1.本发明涉及肽用于抑制多种疾病生物标志物的功能和表达的新用途，更具体地，涉及用于治疗或预防炎症、代谢性疾病或纤维化疾病的药物组合物，所述组合物包含由选自以下组中的任一氨基酸序列所示的肽作为活性成分：seqidno:1至seqidno:8，并且具有抑制hdac5蛋白磷酸化、抑制gdf15蛋白表达和/或抑制atf3蛋白表达的功能，其中对于hdac5、gdf15和atf3，其为炎性和代谢疾病生物标志物。
背景技术：
：：2.包括肥胖和2型糖尿病在内的代谢性疾病的发病率不仅在韩国，而且在全世界都在迅速增加，并且已知这些代谢性疾病与慢性炎症反应相关(nature,2017,542,177)。这种现象已在全身以及各个组织中观察到。特别是，肥胖表现出慢性低水平的炎症，这是由脂肪组织中炎性细胞的积累和变化引起和调节的。慢性脂肪组织炎症引起脂肪细胞的胰岛素抵抗，抑制脂肪组织积累过剩能量的能力。3.另外，酒精性脂肪肝在韩国很常见，是由饮酒促进肝脏脂肪合成导致的能量代谢异常引起的，并且根据饮酒水平可发展为肝炎或肝硬化。非酒精性脂肪性肝病(nafld)与饮酒无关，是由肥胖、糖尿病和脂质代谢异常引起的体内尤其是肝细胞中脂肪(大于5％)堆积引起的疾病，并且是指广泛的疾病，包括单纯的脂肪积累、脂肪变性、显示肝细胞炎症的非酒精性脂肪肝炎(nash)、晚期纤维化和肝硬化。4.目前对酒精性或非酒精性脂肪肝患者的治疗分为两类。第一类，通过校正危险因素来治疗和改善脂肪肝的药物包括肥胖症药物(奥利司他(orlistat))、胰岛素抵抗药物(二甲双胍(metformin)、吡格列酮(pioglitazone)、罗格列酮(rosiglitazone))、高脂血症药物(氯贝特(clofibrate)、吉非罗齐(gemfibrozil)、苯扎贝特(bezafibrate)、阿托伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin))等。第二类，用于恢复已经受损的肝细胞和肝功能的药物，不依赖于脂肪肝的危险因素的校正，包括肝细胞保护剂(熊去氧胆酸(ursodeoxycholicacid)和牛磺酸(taurine))、抗氧化剂(维生素e)和营养支持剂(凝集素(lectin)、甜菜碱(betaine)、n‑乙酰半胱氨酸(n‑acetylcysteine))等，但是其治疗效果不令人满意。5.与此同时，真核生物的染色体dna包裹在称为“组蛋白”的中心蛋白质周围，然后凝缩成称为“核小体(nucleosome)”的基本结构。另外，许多核小体聚集形成染色质结构。这种染色质结构的构成与组蛋白翻译后修饰密切相关，已知的翻译后修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素蛋白化等。其中，组蛋白的乙酰化与脱乙酰化之间的平衡在基因表达中起着非常重要的作用，组蛋白的乙酰化受到组蛋白乙酰化酶(hat)和组蛋白脱乙酰酶(hdac)的可逆调控。当hdac被抑制时，组蛋白的乙酰化被hat促进，基因从组蛋白中释放出来，并且基因开始表达。已知hdac参与各种生物过程，诸如免疫反应、细胞周期、分化和死亡。其中，hdac5属于第ii类hdac(hdac4‑7、9、10)，第ii类hdac具有组织选择性，并通过使细胞内信号传导蛋白p53、nf‑κb、p65、c‑jun转录因子和jak/stat的基因脱乙酰化来调节转录，这些细胞内信号传导蛋白是参与产生各种炎性细胞因子的重要介质(gene.2005；363:15‑23)。6.hdac5通常与炎性细胞因子基因的核小体结合，但当暴露于炎性因子诸如脂多糖和tnf‑α时，hdac5被磷酸化，然后与蛋白伴侣14‑3‑3结合。这些结合产物从细胞核转移到细胞质。随后，随着组蛋白乙酰化，dna结构被释放，介质(mediators)诸如nf‑kb与炎症诱导细胞因子的基因结合，结果是基因开始表达。因此，当hdca5的磷酸化被抑制，使得hdca5能够存在于细胞核中时，炎性细胞因子不能表达，因此不会发生炎症反应。7.