃基。在一个实例中，烯基包含2至5个碳原子。
如本文所用，炔基是含有一个或多个(例如一个)碳碳三键的直链或支链烃基。在一个实例中，炔基含有2至5个碳原子。
如本文所用，烷氧基(例如，c1-4烷氧基)是式-or的基团，其中r是烷基(例如c1-4烷基)。
如本文所用，烷基硫羟(例如，c1-4烷基硫羟)是式-sr的基团，其中r是烷基(例如，c1-4烷基)。
如本文所用，芳基通常为c6-14单碳环、芳环或多碳环环系，其中至少一个环为芳环。优选地，这种基团是c6-10单碳环、芳环或双碳环环系，其中至少一个环是芳环。实例包括苯基、萘基和茚满基。除非另有明确说明，化合价可以位于芳基的任何环的任何原子上。
如本文所用，杂芳基通常为含有5至14个环原子的单环、芳环或多环环系，其中至少一个环是芳环。杂芳基含有至少一个(例如1、2、3或4个)选自o、s、n的环杂原子(例如形成至少一个环o、s(o)x(其中x为0、1或2)、n、nh或n+o-部分)，其它环原子为碳原子。优选地，这样的基团含有5至10个环原子。除非另有明确说明，化合价可以位于杂芳基的任何环的任何原子上。
单环杂芳基的实例包括噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、三唑基、噻二唑基、噁二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基和四唑基。
多环杂芳基的实例包括氧化吲哚基(oxindolyl)、苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并三唑基、吲哚基、异吲哚基和吲唑基。氧化吲哚基包括2-氧化吲哚基(即衍生自2-吲哚酮的单价基团，也称为2-二氢吲哚酮)和3-氧化吲哚基(即衍生自3-吲哚酮的单价基团，也称为3-二氢吲哚酮)。
在芳基或杂芳基中，至少一个(例如1、2或3个)碳环原子可以被羰基取代(即-c(o)-)。例如，苯并噁唑基可以任选在其2-位上包含替代碳的-c(o)-，从而产生衍生自苯并噁唑酮的单价杂芳基。
除非另有说明，否则芳基或杂芳基通常是未取代的。然而，当这类基团被指明为未取代或被取代时，一个或多个氢原子可任选被氘原子、卤素原子或羟基、硫羟(-sh)、硝基、磺酸、腈(-cn)、氨基(例如-nr2，其中每个r独立选自h和c1-5烷基)、烷基(例如c1-5烷基)、氘代烷基(例如c1-5氘代烷基)、链烯基(例如c2-5链烯基)、炔基(例如c2-5炔基)、卤代烷基(例如c1-5卤代烷基)、卤代烯基(例如c2-5卤代烯基)、烷氧基(例如c1-4烷氧基)、烷硫基(例如c1-4烷硫基)、烷基磺酰基(例如c1-4烷基磺酰基)、卤代烷氧基(例如c1-4卤代烷氧基)、卤代烷硫基(例如c1-4卤代烷硫基)、卤代烷基磺酰基(例如c1-4环烷基)、环烷基(例如，c3-5环烷基)或杂环烷基(例如，c3-5杂环烷基)取代。
优选的这种取代基是氘原子、氟原子、氯原子或羟基、硝基、腈(-cn)、-nr2(其中每个r独立选自h和甲基)、c1-5烷基、-cd3、c2-3烯基、c2-3炔基、cf3、chf2、ch2cf3、c2f5、cf＝cf2、c1-3烷氧基、c1-3烷硫基、c1-3烷基磺酰基、ocf3、scf3、so2cf3、环丙基、环丁基、氧杂环丁基和氮杂环丁烷基。
优选地，取代的芳基或杂芳基具有1至5个取代基、更优选地1至3个取代基且最优选地1或2个取代基。优选地，取代的芳基或杂芳基带有不超过2个硝基取代基和不超过2个磺酸取代基。
如本文所用，卤素原子通常为f、cl、br或i原子，优选地为f或cl原子。
为了避免疑义，术语α1-抗胰蛋白酶、α-1-抗胰蛋白酶、α1抗胰蛋白酶等在本文中可互换使用。
除非另有说明，否则所有提及的包含一个或多个氢原子的有机基团也包括它们的部分或完全氘化的对应物。例如，本文提及的烷基包括由碳和氢原子组成的烷基、含有碳原子以及氢原子和氘原子的混合物的烷基、以及完全氘化的烷基。然而，优选地，除了明确指出的以外，此类有机基团不是部分或完全氘化的。
关于本发明化合物的通用信息、包含此类化合物的药物组合物和联合疗法
如本文所用，“本发明的化合物”包括能够抑制α1-抗胰蛋白酶聚合的化合物和这些化合物的所有溶剂化物、复合物、互变异构体、多晶型物、同位素标记的衍生物、立体异构体和光学异构体。
本文所用术语“有效量”是指将引起组织、系统、动物或人类的生物或医学响应的药物或活性剂的量，所述生物或医学响应是例如研究人员或临床医生所寻求的。此外，术语“治疗有效量”是指与未接受该量的相应个体相比，导致疾病、障碍或副作用的治疗、治愈、预防或改善，或者疾病或障碍的进展速率的降低的任何量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。
本文所用的术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适用于与人和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性或其它问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和剂型。
本发明的化合物可以是盐的形式。
通常，本发明的盐是药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”中所包括的盐是指本发明化合物的无毒盐。关于合适的盐的综述参见berge等,j.pharm.sci.1977,66,1-19。
本发明的化合物可以以固体或液体形式存在。在固体形式中，本发明的化合物可以以从完全无定形至完全结晶的连续固态存在。术语“无定形”是指其中材料在分子水平缺乏长程有序性并且根据温度可表现出固体或液体的物理性质的状态。通常，这种材料不能给出独特的x-射线衍射图，并且尽管表现出固体的性质，但形式上更描述为液体。在加热时，发生从固体到液体性质的变化，其特征在于状态的变化，通常是二阶(“玻璃化转变”)。术语“结晶”是指固相，其中材料在分子水平具有规则有序的内部结构，并且给出具有确定峰的独特的x射线衍射图。当充分加热时，所述材料也将表现出液体的性质，但是从固体到液体的变化的特征在于相变化，通常为一阶(“熔点”)。
本发明的化合物可以以溶剂化和非溶剂化形式存在。本文所用的术语“溶剂化物”是指由溶质(在本发明中，本发明的化合物和溶剂)形成的具有可变化学计量的复合物。用于本发明目的这些溶剂不会干扰溶质的生物活性。本领域技术人员将理解，对于结晶化合物可以形成药学上可接受的溶剂化物，其中溶剂分子在结晶过程中被结合到晶格中。所结合的溶剂分子可以是水分子或非水的，例如乙醇、异丙醇、dmso、乙酸、乙醇胺和乙酸乙酯分子。与水分子结合的晶格通常称为“水合物”。水合物包括化学计量水合物以及含有可变量的水的组合物。本发明包括所有这些溶剂化物。
本发明的化合物可以具有以多于一种的形式结晶的能力，这是一种被称为多晶型的特征，并且应当理解，这样的多晶型形式(“多晶型物”)在本发明的范围内。多晶型现象通常可以作为对温度或压力或两者变化的响应而发生，并且还可以由结晶过程的变化引起。多晶型物可以通过本领域已知的各种物理特性来区分，例如x-射线衍射图、溶解度和熔点。
还应注意，本发明的化合物可形成互变异构体。应当理解本发明化合物的所有互变异构体和互变异构体的混合物都包括在本发明化合物的范围内。
本发明还包括同位素标记的化合物，其与本发明的化合物相同，但一个或多个原子被具有与自然界中最常见的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子所取代。适于包含在本发明化合物中的同位素的实例包括氢的同位素，诸如2h和3h，碳的同位素，诸如11c、13c和14c，氯的同位素，诸如36cl，氟的同位素，诸如18f，碘的同位素，诸如123i和125i，氮的同位素，诸如13n和15n，氧的同位素，诸如15o、17o和18o，磷的同位素，诸如32p，和硫的同位素，诸如35s。
本发明的某些同位素标记的化合物，例如，那些掺入放射性同位素的化合物，可用于药物和/或底物组织分布研究。放射性同位素氚，即3h，和碳-14，即14c，由于它们易于掺入和易于检测，因此特别适用于该目的。
用较重同位素如氘即2h取代可提供某些治疗优点，这是由于更大的代谢稳定性，例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求，因此在一些情况下可能是优选的。
同位素标记的本发明化合物通常可通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与所附实施例和制备中描述的那些类似的方法，使用适当的同位素标记的试剂代替先前使用的非标记的试剂来制备。
在一个实施方案中，本发明的化合物是下列之一：
尽管对于治疗用途，本发明的化合物可以作为原料化学品施用，但是本发明的化合物可以作为药物组合物中的活性成分存在。这样的组合物可以以药学领域公知的方式制备，并且包含至少一种活性化合物。因此，本发明还提供包含本发明化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。赋形剂必须是如下可接受的，即与组合物的其它成分相容，并且对其接受者无害。根据本发明的另一方面，还提供了制备药物组合物的方法，所述药物组合物包括所述活性剂和一种或多种药学上可接受的赋形剂。所述药物组合物可用于治疗和/或预防本文所述的任何病症。
通常，本发明的化合物以药学上有效的量施用。实际施用的化合物的量通常由医师根据相关情况确定，包括待治疗的病症、选择的施用途径、实际施用的化合物、个体患者的年龄、体重和响应、患者症状的严重程度等。
药物组合物可以以单位剂量形式存在，每单位剂量含有预定量的活性成分。术语“单位剂型”是指适合作为用于人类个体和其它哺乳动物的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有经计算产生所需治疗效果的预定量的活性物质，以及合适的药物赋形剂、媒介物或载体。典型的单位剂型包括液体组合物的预填充、预先计量的安瓿或注射器，或者在固体组合物的情况下包括丸剂、片剂、胶囊等。
优选的单位剂量组合物是含有活性成分的日剂量或亚剂量或其适当部分的那些。因此，这样的单位剂量可以每天施用一次或多于一次。这样的药物组合物可以通过药学领域公知的任何方法制备。
药物组合物可以适合于通过任何合适的途径施用，例如通过口服(包括含服或舌下)、直肠、吸入、鼻内、局部(包括含服、舌下或经皮)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内或皮内)途径。这样的组合物可以通过药学领域已知的任何方法制备，例如通过将活性成分与载体或赋形剂结合。
适于口服施用的药物组合物可以作为离散单元存在，例如胶囊或片剂；粉剂或颗粒；在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；可食用泡沫或条状物(whips)；或水包油的液体乳剂或油包水的液体乳剂。
例如，对于以片剂或胶囊形式口服施用，活性药物组分可以与口服无毒的药学上可接受的惰性赋形剂如乙醇、甘油、水等组合。通过将化合物减小至合适的细小尺寸并与类似制备的药物赋形剂如可食用碳水化合物如淀粉或甘露醇混合来制备粉末。还可存在矫味剂、防腐剂、分散剂和着色剂。
胶囊通过如上所述制备粉末混合物并填充形成的明胶外壳来制备。在填充操作之前，可以将包括助流剂和润滑剂的赋形剂，例如胶态二氧化硅、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙或固体聚乙二醇加入到粉末混合物中。还可以加入崩解剂或增溶剂如琼脂、碳酸钙或碳酸钠以提高胶囊被摄取时药物的利用度。
此外，当需要或必要时，也可将包括合适的粘合剂、助流剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、崩解剂和着色剂的赋形剂掺入混合物中。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。用于这些剂型的润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、皂土、黄原胶等。片剂的配制例如通过制备粉末混合物、制粒或压缩块、加入润滑剂和崩解剂并压制成片剂。通过将适当粉碎的化合物与如上所述的稀释剂或碱，以及任选地与粘合剂如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、或聚乙烯吡咯烷酮，溶解阻滞剂(solutionretardant)如石蜡，再吸收促进剂(resorptionaccelerator)如季盐和/或吸收剂如皂土、高岭土或磷酸二钙混合，来制备粉末混合物。粉末混合物可以通过用粘合剂如糖浆、淀粉糊、阿卡迪亚胶浆(acadiamucilage)或纤维素或聚合材料的溶液润湿并过筛而造粒。作为造粒的替代方案，该粉末混合物可以运行穿过压片机，得到形状不均匀的团块，将其打碎成颗粒。该颗粒可以通过添加硬脂酸、硬脂酸盐、滑石粉或矿物油来润滑以防止粘到片剂成型模具上。随后将润滑的混合物压制成片剂。本发明化合物还可以与自由流动的惰性载体混合并直接压制成片剂而不经过造粒或压块步骤。可以提供由虫胶的密封包衣、糖或聚合材料的包衣以及蜡的上光包衣组成的透明或不透明的保护包衣。可以向这些包衣中添加染料以区分不同的单位剂量。