已经开发了hdac抑制剂，包括丁酸，其具有使细胞周期停滞、以及使转化细胞(transformedcells)的正常化(normalization)和分化的功能(j.biol.chem.,1979,254,1716‑1723)、tricostatina，其为具有细胞周期停滞和形态分化(morphologicaldifferentiation)功能的微生物的代谢产物cancerres.,1987,47,3688‑3691,exp.cellres.,1988,177,122‑131,j.biol.chem.,1990,265,17174‑17179)、曲霉毒素(trapoxin),其为对细胞增殖有抑制作用的微生物的代谢产物(j.antibiotics,1990,43,1524‑1534,j.biol.chem.,1993,268,22429‑22435)等。已经开发了抗癌剂，诸如伏立诺他(vorinostat，saha)、罗米司汀(romidepsin，fk228)和帕诺司他(panobinostat，lbh‑589)。然而，这些基于低分子量合成物质的hdac抑制剂不可逆地结合到hdac的活性位点，并完全抑制酶的活性，从而导致意想不到的副作用。因此，目前急需比常规基于低分子量合成物质的hdac抑制剂具有更少副作用并且机理与其不同的hdac抑制剂。8.atf3(激活转录因子3)蛋白是哺乳动物激活转录因子/转录因子的camp应答元件结合(creb)蛋白的组分。已知atf3基因由参与癌症发展的各种因子产生的各种信号表达，并参与细胞内应激反应的复杂过程。9.atf3蛋白作为已知靶基因的激活剂或阻遏物，迄今为止文献中已知的atf3的潜在靶基因有20多个，atf3的已知潜在靶基因包括adipor1、adipor2、bnip3、cdc25a、ccl2、ccl4、细胞周期蛋白d1(cyclind1)、fn‑1、glut4、hif‑2α、ifn‑γ、il‑1β、twist1、p53、p73、pdx‑1、脂联素(adiponectin)等。10.另外，在包括成纤维细胞和上皮细胞以及在诸如巨噬细胞、肥大细胞、t细胞和树突细胞等的免疫细胞在内的大多数细胞中，各种途径诸如nf‑κb、jnkerk、p38和pkc诱导atf3，并且诱导的atf3通过调节各种基因的转录参与凋亡、细胞增殖、细胞迁移以及dna修复和代谢。其中，已知其与诱导nf‑κb相关的炎症反应相关联。atf3蛋白的表达也被认为是由代谢异常诸如糖尿病和肥胖症引起的非酒精性肝病的生物标志物(kim等人，ournalofhepatology2017vol.67,349‑359)。11.因此，由atf3诱导的炎症反应可被调节atf3蛋白表达或功能的物质抑制，但迄今为止还没有开发出atf3蛋白的抑制剂。12.gdf15(生长分化因子15)是属于转化生长因子β(tgf‑β)超家族的蛋白质。这也称为“巨噬细胞抑制性细胞因子1”、“胎盘tgf‑β前列腺衍生因子(pdf)”和“非甾体抗炎药‑激活基因”。已知gdf15蛋白在nafld患者的肝脏中强烈表达。随着纤维化的积极进展，肝组织中gdf15蛋白的表达水平升高。已发现用重组人gdf15(rhgdf15)治疗人肝星状细胞(humanhepaticstellatecells)可增加与肝硬化相关的蛋白质(smad2、smad3)的表达(koo等人，liverinternational.2018；38:695‑705)。因此，gdf15蛋白的作用使得nafld发展成肝硬化，并且也作为一种生物标志物。可以开发能够抑制gdf15表达的物质来减缓nafld的进展，但迄今为止还没有开发出gdf15蛋白的抑制剂。13.相应地，本发明人发现，本发明人先前开发的肽具有抑制hdac磷酸化、抑制作为肝病标志物的atf3和gdf15表达的作用，从而抑制各种炎性细胞因子产生，并且发现向关节炎动物模型、结肠炎动物模型和脂肪肝动物模型施用所述肽可对相应的疾病发挥治疗作用。基于这一结果，完成了本发明。技术实现要素：14.因此，鉴于上述问题而做出了本发明，并且本发明的目的是提供肽用于抑制多种疾病生物标志物的功能和表达的新用途。15.根据本发明的一个方面，上述以及其它目的可通过提供用于治疗或预防炎性、代谢性或纤维化疾病的药物组合物来实现，所述药物组合物包含由选自以下组中的任一氨基酸序列所示的肽作为活性成分：seqidno:1至seqidno:8。16.根据另一方面，提供了所述肽用于治疗炎性疾病、代谢性疾病或纤维化疾病的用途。17.根据另一方面，提供了所述组合物在制备用于炎性疾病、代谢性疾病或纤维化疾病的药物方面的用途。18.根据另一方面，提供了用于预防和/或治疗炎性疾病、代谢性疾病或纤维化疾病的方法，包括向有需要的受试者施用所述肽。附图说明19.图1a显示的是磷酸化蛋白质的微阵列的结果。20.图1b显示的是检测磷酸化的hdac5蛋白的表达水平的蛋白质印迹的结果，所述表达水平取决于seqidnos:1至3的肽的浓度变化。21.图1c显示的是将seqidno:1至3的肽与阳性对照组lmk和saha对hdac5蛋白磷酸化的抑制作用进行比较的蛋白质印迹的结果。22.图2a显示的是在向关节炎诱导的动物模型施用seqidno:1和依那西普时的后爪肿胀(％)。23.图2b显示的是在向关节炎诱导的动物模型施用seqidno:1和依那西普时的后爪肿胀抑制(％)。24.图3a是施用了seqidno:1和依那西普的关节炎诱导的动物模型的三维微ct图像(three‑dimensionalmicro‑ctimage)。25.图3b显示的是施用了seqidno:1和依那西普的关节炎诱导动物模型中的骨体积(bv)、骨体积/组织体积(bv/tv)、针对bv调整的骨表面积(bs/bv)和骨小梁(trabecular)厚度(tb.th)的分析结果。26.图4a是在向关节炎诱导的动物模型施用seqidno:1和依那西普后的关节组织的显微图像。27.图4b显示的是在向关节炎诱导的动物模型施用seqidno:1和依那西普后的炎症指数。28.图5显示的是在向关节炎诱导的动物模型施用seqidno:1和依那西普后的血液中的tnf‑α和il‑6的浓度。29.图6a显示的是在向结肠炎诱导的动物模型施用seqidno:1后8天取出的大肠的目视观察的结果。30.图6b显示的是在向结肠炎诱导的动物模型施用seqidno:1时大肠长度的变化。31.图6c显示的是向结肠炎诱导的动物模型施用seqidno:1时p40、tnf‑α和il‑12的每一种的表达情况的elisa检测结果。32.图7显示的是用于检测在用seqidno:1至4的肽治疗时，作为肝病标志物的gdf15和atf3蛋白的表达水平变化的蛋白质印迹的结果。33.图8是在向脂肪肝诱导的动物模型施用seqidno:1时，降低肝脏肥大和皮下脂肪的效果的图像。34.图9a显示的是向dss诱导的炎性肠病动物模型施用seqidnos:1至4后10天，大肠长度的变化。35.图9b显示的是向dss诱导的炎性肠病动物模型施用seqidnos:1至4的10天后，大肠绒毛的h&e染色观察结果。36.图10a显示的是向非酒精性脂肪性肝炎动物模型施用seqidnos:1至6时，降低肝组织中炎症和脂肪的效果的h&e染色观察结果。37.图10b显示的是向非酒精性脂肪性肝炎动物模型施用seqidnos:1‑6时，降低肝组织中纤维化的效果的天狼星红(siriusred)染色观察结果。38.图10c显示的是向非酒精性脂肪性肝炎动物模型施用seqidnos:1‑6时，降低肝组织中纤维化的效果的masson三色(massontrichrome)染色观察结果。39.图10d显示的是向非酒精性脂肪性肝炎动物模型施用seqidnos:1‑6时，各组的nas分数(nasscores)。具体实施方式40.除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所理解的相同的含义。一般来说，本文使用的术语在本领域是公知的，并且是通常使用的。41.本发明基于以下发现：由seqidno:1至8的任一个的氨基酸序列表示的肽抑制hdac5的磷酸化，并降低gdf15和atf3蛋白的表达，hdac5、gdf15和atf3是炎症、代谢性或纤维化疾病的生物标志物，从而减少炎性细胞因子的产生，并因此可以表现出减少由肥胖引起的关节炎(arthritis)、牙周炎(periodontitis)、遗传性过敏(atopy)、炎性结肠炎(inflammatorycolitis)、糖尿病(diabetes)以及非酒精性肝病(non‑alcoholicliverdiseases)、脂肪肝(fattyliver)和皮下脂肪(subcutaneousfat)的作用。