口服流体如溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂可以以单位剂型制备，以便所给量含有预定量的化合物。糖浆剂可以通过在适当调味的水溶液中溶解化合物来制备，而酏剂通过使用无毒酒精媒介物来制备。混悬剂通过在无毒媒介物中分散化合物来配制。还可以添加增溶剂和乳化剂(如乙氧基化异硬脂醇和聚氧乙烯山梨糖醇醚)、防腐剂、调味添加剂(如薄荷油)或天然甜味剂或糖精或其它人造甜味剂等等。
在适当的情况下，用于口服施用的剂量单位组合物可以微胶囊化。还可以例如通过在聚合物、蜡等等中包衣或包埋颗粒材料，来制备组合物以延长或维持释放。
本发明化合物还可以以脂质体递送体系的形式施用，如小单室脂质体、大单室脂质体和多室脂质体。脂质体可以由多种磷脂，如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱来形成。
适于透皮施用的药物组合物可以以离散的贴剂形式存在，所述贴剂意在与接受者的表皮保持紧密接触达延长的时段。
适于局部施用的药物组合物可以配制成软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗剂、粉剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。
为了治疗眼睛或其它外部组织，例如口腔和皮肤，组合物优选以局部软膏剂或乳膏剂形式施加。当配制成软膏剂时，活性成分可以与石蜡或水混溶性软膏基质一起使用。或者，活性成分可以与水包油乳膏基质或油包水基质一起配制成乳膏剂。
适于局部施用于眼睛的药物组合物包括滴眼剂，其中活性成分溶解或悬浮在合适的载体(尤其是水性溶剂)中。
适于在口腔中局部施用的药物组合物包括锭剂、糖果锭剂和和漱口水。
适于直肠施用的药物组合物可以栓剂或灌肠剂形式存在。
用于鼻或吸入施用的剂型可以方便地配制成气雾剂、溶液剂、混悬剂、滴剂、凝胶剂或干粉剂。供鼻内施用的组合物包括通过滴入或加压泵施用至鼻的水性组合物。合适的组合物含有水作为用于此目的的稀释剂或载体。用于施用至肺部或鼻的组合物可含有一种或多种赋形剂(例如一种或多种混悬剂、一种或多种防腐剂、一种或多种表面活性剂、一种或多种张力调节剂、一种或多种共溶剂)，并且可包括控制组合物ph的组分，例如缓冲系统。此外，所述组合物可含有其它赋形剂，例如抗氧化剂(例如焦亚硫酸钠)和味道掩蔽剂。也可通过雾化将组合物施用至鼻或呼吸道的其它区域。
鼻内组合物可使本发明的组合物(一种或多种)能递送到鼻腔的所有区域(靶组织)，此外，可允许本发明的组合物(一种或多种)与靶组织保持接触较长时间段。鼻内组合物的合适施用方案将让患者在清洁鼻腔后通过鼻子缓慢吸入。在吸入期间，将所述组合物施用至一个鼻孔，而另一个则用手按住。然后对另一鼻孔重复该过程。通常，按照以上过程，每天1、2或3次，理想的是每天1次，给每个鼻孔施用一次或两次喷雾。特别感兴趣的是适用于每天一次施用的鼻内组合物。
供肺部或鼻施用的组合物可含有一种或多种赋形剂，其可通过包括一种或多种防腐剂而防止微生物或真菌污染和生长。药学上可接受的抗微生物剂或防腐剂的实例包括、但不限于季铵化合物(例如苯扎氯铵、苄索氯铵、溴化十六烷基三甲铵、西吡氯铵、劳拉氯铵和肉豆蔻基甲基吡啶鎓氯化物)、汞剂(例如硝酸苯汞、醋酸苯汞和硫柳汞)、醇试剂(例如氯丁醇、苯乙醇和苯甲醇)、抗细菌的酯类(例如对羟基苯甲酸酯类)、螯合剂例如乙二胺四乙酸二钠盐(edta)和其它抗微生物剂例如氯己定、氯甲酚、山梨酸及其盐(例如山梨酸钾)和多粘菌素。药学上可接受的抗真菌剂或防腐剂的实例包括、但不限于苯甲酸钠、山梨酸、丙酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯。防腐剂(一种或多种)，如果包括的话，其用量可占组合物总重量的0.001-1％(w/w)，例如0.015％至0.5％(w/w)。
组合物(例如其中至少一种化合物是在混悬液中)可包含一种或多种表面活性剂，其作用是促进药物颗粒在组合物水相中溶解。例如，所用的表面活性剂的用量是在混合期间不会导致发泡的量。药学上可接受的表面活性剂的实例包括脂肪醇类、酯类和醚类，例如聚氧乙烯(20)、脱水山梨醇单油酸酯(聚山梨酯80)、聚乙二醇酯和泊洛沙姆。表面活性剂的用量可占组合物总重量的约0.01-10％(w/w)，例如0.01-0.75％(w/w)，例如约0.5％(w/w)。
可包含一种或多种张力调节剂以达到体液(例如鼻腔液体)的张力，从而减少刺激水平。药学上可接受的张力调节剂的实例包括、但不限于氯化钠、右旋糖、木糖醇、氯化钙、葡萄糖、甘油和山梨醇。张力调节剂，如果存在的话，其用量可占组合物总重量的0.1-10％(w/w)，例如4.5-5.5％(w/w)，例如约5.0％(w/w)。
可通过加入合适缓冲剂，使本发明组合物得到缓冲，所述缓冲剂例如柠檬酸钠、柠檬酸、氨基丁三醇、磷酸盐例如磷酸氢二钠(例如十二水合物、七水合物、二水合物和无水形式)或磷酸钠及其混合物。
缓冲剂，如果有的话，其用量可占组合物总重量的0.1-5％(w/w)，例如1-3％(w/w)。
味道掩蔽剂的实例包括三氯蔗糖、蔗糖、糖精或其盐、果糖、右旋糖、甘油、玉米糖浆、阿司帕坦、乙酰舒泛-k、木糖醇、山梨醇、赤藓醇、甘草酸铵、奇甜蛋白、纽甜(neotame)、甘露醇、薄荷醇、桉叶油、樟脑、天然矫味剂、人工矫味剂及其组合。
可包含一种或多种共溶剂以帮助溶解药物化合物(一种或多种)和/或其它赋形剂。药学上可接受的共溶剂的实例包括、但不限于丙二醇、二丙二醇、乙二醇、甘油、乙醇、聚乙二醇(例如peg300或peg400)和甲醇。在一个实施方案中，共溶剂是丙二醇。
共溶剂(一种或多种)，如果有的话，其用量可占组合物总重量的0.05-30％(w/w)，例如1-25％(w/w)，例如1-10％(w/w)。
供吸入施用的组合物包括通过加压泵或吸入器(例如，贮库干粉吸入器(reservoirdrypowderinhaler)、单位剂量干粉吸入器、预计量的多剂量干粉吸入器、鼻吸入器或加压气溶胶吸入器、雾化吸入器或吹入器)施用至呼吸道的水性、有机或水性/有机混合物、干粉或结晶组合物。出于此目的合适的组合物含有水作为稀释剂或载体，并且可与常规赋形剂一起提供，所述赋形剂例如缓冲剂、张力调节剂等。水性组合物也可通过雾化施用至鼻和呼吸道的其它区域。这类组合物可以是从加压包装(例如计量剂量吸入器)并使用合适的液化抛射剂递送的含水溶液或混悬液或气溶胶。
用于局部施用至鼻(例如用于治疗鼻炎)或肺部的组合物，包括通过加压泵递送到鼻腔的加压气溶胶组合物和水性组合物。非加压的并适于局部施用至鼻腔的组合物是特别感兴趣的。合适的组合物含有水作为用于此目的的稀释剂或载体。用于施用至肺部或鼻的水性组合物可与常规赋形剂一起提供，所述赋形剂例如缓冲剂、张力调节剂等。水性组合物也可通过雾化施用至鼻。
流体分配器通常可用于将流体组合物递送到鼻腔。流体组合物可以是水性或非水性的，但通常是水性的。这样的流体分配器可具有分配喷嘴或分配口，在使用者向流体分配器的泵装置施加力以后，通过这些分配喷嘴或分配口分配计量剂量的流体组合物。这样的流体分配器通常提供有多计量剂量的流体组合物的贮库(reservoir)，在连续驱动泵以后就可分配所述剂量。分配喷嘴或口可以构造成用于插入到使用者鼻孔中，以用于将流体组合物喷雾分配到鼻腔中。
通过吸入而局部递送到肺部的干粉组合物可以例如呈胶囊或药筒(cartridge)，例如明胶胶囊或药筒，或泡眼包装形式，例如层压铝箔的泡眼包装形式，用于吸入器或吹入器。粉末混合组合物通常含有用于吸入本发明的化合物的粉末混合物和合适的粉末基质(载体/稀释剂/赋形剂物质)例如单糖、二糖或多糖(例如乳糖或淀粉)。除药物和载体之外，干粉组合物还可包含另外的赋形剂(例如三元剂(ternaryagent)例如糖酯例如纤维二糖八乙酸酯、硬脂酸钙或硬脂酸镁)。
在一个实施方案中，可将适用于吸入施用的组合物装入安装于合适的吸入装置中的药物包装(一个或多个)上提供的多个密封剂量容器中。所述容器可以是可破坏的、可撕开的或用其它方式可打开的，一次开一个，并且干粉组合物的剂量通过在吸入装置接口管吸入施用，正如本领域已知的那样。药物包装可以采用多种不同形式，例如盘状或长条状。
干粉可吸入组合物的另一种递送方法是组合物的计量剂量在胶囊剂中提供(每个胶囊一份剂量)，所述胶囊剂然后装在吸入装置中，通常按照患者的需要。该装置具有工具以打破、刺穿或其它方法打开胶囊，使得当患者在装置接口管吸气时剂量能够被带入至患者肺部。
适用于吸入的加压气溶胶组合物可以是混悬液或溶液并且可含有本发明的化合物或其药学上可接受的盐和合适的抛射剂例如碳氟化合物或含氢的含氯氟烃或其混合物，特别是氢氟烷烃(hydrofluoroalkane)，尤其是1,1,1,2-四氟乙烷、1,1,1,2,3,3,3-七氟-正丙烷或其混合物。气溶胶组合物可任选包含本领域众所周知的另外的组合物赋形剂，如表面活性剂，例如油酸、卵磷脂或低聚乳酸或其衍生物，例如描述于wo94/21229和wo98/34596(minnesotaminingandmanufacturingcompany)中的那些；和共溶剂，例如乙醇。加压组合物通常装在罐(例如铝罐)中，用阀(例如计量阀)密闭并装入具有接口管的驱动器中。
适于阴道施用的药物组合物可以阴道栓、卫生棉条、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷雾制剂形式存在。
适于胃肠外施用的药物组合物包括水性和非水性无菌注射液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使该组合物与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌混悬剂，其可以包含助悬剂和增稠剂。该组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并可以以仅需要在临使用前添加无菌液体载体(例如注射用水)的冷冻干燥(冻干)条件储存。即时注射液和混悬剂可以由无菌粉末、颗粒和片剂来制备。
要理解的是，除了上文特别提及的成分之外，该组合物可以包含就相关制剂类型而言在本领域中常规的其它试剂，例如适于口服施用的那些可以包含矫味剂。
活性剂的治疗有效量将取决于许多因素，包括例如，个体的年龄和体重，需要治疗的确切病症及其严重程度，制剂的性质，以及施用途径，并最终将由监护医师或兽医自主决定。特别地，待治疗的个体是哺乳动物，特别是人。
该活性剂可以以每日剂量施用。该量可以以每天单一剂量给予，或更通常以每天多个(如两个、三个、四个、五个或六个)分剂量给予，以使得每日总剂量相同。
适宜地，根据本发明施用的本发明的化合物的量将是选自每天0.01mg至5g的量(作为游离或未盐化化合物计算)。。
另外，本发明的化合物可以作为前药施用。如本文所用，本发明化合物的“前药”是所述化合物的功能衍生物，当对患者施用时，其最终在体内释放本发明化合物。作为前药的本发明化合物的施用可以使本领域技术人员能够进行以下一项或多项：(a)改变化合物在体内活性的发起；(b)改变化合物在体内的作用持续时间；(c)修饰化合物在体内的运输或分布；(d)改变化合物在体内的溶解度；和(e)克服所述化合物遇到的副作用或其它困难。用于制备前药的典型功能衍生物包括化合物的修饰，其在体内是化学或酶可分裂的。包括磷酸酯、酰胺、酯、硫酯、碳酸酯和氨基甲酸酯的制备的这些修饰是本领域技术人员公知的。
本发明含义内的前药的具体且严格非限制性实例包括式(ia)、(ib)、(ic)、(id)和(i)化合物的衍生物，其中羟基部分被能够在体内降解(例如通过水解)产生羟基结构部分的反应性结构部分替代。为了避免疑问，式(ia)、(ib)、(ic)和(id)的羟基结构部分是由化学式中的标记“i”指示的，并且式(i)的羟基结构部分是连接至在化合物的苯环与丙基侧基之间的碳原子的羟基结构部分。类似地，本发明包括式(ii)化合物的衍生物，其中z是能够在体内降解(例如，通过水解)产生羟基结构部分的反应性结构部分。这种反应性结构部分的严格非限制性且仅是代表性的实例包括式orz的结构部分，其中rz具有式po3h2、co(ch2)nnh2和po3h(ch2)n-nh2(其中n为整数，例如2至5)的结构。如本领域技术人员将容易理解的，也可以使用大量的其它反应性结构部分。在含有多个羟基的化合物中，当然可以用这些反应性结构部分取代一些或所有所述羟基。