42.因此，一方面，本发明涉及用于治疗或预防炎性、代谢性或纤维化疾病的药物组合物，其包含由选自以下组中的任一氨基酸序列表示的肽作为活性成分：seqidno:1至seqidno:8。43.另外，在另一方面，本发明涉及所述肽用于治疗炎性疾病、代谢性疾病或纤维化疾病的用途。44.另一方面，本发明涉及所述肽在制备用于炎性疾病、代谢性疾病或纤维化疾病的药物方面的用途。45.另一方面，本发明涉及一种用于预防和/或治疗炎性疾病、代谢性疾病或纤维化疾病的方法，包括向有需要的受试者施用所述肽。46.seqidno:1gkcstrgrkccrrkk47.seqidno:2(m1)gkcstrgrkcmrrkk48.seqidno:3(m2)gkcstrgrkmcrrkk49.seqidno:4(m3)gkcstrgrkmmrrkk50.seqidno:5(m4)gkmstrgrkccrrkk51.seqidno:6(m5)gkmstrgrkmcrrkk52.seqidno:7(m6)gkmstrgrkcmrrkk53.seqidno:8(m7)gkmstrgrkmmrrkk54.在本发明中，所述肽可以由选自seqidno:1至8组成的组中的任一种氨基酸序列表示，并且可以与所述氨基酸序列具有60％或更高、70％或更高、80％或更高、90％或更高或95％或更高的同源性。对本领域技术人员来说显而易见的是，选自seqidno:1至8组成的组任一氨基酸序列可以被适当地取代以实现本发明的目的；例如，seqidnos:1至8的肽的氨基酸序列中的一些氨基酸(例如，1至6个氨基酸)可以被其它氨基酸取代，或者seqidno:1至8的肽的氨基酸序列中的一些氨基酸(例如，1至6个氨基酸)可以被添加或删除，只要在不影响所述肽的所需结构或功能的情况下赋予对肽稳定性的有利作用即可。55.在本发明中，炎性、代谢性或纤维化疾病可以是由hdac5蛋白的过度磷酸化、gdf15蛋白的过表达和/或atf3蛋白的过表达直接/间接在体内引起的疾病，并且所述肽可以抑制hdac5蛋白的磷酸化、gdf15蛋白的表达和/或atf3蛋白的表达。56.在本发明中，炎性、代谢性或纤维化疾病可以包括选自关节炎(arthritis)、炎性结肠炎(inflammatorycolitis)、溃疡性肠炎(ulcerativeenteritis)、克罗恩病(crohn'sdisease)、肝炎(hepatitis)、脂肪肝(fattyliver)和肥胖症(obesity)中的至少一种，但不限于此。另外，所述肽可以用于治疗和预防与hdac5蛋白的磷酸化、gdf15蛋白的过表达和/或atf3蛋白的过表达相关的所有炎症、代谢性或纤维化疾病。57.在本发明中，肝炎可以是由糖尿病和/或肥胖引起的非酒精性脂肪性肝炎。58.在本发明中，纤维化疾病包括选自由纤维化引起的肝硬化(cirrhosis)、肺纤维化(pulmonaryfibrosis)、阻塞性肺病(obstructivepulmonarydisease)、心力衰竭(heartfailure)、动脉粥样硬化(arteriosclerosis)、慢性肾衰竭(chronickidneyfailure)、糖尿病(diabetes)和术后后遗症引起的瘢痕疙瘩(keloids)中的至少一种，但不限于此。在本发明中，过度磷酸化指的是与未患该疾病的受试者相比蛋白质磷酸化增加的状况，而过表达指的是与未患该疾病的受试者相比蛋白质的表达增加的状况。59.除了肽以外，本发明的药物组合物还可以包含至少一种药学上可接受的载体(carrier)。药学上可接受的载体可以是盐水、无菌水、林格氏(ringer's)溶液、缓冲盐水、葡萄糖(dextrose)溶液、麦芽糖糊精(maltodextrin)溶液、甘油、乙醇以及这些组分中的一种或多种的组合。