本发明的化合物可以单独使用，或与其它治疗剂组合使用。本发明的化合物和其它药物活性剂(一种或多种)可以一起或单独施用，并且当单独施用时，可以同时施用或以任意次序顺序施用，通过任何方便的途径以单独或组合的药物组合物的形式施用。
对本发明的组合物(一种或多种)和其它药物活性剂(一种或多种)的量和施用的相对时间安排进行选择以实现所需组合治疗效果。本发明的化合物和其它治疗剂(一种或多种)可以通过在包含两种化合物的单一药物组合物中同时施用来组合使用。或者，该组合可以在单独的药物组合物(各药物组合物包含化合物之一)中以顺序方式单独施用，其中，例如首先施用本发明的化合物，接着施用另一化合物，并且反之亦然。此类顺序施用可以在时间上接近(例如同时)或在时间上远离。此外，无所谓该化合物是否以相同的剂型施用，例如一种化合物可以局部施用，而另一种化合物可以口服施用。适宜地，两种化合物均口服施用。
组合可以组合试剂盒形式存在。本文中所用的术语“组合试剂盒”或“多部分试剂盒”是指用于施用本发明的组合的一种或多种药物组合物。当两种化合物同时施用时，该组合试剂盒可以以单一药物组合物(如片剂)或以单独的药物组合物含有两种化合物。当化合物并非同时施用时，该组合试剂盒将在单一包装中的单独药物组合物中或在单独包装中的单独药物组合物中含有各化合物。
该组合试剂盒还可以通过说明书提供，如剂量和施用说明书。此类剂量和施用说明书可以是提供给医生的类型，例如通过药品标签，或者它们可以是由医生提供的类型，例如给患者的说明书。
当组合以顺序方式单独施用时，其中首先施用一种，接着施用另一种，或反之亦然，此类顺序施用可以在时间上接近或在时间上远离。例如，包括在第一种活性剂施用后几分钟至几十分钟施用另一活性剂，以及在第一种活性剂施用后几小时至几天施用另一活性剂，其中时间间隔不受限制，例如，一种活性剂可以每天施用一次，另一种活性剂可以每天施用2或3次，或者一种活性剂可以每周施用一次，另一种活性剂可以每天施用一次等等。
本领域技术人员将清楚，在适当的情况下，其它治疗成分(一种或多种)可以以盐的形式(例如作为碱金属或胺盐或作为酸加成盐)、或前药的形式、或作为酯(例如低级烷基酯)、或作为溶剂化物(例如水合物)来使用以优化该治疗成分的活性和/或稳定性和/或物理特性(如溶解度)。还将清楚的是，在适当的情况下，该治疗成分可以以光学纯的形式使用。
当在同一组合物中组合时，要理解的是两种化合物必须是稳定的，并且彼此相容和与该组合物的其它组分相容，并可以配制用于施用。当单独配制时，它们可以以任何方便的组合物形式提供，方便地以本领域中对此类化合物已知的方式提供。
当本发明的化合物与针对相同的疾病、病症或障碍有效的第二治疗剂组合使用时，各化合物的剂量可以不同于单独使用该化合物时的剂量。本领域技术人员将容易了解适当的剂量。
在一个实施方案中，本发明的方法与用途中的哺乳动物是人。
本发明化合物的详述
本发明的化合物是能够抑制α1-抗胰蛋白酶聚合的化合物。通常，所述化合物能够抑制z-α1-抗胰蛋白酶聚合。
所述化合物通常是小分子化合物。如本文所用，小分子化合物通常具有2000道尔顿或更小，更经常1000道尔顿或更小，优选800道尔顿或更小的分子量。更优选分子量为600或更低，最优选500或更低。例如，小分子药物可以具有250至800，例如300至600的分子量。
在本发明的一个方面，能够抑制α1-抗胰蛋白酶聚合的化合物是通式(ii)的化合物:
其中:
-r4、r5、r6和r7如本文别处所定义(例如，与通式式(id)相关的)；
-r8是氢、氘、烷基(例如，c1-5烷基)或氘代烷基(例如，c1-5氘代烷基)；
-r9是氢、氘、烷基(例如，c1-5烷基)或氘代烷基(例如，c1-5氘代烷基)；
-z是oh、f、-nhcho、-ch2f、-chf2或cf3；且
-q是-c(＝o)-、-c(＝s)-、-c(＝noh)-、-c(＝nnh2)-或-s(o)2-。
优选基团r4、r5、r6和r7的实例如本文别处所定义。
优选的基团r8是氢、氘和任选氘化的c1-2烷基。更优选地r8是氢、甲基或乙基，再更优选地是氢或甲基，且最优选地是氢。
优选的基团r9是氢、氘和任选氘化的c1-2烷基。更优选地r9是氢、甲基或乙基、再更优选地是氢或甲基，且最优选地是氢。
z优选地是oh或f，最优选是oh。
q优选地是-c(＝o)-,-c(＝s)-或-s(o)2-，更优选地是-c(＝o)-或-c(＝s)-，且最优选地是-c(＝o)-。
在优选的实施方案中，通式(ii)的化合物是通式(id)的化合物，再更优选地是通式(i)的化合物，如本文其他地方另外定义的。
化合物与α1-抗胰蛋白酶的结合
本发明的化合物能够结合α1-抗胰蛋白酶。通常，所述化合物能够通过α1-抗胰蛋白酶蛋白结构内的隐蔽结合位点结合α1-抗胰蛋白酶。如本文所定义的隐蔽结合位点是指在未结合的蛋白质中不存在、被封闭的或仅可暂时被接近的，但当化合物与蛋白质结合时存在的结合位点；例如，隐蔽结合位点可以由于蛋白质与化合物接触而出现，和/或特征为结合位点的之前仅暂时可被接近的蛋白质构型可以由于蛋白质的存在而变得稳定。
表达“能够结合α1-抗胰蛋白酶的化合物”中的“α1-抗胰蛋白酶”是指包含seqidno:1的序列的蛋白质，即
x1dpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellx2tlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqx3ttvkvpmmkrlgmfniqhx4kklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidx5kgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmix6qntksplfmgkvvnptqk
其中x1是t或e，x2是r或h，x3是a或v，x4是c或s，x5是e或k，且x6是d或e。
为了避免疑义，如果化合物能够结合任何这样的蛋白质，即包含seqidno:1的序列的任何单一蛋白质，则它是本发明的化合物(即，化合物不必须结合seqidno:1所包括的所有可能的变体，并且这样的结合也不排除化合物也可以结合其它蛋白质，例如包含不同于seqidno:1的氨基酸序列的那些蛋白质的可能性)。
此外，也为了避免疑问，归于α1-抗胰蛋白酶蛋白中特定氨基酸的所有残基编号(例如与本发明化合物的结合位点的定义相关的)，从seqidno:1序列的n-末端计数，即x1计数为残基1，相邻的d计数为残基2，相邻的p计数为残基3，相邻的q计数为残基4，相邻的g计数为残基5，等等。当蛋白质在n-末端含有相对于seqidno:1的另外的氨基酸时，也应用该编号，即任何这样的另外的“侧翼”氨基酸不改变编号惯例，其中x1仍被计数为残基1，d被计数为残基2，p被计数为残基3，q被计数为残基4，g被计数为残基5，等等。因此，编号总是仅参照seqidno:1的氨基酸计数，并排除任何存在的另外的氨基酸残基，例如在任何信号肽或亲和标记物中的氨基酸残基和/或由用于蛋白质合成的表达载体提供的任何另外的氨基酸残基。因此，在任何相关蛋白质中，x1为氨基酸1，x4为氨基酸232，x5为氨基酸342，依此类推。
野生型m-at的最常见等位基因是m1v等位基因(估计占总量的44-49％)。在m1v等位基因中，x1是e，x2是r，x3是v，x4是c，x5是e，x6是e。完整的人m1v蛋白进一步在n-末端包含具有序列mpssvswgilllaglcclvpvsla的信号肽。因此，人m1v蛋白的全序列对应于seqidno:2的序列，即
mpssvswgilllaglcclvpvslaedpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqk。
z-α1-抗胰蛋白酶突变体与m1v等位基因的不同之处在于x5是k而不是e(即该突变定义为e342k)且x3(213)是a，因此，z-a1at的全序列对应于seqidno:3的序列，即
mpssvswgilllaglcclvpvslaedpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqattvkvpmmkrlgmfniqhckklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidkkgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqk。
为了易于处理(例如，在产生α1-抗胰蛋白酶蛋白质的晶体和/或产生与本发明化合物结合的α1-抗胰蛋白酶蛋白质的复合物中)，可能需要将蛋白质的半胱氨酸232突变为丝氨酸，即，实现突变c232s。这是保守突变，并且不位于与化合物结合位点直接相关的位置。考虑到其可变的氨基酸残基x4，seqidno:1包括这两种蛋白质。
在一个优选实施方案中，所述化合物能够结合包含seqidno:1的蛋白质，其中x1为e，x2为r，x3为a，x4为c，x5为k，x6为e，即该序列与z-α1-抗胰蛋白酶的相应部分具有100％序列同一性。
在另一个示例性实施方案中，蛋白质可以是包含seqidno:1的序列，并且其另外包含由表达载体提供的亲和标记物(例如六组氨酸亲和标记物)和/或氨基酸。例如，这种蛋白质可以是在大肠杆菌中表达的蛋白质。一种这样的示例性蛋白质的全序列是seqidno:4的序列，即
mrgshhhhhhtdpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhskklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqk。
本发明实施例2中所用的该蛋白包含n-末端序列mrgshhhhhht，其具有六组氨酸亲和标记物和合成中所用表达载体提供的氨基酸，其中x1是t，该蛋白还包含232位的丝氨酸(即x4是s)以有助于操作的简便性。该蛋白质在342位进一步包含谷氨酸(即x5为e)。
本发明的重要发现是主题化合物能够特异性结合到α1-抗胰蛋白酶蛋白质的一部分中，所述蛋白质的一部分先前未被证明是药物结合的位点(更不用说在形成化合物-蛋白质结合时能够抑制蛋白质聚合的结合位点)。
更特别地，所述结合位点优选位于所述α1-抗胰蛋白酶的β-折叠-a和β-折叠-b之间。所述β-折叠-a包含对应于以下一种或多种的氨基酸：seqidno:1的(i)残基140-144；(ii)残基111-121；(iii)残基181-191；(iv)残基330-340；和(v)残基292-299。优选所述β-折叠-a包含对应于(i)至(v)中两个或多个，更优选三个或多个，更优选四个或多个，最优选所有五个的氨基酸。所述β-折叠-b包含对应于以下一种或多种的氨基酸:seqidno:1的(i′)残基228-231；(ii′)残基236-244；(iii′)残基248-256；(iv′)残基369-376；(v′)残基381-389；和(vi′)残基49-53。优选地，所述β-折叠-b包含对应于(i')至(vi')中的两个或更多个，更优选地三个或更多个，更优选地四个或更多个，更优选地五个或更多个，最优选地全部六个的氨基酸。
因此，优选地，所述结合位点位于所述α1-抗胰蛋白酶的β-折叠-a和β-折叠-b之间，其中：所述β-折叠-a包含对应于seqidno:1的残基140-144、111-121、181-191、330-340和292-299的氨基酸；所述β-折叠-b包含对应于seqidno:1的残基228-231、236-244、248-256、369-376、381-389和49-53的氨基酸。
“位于β-折叠-a和β-折叠-b之间”是指当化合物与α1-抗胰蛋白酶结合时，至少部分(例如基本上全部或全部)化合物容纳在所述β-折叠-a和所述β-折叠-b之间的物理空间中。本领域技术人员容易理解，化合物在蛋白质上的结合位点的位置的确认可以通过本领域公知的方法提供，例如通过使用常规结晶技术(参见，例如，本文的实施例2)。