如果需要，可以加入其它常规添加剂，诸如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。另外，可以进一步添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂来制备可注射制剂，诸如水溶液、悬浮液和乳液，以及丸剂、胶囊、颗粒或片剂。60.因此，本发明的组合物可以被制备成选自注射剂(injections)、口服制剂(formulationsfororaladministration)、贴剂(patches)、溶液(solutions)、胶囊(capsules)、颗粒剂(granules)、片剂(tablets)、粉剂(powders)、喷雾剂(sprays)、软膏剂(ointments)、凝胶剂(gels)、粘膜制剂(mucosalformulations)和栓剂(suppositories)中的任一种制剂，但不限于此。这些制剂可以通过本领域中用于配制的常规方法制备，或者通过雷明顿制药科学(remington'spharmaceuticalscience)(最新版),麦克出版公司，伊斯顿宾夕法尼亚州(mackpublishingcompany,eastonpa)中公开的方法制备，并且可以根据每种疾病或组分制备成各种制剂。61.治疗性药物组合物可以被配制以使其额外包含药学上可接受的佐剂(adjuvant)，并且药学上可接受的佐剂可以包括选自赋形剂(excipients)、稀释剂(diluents)、缓冲剂(buffers)、抗微生物防腐剂(antimicrobialpreservatives)、表面活性剂(surfactants)、抗氧化剂(antioxidants)、增稠剂(thickeners)和粘度调节剂(viscositymodifiers)中的至少一种，但不限于此。62.本发明的组合物可以根据需要的方法口服或肠胃外施用(例如，静脉内、皮下、腹膜内或局部施用)，并且剂量可以根据患者的体重、年龄、性别、健康状况、饮食、施用时间、施用方法、排泄率和疾病严重程度而变化。当本发明的seqidnos:1至8的肽用于治疗炎性疾病、代谢性疾病、自身免疫性疾病和/或纤维化疾病时，seqidno:1至8的肽的日剂量为约1至约100mg/kg，优选5至50mg/kg，并且可以每日施用一次或每周施用2至3次，但不限于此。63.在这种情况下，施用方案和剂量根据个体患者的年龄、体重和反应而变化。考虑到这些因素，本领域技术人员可以容易地选择合适的方案和剂量。64.实施例65.在下文中，将参照实施例更详细地描述本发明。然而，对于本领域技术人员来说，这些实施例显然仅被提供用于阐释本发明，而不应被解释为限制本发明的范围。66.实施例1肽的合成67.seqidno:1至8的肽按照从n末端开始的顺序使用f‑moc固相肽合成法来合成。从树脂上切下合成的肽序列，洗涤，冻干，然后通过液相色谱分离和纯化。纯化的肽的分子量用maldi‑tof分析来测定。68.seqidno:1gkcstrgrkccrrkk69.seqidno:2(m1)gkcstrgrkcmrrkk70.seqidno:3(m2)gkcstrgrkmcrrkk71.seqidno:4(m3)gkcstrgrkmmrrkk72.seqidno:5(m4)gkmstrgrkccrrkk73.seqidno:6(m5)gkmstrgrkmcrrkk74.seqidno:7(m6)gkmstrgrkcmrrkk75.seqidno:8(m7)gkmstrgrkmmrrkk76.试验例1：合成肽的hdac5磷酸化抑制和结合亲和力的测定结果77.将raw264.7细胞在0.5％fbs中饥饿处理2小时，并用200μm的seqidno:1的肽处理1小时，然后用lps(1μg/ml)在37℃下诱导炎症30分钟。未处理的细胞(nt)、用lps处理的细胞以及用seqidno:1和lps处理的细胞的细胞裂解物施加到来自fullmoonbiosystems的磷探针抗体微阵列。磷微阵列能够识别与30种信号传导系统相关的1318种抗体。用每种抗体包被标准尺寸的包被玻璃显微镜载玻片。