更具体地说，结合位点更优选位于对应于以下三个或更多个的氨基酸链之间:(a)seqidno:1的残基191-194；(b)seqidno:1的残基288-293；(c)seqidno:1的残基371-374；(d)seqidno:1的残基249-253；和(e)seqidno:1的残基240-243。特别优选的是，结合位点位于对应于以下四个或更多个、最优选位于对应于以下每一项的氨基酸链之间：(a)seqidno:1的残基191-194；(b)seqidno:1的残基288-293；(c)seqidno:1的残基371-374；(d)seqidno:1的残基249-253；和(e)seqidno:1的残基240-243。另外优选的是，结合位点还位于相应于(f)seqidno:1的残基338-341的氨基酸链之间。“氨基酸链”是指蛋白质中如本文编号的多个氨基酸残基，例如对应于seqidno:1的残基191-194的氨基酸链是指seqidno:1的氨基酸191、192、193和194。“位于”所述氨基酸链“之间”是指当化合物与α1-抗胰蛋白酶结合时，至少部分(例如，基本上全部或全部)化合物被容纳在相应氨基酸链之间的物理空间中。
在一个示例性的方面，结合位点包含seqidno:1的w194、y244、l291、p289、f252、k290、i293、l338、i340、f372和m374中的一个或多个。在该示例性的方面，所述结合位点优选包含seqidno:1的w194、y244、l291、p289、f252、k290、i293、l338、i340、f372和m374中的三个或多个、更优选五个或多个、还更优选七个或多个、更优选九个或多个。结合位点可例如包含seqidno:1的w194、y244、l291、p289、f252、k290、i293、l338、i340、f372和m374中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或全部11个。与结合位点相关的特别优选的氨基酸是w194、y244、l291和p289，因此优选地结合位点至少包含w194、y244、l291和p289。如本文进一步所述，化合物可以最佳地能够与蛋白质的相关氨基酸残基的官能团形成非共价键(包括但不限于氢键)。
优选地，所述化合物对m-α1-抗胰蛋白酶的kd小于约250nm，所述m-α1-抗胰蛋白酶包含seqidno:2的序列和/或所述化合物对z-α1-抗胰蛋白酶的kd小于约25nm，所述z-α1-抗胰蛋白酶包含seqidno:3的序列。优选地，所述化合物对z-α1-抗胰蛋白酶的kd至少比所述化合物对m-α1-抗胰蛋白酶的kd低十倍，所述m-α1-抗胰蛋白酶包含seqidno:2的序列，并且所述z-α1-抗胰蛋白酶包含seqidno:3的序列。测量kd的方法在本领域众所周知，且可以使用任何该类方法。一种示例性的这种方法描述于实施例2中，本文所有关于kd的参考是在室温下(例如在20℃)测定的。
有助于蛋白质结合的优选结构元件
在本公开的一个示例性方面，化合物包含β-羟基酰胺结构部分，即式–c(oh)(x)-cx2-nh-c(o)-的结构部分，其中每个x独立地表示取代基(例如，如本文别处定义的任何具体取代基)。
重要的是，已经发现所述β-羟基酰胺结构基序基本上有助于本发明化合物在本发明结合位点结合α1-抗胰蛋白酶的能力。特别地，这样的结构部分可以通过在以下之间形成氢键而提供与包含seqidno:1的序列的α1-抗胰蛋白酶的结合：(i)β-羟基和seqidno:1的l291；(ii)羧酰胺基的nh和seqidno:1的p289；和(iii)羧酰胺基的羰基和seqidno:1的y244。
因此，优选所述化合物包含式(ia)的四价结构部分
其中所述化合物能够通过在以下之间形成氢键而结合包含seqidno:1的序列的α1-抗胰蛋白酶：(i)羟基i和seqidno:1的l291；(ii)nh基ii和seqidno:1的p289；和(iii)羰基iii和seqidno:1的y244。
四价表示式(ia)的结构部分含有四个结合点，即在如下所示的1、2、3和4位:
更优选地，所述化合物包含式(ib)的二价结构部分
二价是指式(ib)结构部分含有两个结合点，即在如下所示的1和2位
在式(ib)中，如在式(ia)中，通常所述化合物能够通过在以下之间形成氢键而结合α1-抗胰蛋白酶：(i)羟基i和seqidno:1的l291；(ii)nh基ii和seqidno:1的p289；和(iii)羰基iii和seqidno:1的y244。
r4和r5可以彼此相同或不同。它们独立地选自氢、c1-5烷基、c2-5链烯基、c2-5炔基和c1-4烷氧基。
r5优选地是氢、甲基、乙基、乙烯基、乙炔基或甲氧基。更优选地r5是氢、甲基或乙基。最优选地r5是氢。
r4优选地是c2-4烷基、c2-4链烯基、c2-4炔基或c1-3烷氧基。更优选地r4是正丙基、-ch＝ch-ch3、-c-c＝ch2或乙氧基。最优选地r4是正丙基。
特别优选的r5和r4组合是当r5是氢且r4是正丙基时。已经发现在羧酰胺的α碳上存在单个正丙基取代基特别有利于使化合物在相关结合位点结合α1-抗胰蛋白酶。
再更优选地，所述化合物包含式(ic)的单价结构部分
单价是指式(ic)结构部分含有一个结合点，即在以下1位
在式(ic)中，如在式(ia)和(ib)中，通常所述化合物能够通过在以下之间形成氢键而结合α1-抗胰蛋白酶:(i)羟基i和seqidno:1的l291；(ii)nh基ii和seqidno:1的p289；和(iii)羰基iii和seqidno:1的y244。r4和r5如对式(ib)所定义。r6是取代或未取代的芳基或杂芳基。通常，当化合物与所述α1-抗胰蛋白酶结合时，r6能够与seqidno:1的w194的侧链堆叠。
r6优选是取代或未取代的，并且是：(a)c6-10芳基；或(b)含有5至10个环原子的杂芳基。更优选地r6是取代或未取代的，并且是：(a)二碳环芳基；或(b)双环杂芳基。
当r6为芳基时，特别优选的基团包括萘基和茚满基(在两种情况下为取代或未取代的，并且在两种情况下其中任选一个碳环原子可被羰基取代)，最优选茚满基(任选其中一个碳环原子可被羰基取代)。
当r6为杂芳基时，优选的基团包括氧化吲哚基(例如，2-氧化吲哚基或3-氧化吲哚基)、苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并三唑基、吲哚基、异吲哚基和吲唑基(在所有情况下为取代或未取代的，且在所有情况下其中任选一个碳环原子可被羰基取代)，更优选的基团包括氧化吲哚基(例如2-氧化吲哚基或3-氧化吲哚基)、苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基和吲哚基(在所有情况下为取代或未取代的，且在所有情况下其中任选一个碳环原子可被羰基取代)。
对于其中一个碳环原子被羰基取代的任何芳基或杂芳基，所得环实体为-c(o)-。当“母体”碳环原子与相邻环原子形成双键时，该碳环原子取代为-c(o)-伴随着所述相邻环原子的饱和，例如通过向其加入氢原子或本文定义的任选取代基。
特别优选的r6基团是取代或未取代的双环芳基和杂芳基，其包含与五元环稠合的六元环(即含有9个环原子)。在这些r6基团中，优选地五元环的环原子(其不与五元环和六元环共有的环原子中的任一个相邻)是带有羰基的碳原子，即它是-c(o)-。例如，优选的r6基团包括下列6-1至6-12:
其中与环原子(优选碳环原子)连接的一个或多个h-基团可以被取代基取代。
再更优选地、r6是取代或未取代的4-氧化吲哚基(即4-(2-氧化吲哚基)，其是上文基团6-1。
优选r6基团是未取代的或被1-4个取代基，例如1或2个取代基取代。更优选r6基团是未取代的或被1或2个取代基取代。最优选r6基团是未取代的或被1个取代基取代。
r6的任选取代基包括在本文“定义”部分中定义的那些。r6的特别优选的取代基包括卤素原子、c1-5烷基、-nr2(其中每个r独立地选自h和c1-5烷基)和羟基。更特别优选的取代基包括f、ch3、ch2ch3、ch2ch2ch3、ch(ch3)2、nh2、nhch3、n(ch3)2、oh、cl、br和i，还更优选的取代基是f、ch3、nh2、oh和cl。最优选的取代基是f和cl(例如f)。
在一个示例性方面，r6是式r6′的基团
其中r1选自h、f、ch3、ch2ch3、ch2ch2ch3、ch(ch3)2、nh2、nhch3、n(ch3)2、oh、cl、br和i。在式r6′中，r1更优选选自h、f、ch3、nh2、oh和cl，并且还更优选选自h和f。
特别优选的是，所述化合物具有式(id)的结构
在式(id)中，如在式(ia)、(ib)和(ic)中，通常所述化合物能够通过在以下之间形成氢键而结合α1-抗胰蛋白酶：(i)羟基i和seqidno:1的l291；(ii)nh基ii和seqidno:1的p289；和(iii)羰基iii和seqidno:1的y244。r4和r5如对式(ib)所定义。r6如对式(ic)所定义。
式(id)中的r7是取代或未取代的芳基或杂芳基。优选地r7是取代或未取代的苯基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基吡嗪基或三嗪基。更优选地r7是取代或未取代的苯基。
r7优选被1、2、3、4或5个取代基取代，更优选被1、2或3个取代基取代，最优选被2个取代基取代。r7的任选取代基包括在本文“定义”部分中定义的那些。特别优选的r7取代基包括卤素原子和c1-5烷基、-nr2(其中每个r独立地选自h和c1-5烷基)、羟基、-sh和-cn基团。
特别优选的r7是被1、2、3、4或5个(优选至少2个)取代基取代的苯基。优选地，所述苯基包括至少一个间位取代基和一个邻位取代基，即它具有式r7″的结构
其中r2和r3是取代基，每个rx是独立选择的取代基，n是0-3的整数。更优选地所述苯基具有式r7′的结构
优选地在r7′和r7″中，每个r2、r3和任何rx独立地选自卤素原子和c1-5烷基、-nr2(其中每个r独立地选自h和c1-5烷基)、羟基、-sh和-cn基团。更优选地，r2选自ch3、cl、ch2ch3、ch2ch2ch3、ch(ch3)2、nh2、nhch3、n(ch3)2、oh、sh、cn、f、br和i；且r3选自f、cl、cn、ch3、ch2ch3、ch2ch2ch3、ch(ch3)2、nh2、nhch3、n(ch3)2、oh、br、i和sh。再更优选地r2选自ch3、cl、nh2、oh、sh、cn和f；且r3选自f、cl、cn、ch3、nh2、oh和sh。最优选地r2选自ch3和cl；且r3选自f、cl和cn。
式(id)中r4、r5、r6和r7的优选的组合如下，其中:
-r4和r5独立地选自氢、c1-5烷基、c2-5链烯基、c2-5炔基和c1-4烷氧基；
-r6是c6-10芳基或杂芳基，其含有5至10个环原子，所述芳基或杂芳基未被取代或被一个或多个(例如1-5个)选自卤原子和c1-5烷基、c1-4烷氧基、c1-4烷基硫羟、-nr2(其中每个r独立地选自h和c1-5烷基)、羟基、硫羟(sh)、氰基(cn)、硝基和磺酸基的取代基取代；以及
-r7是苯基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基或三嗪基，其为未取代的或被一个或多个(例如1-4个)选自卤素原子和c1-5烷基、c1-4烷氧基、c1-4烷基硫羟、-nr2(其中每个r独立地选自h和c1-5烷基)、羟基、硫羟(sh)、氰基(cn)、硝基和磺酸基的取代基取代。
式(id)中r4、r5、r6和r7的更优选的组合如下，其中:
-r4是c2-4烷基、c2-4链烯基、c2-4炔基或c1-3烷氧基；
-r5是氢、甲基、乙基、乙烯基、乙炔基或甲氧基；
-r6选自以下6-1至6-12:
其中与环原子连接的一个或多个(例如1-3个)h-基团任选被选自卤素原子和c1-5烷基、c1-4烷氧基、c1-4烷基硫羟、-nr2(其中每个r独立地选自h和c1-5烷基)、羟基、硫羟(sh)、氰基(cn)、硝基和磺酸基团的取代基代替；以及
-r7是苯基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基或三嗪基，其为未取代的或被一个或多个(例如1-4个)选自卤素原子和c1-5烷基、-nr2(其中每个r独立地选自h和c1-5烷基)、羟基、-sh和-cn的取代基取代。
式(id)中r4、r5、r6和r7的还更优选的组合如下，其中:
-r4是正丙基、-ch＝ch-ch3、-c-c＝ch2或乙氧基；
-r5是氢、甲基或乙基；
-r6是4-(2-氧化吲哚基)基团，其为未取代的或被一个或多个(例如1-3个)选自卤素原子和c1-5烷基、-nr2(其中每个r独立地选自h和c1-5烷基)和羟基的取代基取代；以及
-r7是式r7″的基团
-其中r2和r3是取代基，每个rx是独立选择的取代基，n是0-3的整数，每个取代基独立选自卤素原子和c1-5烷基、-nr2(其中每个r独立地选自h和c1-5烷基)、羟基、-sh和-cn基团。
在一个示例性方面，所述化合物具有式(i)的结构
其中
-r1选自h、f、ch3、ch2ch3、ch2ch2ch3、ch(ch3)2、nh2、nhch3、n(ch3)2、oh、cl、br和i；
-r2选自ch3、cl、ch2ch3、ch2ch2ch3、ch(ch3)2、nh2、nhch3、n(ch3)2、oh、sh、cn、f、br和i；且
-r3选自f、cl、cn、ch3、ch2ch3、ch2ch2ch3、ch(ch3)2、nh2、nhch3、n(ch3)2、oh、br、i和sh。
优选地在式(i)中，r1选自h、f、ch3、nh2、oh和cl。优选地在式(i)中，r2选自ch3、cl、nh2、oh、sh、cn和f。优选地在式(i)中，r3选自f、cl、cn、ch3、nh2、oh和sh。优选地在式(i)中，r1选自h、f、ch3、nh2、oh和cl；且r2选自ch3、cl、nh2、oh、sh、cn和f；且r3选自f、cl、cn、ch3、nh2、oh和sh。
特别优选地在式(i)中，r1选自h和f。特别优选地在式(i)中，r2选自ch3和cl。特别优选地在式(i)中，r3选自f、cl和cn。特别优选地在式(i)中，r1选自h和f；且r2选自ch3和cl；且r3选自f、cl和cn。
非限制性的示例性式(i)化合物是那些，其中:(a)r1是h，r2是ch3，且r3是f；(b)r1是h，r2是ch3，且r3是cl；(c)r1是f，r2是cl，且r3是cn；和(d)r1是f，r2是cl，且r3是f。
治疗适应证
本发明的化合物可用于治疗由α1抗胰蛋白酶介导的疾病，包括α-1-抗胰蛋白酶缺陷。由α-1抗胰蛋白酶介导的疾病包括α-1抗胰蛋白酶缺陷、肝功能障碍、纤维化、肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌，肺部疾病、功能障碍和炎症包括哮喘、copd、肺气肿和肺癌，皮肤炎性病症包括皮炎和瘙痒。通常，由α-1抗胰蛋白酶介导的疾病是α-1抗胰蛋白酶基因突变的结果，并符合被称为‘丝氨酸蛋白酶病’的一般疾病类别。
本发明的化合物可特别用于治疗呼吸系统疾病，包括copd和肺气肿。
更特别地，本发明的化合物可用于治疗由α1抗胰蛋白酶的突变形式引起的病症，包括α1抗胰蛋白酶的突变z-at形式，因此可用于治疗与z-at相关的疾病，特别是肝脏疾病，包括黄疸、肝衰竭、肝硬化、自身免疫性肝炎和肝细胞癌。
α-1抗胰蛋白酶缺陷在每2000北欧血统的人中累及1人，导致肝和肺病。在编码α1-抗胰蛋白酶的serpina1基因中已鉴定了超过100种不同的突变，但估计95％的严重缺陷由z-at形式(glu342lys)引起。这种氨基酸取代干扰α1-抗胰蛋白酶的折叠，导致仅分泌～15％的成熟蛋白。大部分剩余的蛋白质通过erad-蛋白酶体途径降解，但是大约15％形成在肝细胞内质网内积累的有序聚合物。循环中重要蛋白酶抑制剂的随后缺乏导致肺免受嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的保护不足，导致肺气肿。肝细胞内聚合物的积累对细胞是细胞毒性的，引起新生儿肝炎、肝硬化和肝细胞癌。肝内聚合物还使肝对环境损伤如酒精、脂肪或病毒性肝炎的损害敏感。
α1-抗胰蛋白酶对靶蛋白酶——弹性蛋白酶的抑制涉及对蛋白水解机制的破坏：在对α1-抗胰蛋白酶反应中心环(rcl)中的识别序列进行亲核攻击后，两个蛋白质通过酯键共价连接。接着发生rcl快速插入中心β-折叠a，将其从5-链构型转化为6-链构型。并行发生的蛋白酶从丝酶抑制蛋白的一个极至另一个极的易位及其活性位点的压缩，防止了该正常瞬时连接的水解；这两者因此被不可逆地捕获失活的蛋白酶-丝酶抑制蛋白共价复合物。z突变位于β折叠a的链5的头部。它扰乱局部环境，允许α1-抗胰蛋白酶转为(populate)不稳定的中间体(其被称为m*状态)，其中β折叠a打开，螺旋f的上部解旋。仍然需要确定rcl的插入是否是分子间的——导致环-片二聚体，其延伸形成更长聚合物——或者是分子内的，其具有c-末端区的结构域交换，后者为沉积在肝组织中的病理聚合物提供亚单位间连接。α1-抗胰蛋白酶的不同突变体的其它形式的聚合也是可能的。去稳定的β-折叠a插入反应性中心环的能力是聚合物形成中的一个必须步骤。这使得聚合的机理与蛋白酶抑制的机理密切相关：在两者中，反应性中心环是在中等稳定和超稳定构象之间的热力学驱动转变中的中心作用物。
在丝酶抑制蛋白超家族的其它成员中也观察到丝酶抑制蛋白抑制的生理机制和聚合物的病理学产生之间的共性，并且产生一类称为丝酶抑制蛋白病的相关病理学。这些包括神经抑丝酶包涵体家族性脑病(fenib)，其由神经萜中的聚合突变引起，以及由聚合和抗凝血酶缺陷引起的血栓形成形式。
治疗法和治疗方法
本发明还提供了本发明的化合物，其用于治疗法。本发明具体提供了本发明的化合物作为活性治疗物质在治疗由α-1-抗胰蛋白酶介导的疾病中的用途。
本发明还提供本发明化合物在制备用于治疗由α-1-抗胰蛋白酶介导的疾病的药物中的用途。
在另一个方面，提供了包含本发明化合物和至少一种可用于治疗由α-1-抗胰蛋白酶介导的疾病的其它治疗剂的组合。
在另一个方面，提供了包含本发明化合物和至少一种可用于治疗由α-1-抗胰蛋白酶介导的疾病的其它治疗剂的组合，其用于治疗由α-1-抗胰蛋白酶介导的疾病。
在另一个方面，提供了包含本发明化合物和至少一种可用于治疗copd的其它治疗剂的组合在制备用于治疗由α-1-抗胰蛋白酶介导的疾病的药物中的用途。
在另一个方面，提供治疗copd的方法，其包括向有此需要的人施用治疗有效量的组合，所述组合包含本发明的化合物和至少一种可用于治疗由α-1-抗胰蛋白酶介导的疾病的其它治疗剂。
在另一个方面，提供了药物组合物，其包含含有本发明化合物和至少一种可用于治疗α-1-抗胰蛋白酶介导的疾病的其它治疗剂的组合以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
呼吸系统疾病
对于治疗呼吸系统疾病，包括copd，本发明的化合物或药物组合物可以与一种或多种支气管扩张剂或其药物组合物一起施用。例如，本发明的化合物可以与一种或多种支气管扩张剂一起配制在单一组合物中，例如用于吸入的干粉剂。或者，包含本发明化合物的药物组合物可与包含一种或多种支气管扩张剂的药物组合物同时或依次施用。在另一个替代方案中，包含本发明化合物和支气管扩张剂的组合物可以与包含另一种支气管扩张剂的药物组合物联合施用。在一个实施方案中，包含本发明化合物的药物组合物和包含一种或多种支气管扩张剂的药物组合物可以各自保持在适于通过吸入同时施用两种组合物的装置中。在另一个实施方案中，包含本发明化合物以及支气管扩张剂的药物组合物和包含另一种支气管扩张剂的药物组合物可以各自保持在适于通过吸入同时施用两种组合物的装置中。
与本发明化合物一起施用的合适支气管扩张剂包括β2-肾上腺素受体激动剂和抗胆碱药。β2-肾上腺素受体激动剂的实例包括例如维兰特罗、沙美特罗、沙丁胺醇、福莫特罗、沙甲胺醇、非诺特罗、卡莫特罗、依坦特罗、那明特罗、克仑特罗、吡布特罗、氟丁特罗(flerbuterol)、瑞普特罗、班布特罗、茚达特罗、特布他林及其盐，例如沙美特罗的昔萘酸盐(1-羟基-2-萘羧酸酯)、沙丁胺醇的硫酸盐或福莫特罗的富马酸盐。抗胆碱药的实例包括umeclidinium(例如作为溴化物)、异丙阿托品(例如作为溴化物)、氧托铵(例如例如作为溴化物)和噻托铵(例如作为溴化物)。在一个实施方案中，本发明化合物可与β2-肾上腺素受体激动剂如维兰特罗和抗胆碱能剂如umeclidinium一起施用。
肝病
为了治疗肝病，本发明的化合物或药物组合物可以与用于治疗这些疾病的其它治疗剂一起施用。
通用合成方法
通式(i)化合物可以通过有机合成领域已知的方法制备。在所有方法中，应充分理解，根据化学一般原理，必要时可以使用用于敏感或反应性基团的保护基团。保护基团根据有机合成的标准方法(t.w.green和p.g.m.wuts(1999)protectivegroupsinorganicsynthesis，第3版，johnwiley&sons)操作。这些基团在化合物合成的方便阶段使用本领域技术人员容易明白的方法除去。方法的选择以及反应条件和它们的实施顺序应与式(i)化合物的制备一致。本发明的其它化合物也可使用本领域常规已知的方法制备，并且在适用的情况下，参考本文所述的原理和具体反应。
鉴定候选药物化合物的方法
本发明人发现，本发明的化合物通过在特定结合位点与α1-抗胰蛋白酶蛋白结合而抑制α1-抗胰蛋白酶聚合，也产生了基于测定任意候选药物化合物与蛋白质上相同位点结合的能力的测定方法。
因此，本发明还提供了鉴定候选药物化合物的方法。在该方法中，使候选药物化合物与α1-抗胰蛋白酶接触，以形成候选药物化合物与α1-抗胰蛋白酶之间的复合物。α1-抗胰蛋白酶是包含本文其它地方定义的seqidno:1的蛋白质(或具有一个或多个氨基酸取代的该序列的衍生物)。优选地，将候选药物化合物与α1-抗胰蛋白酶接触的步骤包括形成α1-抗胰蛋白酶的晶体并将所述晶体与所述候选药物接触。
随后，该方法包括解析复合物的结构，这可以使用本领域公知的晶体结构解析方法常规地进行(还参见例如本申请的实施例2)。
最后，该方法包括，确定在复合物中，候选药物化合物是否存在于如本文定义的结合位点中。如果候选药物化合物存在于结合位点中，则这表明化合物可能能够抑制α1-抗胰蛋白酶聚合，并因此具有有益的治疗性质，类似于本文别处讨论的本发明化合物。
实施例
实施例1
通用方法
除非另有说明，原料是可商购的。所有溶剂和商业试剂都是实验室级的，并且按原样使用。
式(i)化合物可以基本上按照反应流程1从相应的氨基醇和相应的苯甲酸的酰胺偶联来合成。
反应流程1
缩写:
dmso二甲基亚砜
hatun-[(二甲基氨基)-1h-1,2,3-三唑并-[4,5-b]吡啶-1-基亚甲基]-n-甲基甲胺鎓六氟磷酸盐n-氧化物
r.t.室温
rt保留时间
lcms方法
手性hplc方法
化合物1:
n-[(1s,2r)-1-(3-氟-2-甲基苯基)-1-羟基戊-2-基]-2-氧代-2,3-二氢-1h-吲哚-4-甲酰胺
在圆底烧瓶中，在0℃向(1s,2r)-2-氨基-1-(3-氟-2-甲基苯基)戊-1-醇盐酸盐(中间体1，12.9g，51.9mmol)、2-氧代二氢吲哚-4-甲酸(9.2g，51.9mmol)和三乙胺(10.5g，103.9mmol)在二甲基甲酰胺(100ml)中的溶液中加入hatu(19.8g，51.9mmol)。将该反应混合液在0℃搅拌1h，然后用乙酸乙酯(200ml)稀释。将该溶液用nahco3的饱和溶液(100ml)和盐水(2x100ml)洗涤。将有机部分经硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发，得到粗产物，将其经快速色谱纯化(biotageisolera,340g柱，二氯甲烷/乙腈80/20至40/60作为洗脱剂)，得到n-[(1s,2r)-1-(3-氟-2-甲基苯基)-1-羟基戊-2-基]-2-氧代-2,3-二氢-1h-吲哚-4-甲酰胺，为白色固体(12.5g，y＝65.0％)。
在圆底烧瓶中，在室温将(12.5g，33.74mmol)混悬于乙酸乙酯(100ml)中。将该混悬液加热至60℃，并加入乙酸乙酯直至混合物变得均匀(总计≈200ml溶剂)。将该溶液在室温下冷却过夜，通过抽滤收集形成的白色沉淀。将固体在真空下于40℃的烘箱中储存，得到结晶的n-[(1s,2r)-1-(3-氟-2-甲基苯基)-1-羟基戊-2-基]-2-氧代-2,3-二氢-1h-吲哚-4-甲酰胺，为白色固体(10.8g，>98％ee，87％回收)。
lcms:rt0.90min,mh+371(方法a)
1hnmr(500mhz,dmso-d6)δppm0.80(t,j＝7.34hz,3h),1.07-1.21(m,1h),1.30-1.43(m,1h),1.45-1.54(m,1h),1.56-1.67(m,1h),2.31(d,j＝1.51hz,3h),3.46(s,2h),4.06-4.17(m,1h),4.85(t,j＝5.21hz,1h),5.44(d,j＝4.80hz,1h),6.89(d,j＝7.68hz,1h),6.99(t,j＝8.92hz,1h),7.11-7.25(m,3h),7.28(d,j＝7.68hz,1h),7.97(d,j＝8.92hz,1h),10.45(s,1h)。
手性hplc:rt6.3min
中间体1:
(1s,2r)-2-氨基-1-(3-氟-2-甲基苯基)戊-1-醇盐酸盐
在圆底烧瓶中，在0℃将((1s,2r)-1-(3-氟-2-甲基苯基)-1-羟基戊-2-基)氨基甲酸叔丁酯(中间体2,15.8g，50.74mmol)溶于hcl的4m二噁烷溶液(100ml)中。将该混合物在相同温度下搅拌2小，蒸发溶剂。将残余物混悬于300ml乙醚中，并搅拌1h。将该混悬液过滤，得到(1s,2r)-2-氨基-1-(3-氟-2-甲基苯基)戊-1-醇盐酸盐，为白色固体(11.9g，y＝95.0％)。