＝用genepix4100a扫描仪(axoninstrument,fostercity,ca,usa)对其扫描。数据用genowiz4.0tm(ocimumbiosolutions,hyderabad,india)进行分析。磷酸化比率计算如下。78.计算每种抗体的磷酸化比率的公式：79.磷酸化比率＝(实验组的磷酸化值/实验组的非磷酸化值)/(对照组的磷酸化值/对照组的非磷酸化值)80.分析后，使用uniport数据库搜索每种蛋白质的信息。结果显示，与仅用lps处理的细胞相比，在用seqidno:1的肽和lps处理的情况下，hdac5的磷酸化被抑制得最多(0.278)，并且与nf‑κb信号相关的蛋白质诸如nf‑κbp100/p52(0.451)、nf‑κbp105/p50(0.485)和iκbα(0.509)的磷酸化被抑制(图1a)。81.基于微阵列的结果，使用蛋白质印迹检测seqidnos:1至3的肽对hdac5和p65的磷酸化的改变。将raw264.7细胞以70％的密度铺在6孔板上。16小时后，将细胞用含0.5％fbs的dmem培养基饥饿处理2小时。用含有浓度为50至1000μm的seqidno:1至3的每种肽的培养基处理细胞，持续1小时，然后用浓度为1μg/ml的lps处理，以诱导炎性反应，持续30分钟。使用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的ripa裂解缓冲液(25mmtrishclph7.6,150mmnacl,1％np‑40,1％脱氧胆酸钠(sodiumdeoxycholate)，0.1％sds)裂解蛋白质。通过bca蛋白测定法来测定蛋白质，通过蛋白质印迹法来检测hdac5和p65蛋白的表达水平。蛋白质印迹是通过将每个样品与等量的大小标志物一起装载在8％的sdspage凝胶上，然后电泳约2小时并转移到硝酸纤维素膜上来进行的。转移的膜用5％脱脂乳封闭1小时，并以1:1000的比例与一抗反应过夜。然后，用含有0.1％tween‑20的tbst洗涤膜，并与附接有辣根过氧化物酶的二抗反应1小时，然后用ecl底物检测化学发光。82.结果显示，当单独用lps处理时，hdac5的磷酸化增加，但当用lps和seqidno:1至3的肽组合处理时，hdac5的磷酸化降低。这表明seqidno:1至3的肽具有通过hdac5抑制信号传导的作用。83.另外，对于seqidno:1至3的每一种肽以及先前已知的hdac磷酸化抑制剂saha和lmk，通过蛋白质印迹法来检测磷酸化的hdac5蛋白和hdac5蛋白的磷酸化程度。结果表明，seqidno:1至3的肽表现出比saha和lmk更好的hdac5磷酸化抑制。84.同时，使用biacoret200(biacoreab,uppsala,sweden)来检测hdac5与seqidnos:1至8的肽之间的结合亲和力。为此，将hdac5蛋白(abcam,ma,usa)溶解在乙酸钠缓冲液(ph4.5)中，并使用n‑羟基琥珀酰亚胺(nhs)和n‑乙基‑n0‑(3‑二甲基氨基丙基)‑碳二亚胺盐酸盐(edac)作为交联剂将其结合到葡聚糖覆盖的传感器芯片表面(cm5芯片)。葡聚糖的未反应的活性基团通过向其中加入乙醇胺(1m)来封闭。结合到芯片上的hdac5的数量测量为4440ru(1000ru＝1ng/mm2)。seqidno:1至8的肽在不同浓度(15.625nm、31.25nm、62.5nm、125nm、250nm、500nm)下以30μl/分钟的速率反应，解离反应保持5分钟。使用biaevaluation软件和1:1结合模型计算缔合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)以及解离常数(kd)。85.下表1显示了使用biacore进行分析的结果，表明了seqidno:1至8的肽与hdac5蛋白之间的结合亲和力。相比于非匹配肽，seqidno:1至8的肽的kd值约为10‑7，非匹配肽为10‑4。随着kd值降低，结合亲和力增加。因此，可以预测seqidnos:1至8的肽对hdac5蛋白具有优异的结合力，并在结合hdac5蛋白的同时减少磷酸化。