lcms:rt0.85min,mh+212(方法b)
中间体2:
((1s,2r)-1-(3-氟-2-甲基苯基)-1-羟基戊-2-基)氨基甲酸叔丁酯
在圆底烧瓶中，将(r)-(1-(3-氟-2-甲基苯基)-1-氧代戊-2-基)氨基甲酸叔丁酯(中间体3,18.7g，60.4mmol)溶于甲苯(150ml)中，并在室温下加入异丙醇(100ml)和异丙醇铝(49.4g，241.8mmol)。将该溶液在50℃搅拌16小时，，然后将其倒入nh4cl饱和溶液中，并用乙酸乙酯萃取(4x300ml)。收集有机部分，用硫酸钠干燥，减压除去溶剂，得到浅黄色油状粗产物。将该粗产物经快速色谱纯化(biotageisolera,340g柱，环己烷/乙酸乙酯80/20至50/50作为洗脱剂)，得到((1s,2r)-1-(3-氟-2-甲基苯基)-1-羟基戊-2-基)氨基甲酸叔丁酯，为无色油状物(15.8g，y＝84.0％)
lcms:rt1.16min,mh+312(方法a)
中间体3:
(r)-(1-(3-氟-2-甲基苯基)-1-氧代戊-2-基)氨基甲酸叔丁酯
在室温下，向圆底烧瓶中的(3-氟-2-甲基苯基)硼酸(中间体4，50g，0.32mol)、(r)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酸对甲苯基硫醇酯((r)-s-p-tolyl2-((tert-butoxycarbonyl)amino)pentanethioate)(53.2g,0.16mol)、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(7.3g，8.0mmol)和噻吩-2-羧酸铜(i)(61.0g，0.32mol)在1,4-二噁烷(500ml)中的混合物中加入亚磷酸三乙酯(10.6g，64.0mmol)。将该反应混合液在室温搅拌4h，然后在硅藻土垫上过滤。减压蒸发溶剂，并将粗品溶于中乙酸乙酯(500ml)；将该溶液用水(500ml)和盐水(2x500ml)洗涤。将有机部分经硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发，得到粗物质(100g)，为黑色油状物。将65g批次的粗制的物质经快速色谱纯化(biotageisolera,3x340g柱，环己烷/二氯甲烷60/40至0/100作为洗脱剂)，得到(r)-(1-(3-氟-2-甲基苯基)-1-氧代戊-2-基)氨基甲酸叔丁酯，为无色油状物(18.7g，60.4mmol)。
lcms:rt1.26min,mh+310(方法a)
中间体4:
(r)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酸对甲苯基硫醇酯((r)-s-p-tolyl2-((tert-butoxycarbonyl)amino)pentanethioate)
在圆底烧瓶中，向(r)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酸(中间体5,85.0g，0.39mol)在乙酸乙酯(800ml)中的溶液中加入4-甲基苯-1-硫醇(53.5g，0.43mol)和1-羟基苯并三唑(50.0g，0.59mol)。将该混合液冷却至0℃，并加入n,n′-二环己基碳二亚胺(80.5g，0.39mol)。将该反应混合液在室温搅拌16h；然后通过抽滤除去形成的白色固体。将滤液用nahco3的饱和溶液(700ml)、水(700ml)和盐水(700ml)洗涤。将有机部分经硫酸钠干燥，过滤，并将溶剂减压蒸发，得到粗产物，为白色固体。将粗制的物质经快速色谱纯化(biotageisolera,340g柱，环己烷/二氯甲烷60/40至0/100作为洗脱剂)，得到(r)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酸对甲苯基硫醇酯，为白色固体(111.0g，y＝88.0％)。
lcms:rt1.30min,mh+324(方法a)
中间体5:
(r)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酸
在圆底烧瓶中，在室温下，向(2r)-2-氨基戊酸(75.0g，0.64mol)在水(250ml)中的混悬液中加入碳酸钠(68.0g，0.64mol)。经一小时滴加二碳酸二叔丁酯(139.9g，0.64mol)在四氢呋喃(400ml)中的溶液。将该反应混合液在室温搅拌24h，然后减压浓缩(约400ml)。加入饱和柠檬酸溶液(300ml)，直到ph值达到≈3。将水层用乙酸乙酯(4x500ml)洗涤。收集有机部分，用硫酸镁干燥并减压蒸发，得到(r)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)戊酸，为浅黄色油状物(137.0g，y＝98.6％)。
lcms:rt0.82min,mh+218(方法a)
类似地制备了:
本发明化合物抑制z-α-1-抗胰蛋白酶(z-a1at)聚合的效力可通过对本文所述纯化的z-a1at进行时间分辨荧光能量转移(tr-fret)试验来测定。所有式(i)化合物都已证明具有半数最大抑制浓度(ic50)小于一微摩尔(1μm)的体外z-a1at聚合的抑制活性。化合物1-4在下述试验的平均活性数据:
z-α-1-抗胰蛋白酶聚合抑制试验方案
从z-a1at型纯合供体的人血浆中纯化z-α-1-抗胰蛋白酶。根据公开的方案(lomas等biochemistry1993；32:500-508)进行纯化，包括硫酸铵沉淀、硫醇交换分级和阴离子交换分级。
在384孔测定板中，在含有0.01％tween-20的pbs缓冲液中将纯化的z-a1at稀释至5nm，并与溶解于dmso中的不同浓度的抑制剂化合物混合。在37℃下孵育72小时后，通过向测定板中加入抗体检测混合物，使用时间分辨荧光共振能量转移(tr-fret)测定模式检测z-a1at聚合物的量。检测混合物含有a1at-聚合物特异性单克隆抗体(miranda等人hepatology2010；52:1078–1088)、铽标记的抗小鼠抗体，多克隆兔抗a1at抗体和alexa488标记的抗兔抗体。将tr-fret数据用对照标准化(dmso载体对照产生0％抑制，活性化合物的饱和浓度产生100％抑制)，通过用4-参数逻辑曲线拟合标准化数据得出ic50值。
实施例2
介绍
本工作的目的是开发zα1-抗胰蛋白酶折叠的小分子校正剂，其能够阻断肝细胞内质网内聚合物的形成，并且其适于口服施用作为α1-抗胰蛋白酶缺陷的潜在治疗。为了实现这一点，需要克服许多挑战：(i)代表药物靶标的蛋白质的特定形式是位于内质网中的高度可移动的折叠中间体；(ii)靶标药理学涉及防止大的蛋白质-蛋白质相互作用，且分子具有类药物性质以使得能够口服施用这一要求极大地限制了合适的化学空间；(iii)作为非经典的药物靶标，小分子结合剂在化合物筛选文库中可能不是很好被代表；(iv)循环单体zα1-抗胰蛋白酶的相对高浓度(～5μm)，甚至在具有严重血浆缺陷的个体中，代表了化合物的高亲和性库，这限制其接近肝细胞中的靶标、且需要药物的高总血液浓度以实现肝中足够的游离药物浓度和靶标接合。
本文报道了通过优化来自编码文库技术筛选的命中物获得的第一种zα1-抗胰蛋白酶折叠的小分子药物样校正剂，其适于口服递送，在人患者来自ipsc的肝细胞中校正折叠，并在α1-抗胰蛋白酶缺陷的转基因小鼠模型中增加循环zα1-抗胰蛋白酶水平。
材料和方法
按照lomas等，biochemistry.1993；32:500-8所述，从zz和mmα1-抗胰蛋白酶纯合子的血浆中纯化α1-抗胰蛋白酶。如irving等人，methodsenzymol.2011；501:421-66和haq等人，bioscirep.2013；33(3):e00046中详述的那样表达和纯化重组cys232serα1-抗胰蛋白酶。
“化合物1”是n-[(1s,2r)-1-(3-氟-2-甲基苯基)-1-羟基戊-2-基]-2-氧代-2,3-二氢-1h-吲哚-4-甲酰胺:
dna-编码文库技术(elt)筛选
使用大约10百万化合物的编码文库技术(elt)筛选来鉴定在37和41℃下稳定单体zα1-抗胰蛋白酶的小分子。洗脱最强的结合物，通过其dna标记物鉴定并合成。
基于抗体的zα1-抗胰蛋白酶的聚合的评估
基于抗体的时间分辨荧光共振能量转移(tr-fret)测定用于监测在37℃下与不同浓度的化合物孵育72小时后5nmzα1-抗胰蛋白酶的聚合。该测定使用对α1-抗胰蛋白酶的病理聚合物特异的2c1单克隆抗体(miranda等人，hepatology2010；52:1078–1088)、与所有形式的α1-抗胰蛋白酶结合的多克隆抗体、抗小鼠igg荧光供体(eu-w1024)和抗兔igg受体(apc)。
zα1-抗胰蛋白酶和mα1-抗胰蛋白酶的生化竞争结合测定
化合物1的荧光衍生物通过用alexafluor488标记物经由短的有机连接基团在化合物1的环氮原子上衍生化来制备。
用测定缓冲液将试验化合物在dmso中的系列稀释液稀释25倍，并将2.5μl的该中间稀释液转移到黑色的低体积384孔微量滴定板(greinerbioone；产品号784076)中。使用thermo多点分配器(thermofisher)加入5μl测定缓冲液的预混合溶液，所述测定缓冲液含有2.3nm与抗胰蛋白酶结合的单克隆抗体3cl1、3nm将要与3c11抗体结合的lanthascreen铽标记的抗小鼠igg(invitrogen)、以及2nmz-alat和10nmm-alat之一。将板在室温下孵育30分钟，然后使用thermo多点分配器加入2.5μl配体溶液，其含有40nm(对于zα1-抗胰蛋白酶)或2μm(对于mα1-抗胰蛋白酶)的化合物1的荧光衍生物。
将板密封并在室温下孵育过夜，或在4℃孵育3天，然后在室温下孵育6小时。在不存在竞争性化合物的情况下，能量转移可以发生在铽和alexa488荧光团之间。与化合物1的荧光衍生物竞争的化合物抑制该信号。tr-fret信号在envision平板读数器上通过在337nm激发铽和在520nm和495nm检测发射来读取。
根据cheng-prusoff方程，考虑到所用荧光配体的浓度与在独立荧光偏振和tr-fret实验中测定的其亲和力的关系，从pic50值推导出化合物对z-a1at或m-a1at蛋白的亲和力的解离常数(kd):
kd(化合物)＝10-pic50(化合物)/(1-([配体]/kd(配体))。
化合物缔合(association)试验
α1-抗胰蛋白酶的固有色氨酸荧光在缺口区(breachregion)由trp194支配(tew等人，jmolbiol.2001nov9；313(5):1161-9)，并且可用于监测化合物结合的进展。将血浆m和zα1-抗胰蛋白酶在100μmpbs中稀释至0.2mg/ml，并将化合物1(或等体积的dmso)加入至10μm的浓度。监测荧光(λex＝280nm,λem＝330nm)至少2小时，并计算变化的半衰期。
将停流实验中的动力学数据拟合到具有偏移和线性斜率的指数衰减曲线，以说明背景中的恒定漂移，从而产生观察到的伪一阶速率常数k(obs):
y＝a0·e-k(obs)t+斜率·t+偏移
其中t＝时间，ao＝在t＝0时的振幅。然后当绘制k(obs)值对化合物浓度的曲线时，得到二级结合速率(on-rate)作为斜率。从结合速率和结合试验测定的kd值计算解离速率(off-rate)。
细胞生物学
在6孔板中，用0.5μg/ml强力霉素(oxycycline)和各种浓度的化合物同时处理条件性表达zα1-抗胰蛋白酶的chotet-on细胞(
免疫荧光显微术
将cho-k1细胞与/不与强力霉素一起孵育以表达α1-抗胰蛋白酶，与或不与感兴趣的小分子一起孵育，用pbs中的3.7％v/v甲醛固定15分钟，用pbs中的0.1％v/vtritonx-100渗透，然后用pbs中的10％v/vfbs封闭30分钟。用针对总α1-抗胰蛋白酶的兔多克隆抗体或检测聚合物的2c1单克隆抗体来标记细胞，然后分别使用用texanred缀合的抗兔或fitc标记的抗小鼠二抗。使用axiovert200widefield荧光显微镜(carlzeissmicroimaginginc.,thornwood,ny)对细胞成像。
热稳定性实验
在5x浓度syproorange染料溶液(lifetechnologies)存在下通过热变性研究了丝酶抑制蛋白在加入化合物时的天然状态稳定性。使用悬浮于pbs中的终蛋白浓度为0.1mg/ml和50μm的化合物(nettleship等人，方法smolbiol。2008；426:299-318)。在eppendorphmastercyclerrealplex4定量实时pcr仪上的三个独立实验中，以1℃/分钟的速率将样品从25℃加热到95℃，记录605±15nm箱内的荧光。变性的中点(tm)是荧光强度对温度的一阶导数(firstderivative)达到最大值时的温度。
还使用终点恒温试验测定了对热诱导聚合的抗性。将血浆纯化的m和zα1-抗胰蛋白酶在含有5％v/v甘油的pbs中稀释至0.2mg/ml，与10μm化合物1(或仅与dmso)一起孵育2小时，然后在热循环仪中以20μl等分试样进一步加热4小时，其中在整个板上施加48-65℃梯度。在3-12％w/v丙烯酰胺bis-tris天然-page凝胶上(lifetechnologies)分析样品。
平衡解折叠
bis-ans是一种染料，报道了α1-抗胰蛋白酶的解折叠中间体的出现(dafforn等人，jbiolchem.1999；274:9548-55.)。在微孔板中，将10μl等分试样的0.5mg/ml的m和zα1-抗胰蛋白酶与100μmbis-ans和100μm化合物1(或等体积的dmso)与各种浓度的盐酸胍快速混合，得到pbs中0-6m变性剂的终浓度。一旦获得稳定的信号，记录bis-ans的荧光强度测量(λex＝385nm,λem＝490nm)，并将数值换算成位于0和1.0之间。
快速重折叠
由于无定形聚集、聚合和错折叠造成的材料损失，α1-抗胰蛋白酶的体外重折叠不是完全可逆的。这些贡献不能容易地通过批量光谱法解卷积(deconvolute)，因此通过非变性page评价重折叠。将9.6mg/ml的m和zα1-抗胰蛋白酶在6m尿素和15mm磷酸钠ph8.0中于室温变性4小时，并将1.25μl迅速重折叠到250μlpbs中，所述pbs含有0-50μm化合物1和归一化浓度的5％v/vdmso。在室温下孵育1小时后，通过考马斯染色的3-12％w/v丙烯酰胺bis-tris天然page凝胶(lifetechnologies)分析样品。
晶体学
重组cys232serα1-抗胰蛋白酶的晶体使用悬滴蒸气扩散法生长，通过将1μl的12.1mg/ml蛋白质与1μl贮存缓冲液混合，并用贮存缓冲液平衡，该贮存缓冲液包含0.1mmesph6.0缓冲液以及20-22.25％w/vpeg1500。将在0.1mmesph6.0和22.25％w/vpeg1500中形成的结晶转移到含有0.09mmesph6.0、18％peg1500、13.5％甘油、5％d6dmso和25mm化合物的缓冲液中，在20℃孵育24小时。将晶体在液氮中快速冷冻，并在diamondsynchroni03束线处收集数据。
具体地，用于结晶实验的α1-抗胰蛋白酶蛋白对应于m-at的m1v变体，具有以下修饰：(a)cys232突变为ser(为了易于处理，避免在不同测定期间需要还原剂；取代是保守取代)；(b)信号肽组分(mpssvswgilllaglcclvpvsla)和glu1(在哺乳动物m-atn末端)不存在于所用蛋白质的n末端；(c)所用蛋白质的n-末端具有六组氨酸亲和标记物以便于纯化，并且具有由表达载体提供的几个氨基酸，其序列是mrgshhhhhht。
因此，所用蛋白质的全序列为:
mrgshhhhhhtdpqgdaaqktdtshhdqdhptfnkitpnlaefafslyrqlahqsnstniffspvsiatafamlslgtkadthdeileglnfnlteipeaqihegfqellrtlnqpdsqlqlttgnglflseglklvdkfledvkklyhseaftvnfgdteeakkqindyvekgtqgkivdlvkeldrdtvfalvnyiffkgkwerpfevkdteeedfhvdqvttvkvpmmkrlgmfniqhskklsswvllmkylgnataifflpdegklqhlenelthdiitkflenedrrsaslhlpklsitgtydlksvlgqlgitkvfsngadlsgvteeaplklskavhkavltidekgteaagamfleaipmsippevkfnkpfvflmieqntksplfmgkvvnptqk；
其中下划线部分对应于seqidno:1。
结果
通过编码文库技术筛选、结构指导的药物设计和细胞特性分析(profiling)鉴定化合物1。
zα1-抗胰蛋白酶是构象动力学分子，其在折叠途径后期从近天然构象聚合，因此代表了药物发现的非经典靶标。因此，可以推断发现命中物可以受益于宽的和最小偏差的化学空间的探索。使用编码文库技术(elt)筛选来寻找zα1-抗胰蛋白酶的结合物。使用从zα1-抗胰蛋白酶纯合子的血浆中纯化的糖基化zα1-抗胰蛋白酶，因为这代表了与疾病相关的人病理学药物靶标。elt选择是通过将zα1-抗胰蛋白酶固定在基于抗体的亲和树脂上，用于与dna编码的化合物文库孵育，并通过热变化(thermalshift)实验进行二次筛选来进行的。
从elt筛选中鉴定了单一先导系列的手性羟基-羧酰胺，其在tr-fret免疫测定中在阻断聚合方面显示出功能活性。初始命中的优化遵循基于结构的设计方法，利用来自与α1-抗胰蛋白酶复合的小分子配体的晶体结构的知识。发现中心羟基甲酰胺有助于与zα1-抗胰蛋白酶结合。还发现烷基侧链(在与羧酰胺的n原子相邻的碳原子处)是有益的，特别是丙基侧链。药物化学的发展集中在修饰上，例如在化合物末端的芳族基团。这导致发现化合物1。
化合物1是体外和疾病细胞模型中聚合的有效抑制剂
通过使用荧光标记的衍生物的竞争结合试验测定，化合物1以1.5nm的高亲和力(kd)结合zα1-抗胰蛋白酶；通过微量热泳(thermophoresis)获得了类似的值。该结合显示出选择性，其对血浆纯化的野生型mα1-抗胰蛋白酶具有低至少50倍亲和力。
曲线的形状和天然质谱与单一化合物结合位点一致。没有观察到荧光衍生物与z变体的聚合物结合，表明聚合后结合袋的损失和所得的显著构象选择性。化合物与靶的相互作用速率可以通过内在色氨酸荧光的变化来监测；该性质用于测定化合物1与z(4.1x104m-1s-1)和mα1-抗胰蛋白酶(2.1x102m-1s-1)结合的二级结合速率。从这些值，计算对z(6.1x10-5s-1)和mα1-抗胰蛋白酶(1.6x10-5s-1)的一级解离速率，发现具有相同的数量级。因此，化合物对z的选择性超过mα1-抗胰蛋白酶的选择性受结合速率而不是解离速率的差异支配。
发现化合物1以剂量依赖性方式消除来自血浆的zα1-抗胰蛋白酶的体外聚合，测得pic50为8.3，接近tr-fret测定的紧密结合限。通过将化合物1加入cho-tet-on-z-a1at细胞(
为了证实化合物1在cho-tet-on-z-a1at中的效力和功效是对在具有内源性表达水平的肝细胞中所能预期的合理估计，在具有zzα1-抗胰蛋白酶基因型的来自ipsc的肝细胞中测量了化合物1对zα1-抗胰蛋白酶的分泌和聚合的作用(yusa等人，nature.2011；478:391-4)。化合物1抑制聚合作用并增加分泌，其在ipsc-肝细胞中的效力与cho-tet-on-z-a1at细胞中的类似，pic50和pec50分别为6.4和6.5，并且具有类似的功效，诱导zα1-抗胰蛋白酶分泌水平增加大约3倍。
由于具有α1-抗胰蛋白酶z等位基因的所有个体在其肝脏中都显示出聚合物，但仅有相对小的部分发生临床肝病，因此成人的α1-抗胰蛋白酶肝病很可能是两次攻击过程，由此在肝脏中zα1-抗胰蛋白酶聚合物的产生使肝脏对继发性损伤如酒精、药物或肝脏脂肪敏感。为了研究化合物1保护细胞免于对次级毒素敏感的能力，在暴露于不同浓度的er应激原衣霉素之前，在存在或不存在10μm化合物1的情况下，在cho-tet-on-z-a1at细胞中诱导zα1-抗胰蛋白酶表达。在细胞活力测定中，表达野生型mα1-抗胰蛋白酶的细胞对衣霉素的敏感性低于表达zα1-抗胰蛋白酶的细胞。化合物1完全消除了表达zα1-抗胰蛋白酶的细胞中的聚合物形成，并将表达α1-抗胰蛋白酶的细胞的敏感性恢复至野生型对照细胞的敏感性。
化合物1结合至更经常地被z变体取样的新的隐蔽结合位点
通过将化合物浸泡在apoα1-抗胰蛋白酶的晶体中，产生与化合物1复合的α1-抗胰蛋白酶的高分辨率晶体结构(表1)。
表1数据收集和精修统计
*括号中的值是高分辨壳层(highest-resolutionshell)。
该结构揭示了与化合物的相互作用诱导了在apo结构中不明显的隐蔽结合位点在链5后β-折叠-a的顶部形成。该区域被称为“缺口(breach’)”，因为它是蛋白酶抑制期间反应性中心环首先插入的点(whisstock等人，jmolbiol.2000；295(3):651-65)，并且包括e342kz突变的位点。
图1-3显示了所鉴定的结合位点的代表性图像，图1显示了与化合物1结合的蛋白质的概况(残基342-356是无序的，因此在图示中缺失)。图2提供了包括一些邻近残基的结合位点的更详细的视图，其中氢键以虚线显示。图3是化合物1在蛋白质的结合位点的二维可视化示意图，突出了包含结合位点的一些氨基酸残基以及蛋白质内与化合物1形成显著分子间相互作用(例如氢键)的部分化学结构(以虚线显示)。
更详细地，与化合物1复合的α1-抗胰蛋白酶的结构揭示氧化吲哚基环与trp194的侧链堆叠，而羰基与trp194主链形成氢键(参见图2和图3)，与由结合诱导的内在色氨酸荧光的变化一致。苯环和丙基链占据两个高度疏水的袋。在化合物1的羟基和leu291主链、酰胺氮氢和pro289的主链羰基氧之间，以及酰胺羰基和tyr244羟基之间形成氢键(参见图2和图3)。因此，链5a的残基189至195、290至295和336至342被置换(displacement)，相应地丧失了活性中心环近端铰链的电子密度，trp194侧链旋转～170°，tyr244-羟基移动
因此，具体地，发现化合物1能够在本文别处定义的隐蔽结合位点处结合α1-抗胰蛋白酶。为了完整起见，注意到六组氨酸亲和标记物和由所用蛋白质中的表达载体提供的氨基酸在结合位点的电子密度分布中是不明显的，因此与化合物1的结合无关。类似地，突变的ser232(替代野生型蛋白质中的cys232)不在与化合物结合位点直接相关的位置处。
化合物1通过稳定化β-折叠a而干扰向易于聚合的中间体m*的转变
α1-抗胰蛋白酶的聚合由称为m*的瞬时中间状态发生，其容易由z变体形成。m*的标志之一是其被环境敏感的荧光报告染料识别。利用染料syproorange的热变化测定报告了蛋白质天然状态对热诱导的解折叠的稳定性。在存在和不存在50μm化合物1的情况下使用不同温度梯度进行的一系列实验证明了转变中点温度显著升高；在α1-抗胰蛋白酶中，这表示天然状态稳定，不能转变为m*。相应地，在恒温实验中，当通过非变性page观察时，在化合物存在的情况下在比化合物不存在的情况下更高的温度下产生寡聚体。天然状态稳定性还可通过使用化学变性剂的平衡解折叠来探测，其中bis-ans荧光中的峰对应于最大程度增加的解折叠中间体。测定的曲线显示，对于盐酸胍诱导的解折叠，该点在50μm化合物1存在下在1.8m变性剂时出现，反映了相对于其不存在时(1.2m)天然状态稳定性的增加。
干扰β-折叠a的打开或干扰其与反应性中心环的n-末端部分的相互作用的突变改变丝酶抑制蛋白抑制靶蛋白酶的能力。在针对模型靶蛋白酶-胰凝乳蛋白酶的不连续实验中，测定m和zα1-抗胰蛋白酶的抑制化学计量(si)。两种变体与化合物1的预孵育均导致>98％的蛋白酶抑制活性丧失。通过sds-page对相互作用产物的解析显示反应中心环的完全裂解；因此，这不是反应中心环中的蛋白酶识别位点变得不能被酶接近的结果。这些数据与化合物稳定β-折叠a对抗介导抑制活性和病理错折叠二者的构象变化的机制一致。
为了研究该活性是否与作为化学陪伴分子的作用一致，将m和zα1-抗胰蛋白酶在6m盐酸胍中体外解折叠，并在化合物1存在或不存在下通过快速稀释至无变性剂的缓冲液中而快速重折叠。通过非变性page对产物进行电泳显示z变体在不存在化合物时的阳极迁移——与的m*的错误折叠的副产物一致(ekeowa等人，procnatlacadsciusa。2010；107(40):17146-51)——其在化学计量浓度和更高浓度下校正。
化合物1的药物样性质的表征
为了研究化合物1对于进展到体内研究的适合性和作为用于在人体中测试的临床候选者的潜力，针对一组被认为预测潜在安全倾向(safetyliabilities)的脱靶体外测试中测定化合物1的特性。化合物1对这些靶大多数无活性，活性水平低至接近16个测试中的灵敏度下限。这些边缘活性的测定的效力比化合物1在阻断zα1-抗胰蛋白酶聚合(pec506.3)方面的细胞活性低至少10倍。
抑制活性的丧失代表了一种手段，通过该手段可以评估与其它丝酶抑制蛋白的可能的脱靶结合。然而，与α1-抗胰蛋白酶相比，在与50μm化合物1孵育时，同源物抗凝血酶、神经丝氨酸蛋白酶和抗胰凝乳蛋白酶的抑制活性不受影响。