86.表187.分析物ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)seqidno:11.075e+50.072646.756e‑7seqidno:2(m1)7.437e+40.068729.241e‑7seqidno:3(m2)8.213e+40.059537.248e‑7seqidno:4(m3)7.223e+40.067889.399e‑7seqidno:5(m4)6.592e+40.030884.685e‑7seqidno:6(m5)1.004e+50.044634.443e‑7seqidno:7(m6)6.754e+40.047577.043e‑7seqidno:8(m7)5.501e+40.0047768.682e‑8非匹配肽2.168e+31.8478.521e‑488.试验例2合成肽对关节炎的疗效的测定结果89.为了确定根据本发明的肽在体内治疗类风湿性关节炎是否有效，在胶原诱导的关节炎动物模型中检测了其治疗关节炎的作用。为此，从harlan公司.(indianapolis,in,usa)购买雌性wistar大鼠(105‑135g,n＝67)。所有大鼠在无病原体的环境中饲养，并使用无菌标准大鼠饲料(harlan公司,usa)和水自由喂养大鼠。动物实验是在首尔国立大学(seoulnationaluniversity)机构动物护理和使用委员会(iacuc)的批准下进行的。胶原诱发的关节炎是以已知的方式(nishikawa等人，arthritisandrheumatism.2003；48:2670‑81)诱发的。90.具体而言，将500μg牛ii型胶原与0.5ml的0.1m乙酸和0.5ml的弗氏不完全佐剂的混合物一起注射到大鼠肌肉中。在第7天，将0.5ml的0.1m乙酸和0.5ml的弗氏不完全佐剂与250μg牛ii型胶原一起进一步接种，以产生胶原诱导性关节炎(cia)大鼠。将大鼠分为cia诱导的组(n＝10)，注射有低浓度的seqidno:1的肽的cia诱导的组(ldaip,15mg/kg,n＝10)、注射有高浓度的seqidno:1的肽的组(hdaip,30mg/kg,n＝10)、注射有依那西普(enbrel)的cia诱导的组(10mg/kg,n＝10)和正常组(n＝6)。从第一次胶原蛋白注射后28天起，将seqidno:1的肽每周两次皮下注射到颈部后部，持续4周。依那西普每周腹膜内注射三次，持续4周。在第22天、第29天、第31天、第35天、第38天、第42天、第45天、第49天、第52和第56天，使用体积测量仪(le7500n,iwooscientificcorporation,korea)测量两个后爪的肿胀度。在校准至3ml的重量后使用体积测定仪。测量区域通过画线标出，测量在脚踝附近进行。使用以下等式计算后爪肿胀度增加(％)和后爪肿胀度抑制(％)。91.后爪肿胀度增加(％)＝(加强注射后的肿胀度–初始注射前的肿胀度)/初始注射前的肿胀度×10092.后爪肿胀度抑制(％)＝(cia对照组的平均肿胀度增加–测试组的平均肿胀度增加)/cia对照组的平均肿胀度增加×10093.对于后爪肿胀度(％)的测量结果显示，与正常组相比，cia诱导的组表现出后爪肿胀度增加，并且注射有依那西普的cia诱导的组(阳性对照组)在35至56天内表现出后爪肿胀度减小(％)(p<0.05)。注射有seqidno:1的cia诱导的组以浓度依赖方式表现出后爪肿胀(％)的减小。以高浓度(30mg/kg)注射了seqidno:1的cia诱导的组，在38与49天之间，表现出后爪肿胀度(％)减小(p<0.05)。94.对于测量后爪肿胀度抑制(％)的结果显示，施用了高浓度(30mg/kg)的seqidno:1的cia诱导的组在第38天被抑制了35％。施用了低浓度15mg/kg)的seqidno:1的肽的cia诱导的组在第38天表现出32％的抑制作用，而施用了依那西普的cia诱导的组显示出37％的抑制作用，表明seqidno:1的肽在高浓度下表现出与阳性对照组依那西普相似的作用。95.