由于化合物1表现出优于脱靶组和其它丝酶抑制蛋白的优良水平的选择性，因此为了探索体内靶接合，探索了该分子的体外和体内pk性质。化合物1具有3.8的chromlogd(ph7.4)测量值，84.2％的低的与人血清白蛋白的结合，及无定形药物在fassif中良好的溶解度。
化合物1具有适于体内评价该分子的临床前和临床药理学的体外adme性质。渗透性高，且在低温保存的肝细胞中的体外清除率在人和狗中是低的(分别为0.3±0.05和＜0.65ml/min/g)，在小鼠和大鼠中是中等到高的(分别为4.6和7.4±0.7ml/min/kg)。在以10、30或100mg/kg单次po施用后，化合物1在雄性cd-1小鼠血液中的平均暴露量随剂量增加(平均剂量标准化的cmax分别为58±112、113±27和113±27；dnaucinf分别为202±101、294±47和403±246)。
化合物1在α1-抗胰蛋白酶缺陷的转基因小鼠模型中增加zα1-抗胰蛋白酶的分泌
为了研究化合物1在zα1-抗胰蛋白酶缺陷中的治疗潜力，在用随机插入人zα1-抗胰蛋白酶基因而工程化的转基因小鼠模型中测试化合物(teckman等人，amjphysiolgastrointestliverphysiol.2004；286:g851-g62)。为了确定这些研究中化合物1的合适剂量方案，在计算机模拟模型中估计转基因小鼠中的总暴露和未结合暴露。这基于从野生型小鼠观察到的pk参数，并结合了药物的循环高亲和性库，其代表在基线时小鼠血液中平均5μm的总zα1-抗胰蛋白酶(药物亲和性为1.5nm)。基于这种模型，预计每天三次100mg/kg的口服施用方案在施用期持续时间维持游离药物浓度高于测定的zα1-抗胰蛋白酶分泌的ec50(～300nm)。相反，在大多数施用期间，预期每天三次30和10mg/kg施用后化合物1的未结合浓度远低于对分泌的ec50。
为了研究化合物1的pk-pd关系，将100、30或10mg/kg化合物1每天三次施用于zα1-抗胰蛋白酶转基因动物，在第6天，在施用后3小时(～cmax)和8小时(cmin)时收获血液和肝脏，以测量两种组织中的总药物和游离药物。还采集血液用于测量血浆中的单体zα1-抗胰蛋白酶。通过特异性lc-ms/ms试验来测定化合物1的总浓度，并且使用平衡透析来测定两种组织中游离的未结合药物，并用于得到未结合的浓度。游离和总血药浓度与预测一致，并证实了在100mg/kg施用后的大部分施用期间游离药物浓度的cmin水平为300nm或更高，而30mg/kg和10mg/kg剂量导致在大部分施用期间血液中的游离药物水平显著低于细胞ec50浓度。在肝脏中的靶向作用位点，化合物1的游离和总药物浓度均与血液中的浓度相等。
最近的工作已经表明，循环中总zα1-抗胰蛋白酶的显著部分是聚合物构象(tan等人，eurrespirj.2014；43(5):1501-4)。由于没有对单体zα1-抗胰蛋白酶特异的抗体来直接测定其浓度，因此开发了解卷积方法，其基于使用针对总或聚合α1-抗胰蛋白酶的抗体的免疫测定，以及使用纯化的单体和聚合zα1-抗胰蛋白酶的校准曲线。施用6天后测量血浆样品中的单体zα1-抗胰蛋白酶，并将水平用每只动物的施用前对照水平标准化，以抵消动物之间zα1-抗胰蛋白酶的天然变异。100mg/kg化合物1导致循环单体zα1-抗胰蛋白酶水平增加6至7倍，表明在肝脏中的强力的靶结合。30mg/kg和10mg/kg组也在循环zα1-抗胰蛋白酶中产生显著的剂量依赖性增加，尽管对于大部分或全部施用期间，游离浓度低于对分泌而言的细胞ec50。施用3天后的总药物水平和zα1-抗胰蛋白酶的变化与施用6天后的那些是不可区分的。
综合这些结果，证实了化合物1口服施用后在肝脏中的靶结合，并证明了在α1-抗胰蛋白酶缺陷模型中治疗相关的量级可以增加zα1-抗胰蛋白酶的循环水平。较低剂量下循环的zα1-抗胰蛋白酶的增加可能表明，体内达到高于对分泌而言的细胞ec50的持续游离药物水平对于显著增加zα1-抗胰蛋白酶水平可能不是需要的。
由于化合物1阻断细胞中聚合物的形成，因此研究了化合物1的施用对肝聚合物水平的影响。最近已经表明，在cho-tet-on-z-a1at和zz-ipsc-肝细胞中形成的zα1-抗胰蛋白酶聚合物从细胞中清除的t1/2为8-48小时，这取决于它们是分配到可溶性级分还是不溶性级分。由于所述化合物不与zα1-抗胰蛋白酶聚合物结合，因此对总肝脏聚合物水平的作用将取决于肝脏清除已经存在的聚合物的速率和聚合物在未用药物治疗的动物中持续积累的速率。因此，将化合物1如上所述每天三次以100mg/kg施用，持续20天。在施用的第15和21天，如上所述测定单体zα1-抗胰蛋白酶血浆样品的变化，并观察到超过施用前基线水平7-8倍的增加，与施用3或6天的动物中的效果相似，与施用期间持续的靶结合一致。通过用2c1抗-聚合物单克隆抗体染色研究肝聚合物水平，并由病理学家或通过使用算法定量来盲法评分以测量阳性染色的所有区域。通过人工或定量评分，在总肝聚合物载量中没有观察到差异。老年zα1-抗胰蛋白酶小鼠表现出在α1-抗胰蛋白酶缺陷个体的肝脏中未观察到的致密聚合包涵体。
为了研究在实验的时间范围内，在肝脏中是否存在对化合物响应的聚合物亚群，将染色区域分成低、中和高强度区域，并分别对化合物的响应评分。在这些细分的区域中没有观察到化合物的作用。鉴于聚合物形成在体外被化合物1完全阻断，得出结论，需要长期施用以影响zα1-抗胰蛋白酶转基因小鼠中的总聚合物负荷。然而，仍然需要确定：在肝脏中终生产生zα1-抗胰蛋白酶的慢性损伤后，小鼠肝脏是否具有清除zα1-抗胰蛋白酶聚合物的能力，或者实际上是否需要这来引发对肝功能障碍的继发性触发的敏感性的益处。
讨论
与α1-抗胰蛋白酶的共晶体结构提供了对化合物1抑制zα1-抗胰蛋白酶聚合的作用模式的了解。虽然导致病理性肝聚合物形成的机制尚未确立，但该方法中反应性中心环的专性和中心作用已被充分接受(参见(a)lomas等人，nature.1992；357:605-7；(b)ekeowa等人，procnatlacadsciusa.2010；107(40):17146-5；和(c)yamasaki等人，emborep.2011；12(10):1011-7)。所有现存的模型都是基于在a-折叠的链3和5之间插入来自反应性中心环的额外β-链，这是由于z突变对该结构元件的去稳定作用所促进的。α1-抗胰蛋白酶和化合物1的共晶体结构表明，所述化合物可以改善e342kz-突变的作用，原因在于：(i)在缺口区域中的疏水填充的优化；(ii)与掩埋的极性原子形成氢键；以及(iii)将链5a顶部的主链置换成与部分的环插入不太相容的构型，这被认为是环片聚合中的早期步骤(gooptu等人，procnatlacadsci(usa).2000；97(1):67-72.)和c-末端聚合中的专性步骤(yamasaki等人，emborep.2011；12(10):1011-7)。明显在链5a顶部的置换与z变体的结合速率驱动的偏好一致，其使该区域相对于野生型蛋白质不稳定。在晶体结构中，342位的侧链朝向溶剂取向，并且不直接与化合物1的相互作用；因此，驱动化合物偏好的关键参数很可能是隐藏袋增加的可用性。一旦形成隐藏袋，其在两种变体中似乎结构上等同，如通过类似的解离速率所反映的。这种作用模式也与缺乏与聚合物的结合是相容的，其中反应性中心环的部分或完全插入完成了封闭化合物结合位点的β-发夹转角。
当化合物1在缺口区域内结合时，显著稳定了α1-抗胰蛋白酶天然状态，这对抗与m*中间体形成有关的构象变化。这反过来防止了聚合物的形成。这种一般机制的先例可以在对α1-抗胰蛋白酶发挥类似作用的工具单克隆抗体中发现(
在下呼吸道缺乏丝酶抑制蛋白活性，导致通过局部释放的中性粒细胞弹性蛋白酶消化肺实质，这有助于在α1-抗胰蛋白酶缺陷的个体中观察到肺气肿，因为完全缺乏α1-抗胰蛋白酶的罕见患者出现泛小叶的肺气肿(fregonese等人，respirmed.2008；102(6):876-84.)，且α1-抗胰蛋白酶替代疗法已经证明对疾病进展有一些益处(chapman等人，lancet.2015；386(9991):360-8.)。化合物1通过校正折叠缺陷增加zα1-抗胰蛋白酶分泌，并在α1-抗胰蛋白酶缺陷的转基因小鼠模型中将丝酶抑制蛋白的血浆浓度增加至8倍。
由于化合物1在与蛋白质结合的同时抑制α1-抗胰蛋白酶的丝酶抑制蛋白活性，所以在施用期间不能预期显著增加丝酶抑制蛋白活性，事实上化合物1将抑制患者中残余α1-抗胰蛋白酶的丝酶抑制蛋白活性，并且预期阻断替代疗法的活性(如果这与化合物1共同施用)。然而，单体zα1-抗胰蛋白酶在人中的半衰期被认为是约3-5天，而预期药物将在施用后被清除的t1/2是数小时，这提高了脉冲施用方案将导致增加的活性丝氨酸蛋白酶的可能性。需要暴露于药物多长时间以显著提高水平、消耗肺中的炎性聚合物以及剂量之间的间歇期(以保持丝酶抑制蛋白活性)的定义需要进一步研究。类似地，需要评估在施用期间阻断残余丝酶抑制蛋白活性的风险-益处；然而，在几十年来α1-抗胰蛋白酶缺陷的个体中，肺病的缓慢发展提示与丝酶抑制蛋白活性的抑制相关的急性效应是不可能的。在具有两个正常α1-抗胰蛋白酶等位基因的copd患者的肺中已经鉴定了α1-抗胰蛋白酶聚合物，这表明α1-抗胰蛋白酶聚合物可能是copd中炎症的普遍特征，而不依赖于α1-抗胰蛋白酶基因型(bazzan等人，chest,.2018；154:607-16)。
化合物1阻断无细胞培养基中和细胞er中的zα1-抗胰蛋白酶聚合，新形成的聚合物通过分泌、蛋白酶体降解或自噬被细胞清除，半衰期为8-48小时。然而，在zα1-抗胰蛋白酶转基因小鼠中化合物1施用20天后，在肝脏中没有观察到zα1-抗胰蛋白酶聚合物的减少，尽管在整个实验中维持了施用3天内循环水平的7倍增加(表明强有力的靶接合)。对此可能的解释是，在转基因小鼠肝脏中积聚的聚合物不像在模型系统如cho细胞和ipsc肝细胞中几天内产生的那些那样容易清除。虽然这很可能是由慢性损伤引起的，但其分子或细胞机制不清楚，但细胞老化和衰老可能是这种作用的促成因素。先前用自噬激活剂卡巴马平(carbamazapine)的研究已经证实施用2周后对zα1-抗胰蛋白酶转基因小鼠中的肝聚合物有显著作用，表明在zα1-抗胰蛋白酶聚合物积累的慢性损伤后肝确实保留清除聚合物的能力(hidvegi等人，science。2010；329:229-32)。相反，抑制zα1-抗胰蛋白酶表达和聚合物形成的rnai方法已报道在12-33周治疗后转基因小鼠肝脏中zα1-抗胰蛋白酶减少，尽管没有较早时间点的数据报道(guo等人，jclininvest2014；124(1):251-61)。这些数据一起表明，肝脏在慢性损伤后保持清除聚合物的能力，并且很可能需要将化合物1施用于转基因zα1-抗胰蛋白酶小鼠显著长于20天，以证明对总肝脏聚合物水平的作用。仍然需要看，积聚的聚合物是否实际上对细胞有毒性，并且需要从肝脏中清除以获得一些功能益处，或者积聚的聚合物内含物是否实际上是惰性的，且切断聚合物的生产是否足以恢复er的功能和细胞的健康(
通过计算机pk模型很好地预测了在转基因zα1-抗胰蛋白酶小鼠中观察到的化合物1的稳态总水平和游离化合物水平，所述模型建立于体外代谢清除数据和血浆蛋白结合数据、来自野生型小鼠的体内pk数据和包含5μm的药物循环库的术语(亲和力为1.5nm)，代表血液中的zα1-抗胰蛋白酶。根据体外分泌试验中观察到的效力选择目标游离药物浓度，其中试验中总药物接近游离药物。然而，考虑到在施用期间全身性游离药物水平对于10和30mg/kg剂量分别为ec10-ec20和ec20-ec30，在较低剂量的化合物1下循环中zα1-抗胰蛋白酶的增加是令人惊讶的。其原因尚不清楚，然而体内的靶结合大于由体外细胞测定中的效力的预测是可能的。或者，有可能药物在吸收后立即到达肝脏的首过效应提供了超过由模拟稳态水平的化合物浓度所预测的功效。这些数据一起表明了所需化合物暴露的潜在优势以在临床中提供功效。
治疗构象性疾病的新机制
本发明的化合物被认为通过在β-折叠a的链5的头部结合从而消除z突变的局部效应来稳定单体zα1-抗胰蛋白酶(lomas等人，biochemistry。1993；32:500-8)。特别地，它们将链5向链3转移，并因此'纠正'由位置342处的赖氨酸残基诱导的局部扰动。在α1-抗胰蛋白酶的先前晶体结构中尚未鉴定化合物1的结合位点(elliott等人，proteinscience。2000；9:1274-81)。然而，它们对阻断完全折叠的zα1-抗胰蛋白酶向聚合中间体转变的作用，以及它们在疾病的细胞和动物模型中的功效，表明它们作用于近天然或天然构象zα1-抗胰蛋白酶。这意味着聚合物从近天然或天然构象形成，而不是从更加延伸的中间体形成，并且意味着所述小分子阻止单体连接以形成聚合物。z突变的这种小分子校正提供了治疗具有α1-抗胰蛋白酶缺陷的个体中的肝病的新策略。
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