为了观察后爪的骨损伤程度，使用skyscan1172(skyscan,aartselaar,belgium)进行了微计算机断层扫描(micro‑ct)。使用ctan软件分析了总体积(tv；mm3)、骨体积(bv；mm3)和骨体积分数(bv/tv；％)。在第57天，处死大鼠并进行组织学分析。收集后爪和关节，将其固定在10％缓冲福尔马林中，并在4℃下于30％柠檬酸盐缓冲甲酸中脱矿质3天。制作石蜡块，切成厚度为4μm的切片，用苏木精和伊红(h&e)染色，然后用光学显微镜评估病理评分。根据以下标准(shiozawa等人，jclininvest.1997；99(6):1210‑1216)测量了关节炎症指数。0，正常滑膜；1，滑膜肥大和细胞浸润(synovialmembranehypertrophyandcellinfiltrates)；2，血管翳和软骨糜烂(pannusandcartilageerosion)；3,软骨和软骨下骨的严重侵蚀(majorerosionofcartilageandsubchondralbone)；以及4，关节完整性丧失和强直(lossofjointintegrityandankylosis)。96.结果显示，在cia诱导的的组中观察到严重的骨损伤，而在注射了seqidno:1的肽的cia诱导的组，特别注射了高浓度的seqidno:1的肽的cia诱导的组中，骨组织得以保护，显示了与注射了依那西普的cia诱导的组相似的作用(图3a)。97.另外，对于骨体积(bv)、骨体积/组织体积(bv/tv)、针对bv调整的骨表面积(bs/bv)和骨小梁厚度(tb)的分析结果显示，注射了高浓度的seqidno:1的cia诱导的组表现出高bv、bv/tv和tb.th和低bs/bv，表明seqidno:1的肽具有减小关节炎，同时减少关节区域的骨损伤的作用(图3b)。此处，bv和bv/tv是用于比较不同大小样本中骨骼保护情况的参数。bs/bv是表示骨表面因侵蚀而丧失的参数。tb.th是与关节炎引起的关节周围骨质减少负相关的参数(parfittam等人，j.boneminer.res.1987；2(6):595‑610)。98.另外，对于组织的显微镜观察的结果显示，cia诱导的组显示滑膜组织慢性炎症(chronicinflammationinsynovialtissue)、血管翳形成(pannusformation)以及关节和骨破坏，而注射了seqidno:1的肽的cia诱导的组以浓度依赖的方式显示炎症的减少。注射了依那西普的cia诱导的组显示出与注射了低浓度的seqidno:1的cia诱导的组相似的结果(图4a)。99.还发现炎症指数在注射了seqidno:1的肽的cia诱导的组(1.5±1.17)中显著低于cia诱导组(3.3±0.67；p<0.01)。另一方面，发现注射了依那西普的cia诱导组(2.3±1.16)的炎症指数并不明显低于cia诱导的组。因此，发现seqidno:1的肽比依那西普具有更好的抑制炎性细胞侵袭和减轻cia诱导的的大鼠关节炎症状的作用(图4b)。100.处死大鼠，收集全身血液，用elisa试剂盒(r&d,minneapolis,mn,usa)测量血液中tnf‑α和il‑6的浓度。101.结果表明，cia诱导的组显示出128pg/ml的tnf‑α浓度和109pg/ml的il‑6浓度，但当注射了高浓度的seqidno:1的肽时，tnf‑α浓度为40.3pg/ml，il‑6浓度为35.2pg/ml，当注射依那西普时，tnf‑α的浓度为39pg/ml，il‑6的浓度为24pg/ml(图5)。由此可以看出，seqidno:1的肽具有降低血液中炎性细胞因子tnf‑α和il‑6的浓度的作用，与依那西普相当。102.从上述结果可以推断，seqidno:1至8的肽抑制hdac5的磷酸化，从而抑制炎性细胞因子的产生，从而表现抗炎活性和对关节炎的治疗效果。103.试验例3合成肽对炎性结肠炎疗效的测定结果104.为了确定根据本发明的肽是否具有在体内治疗炎性结肠炎的作用，检测了在结肠炎诱导的动物模型中治疗结肠炎的作用。在诱导结肠炎之前，在24小时内没有向其提供食物，但是允许大鼠自由饮水。用乙醚轻度麻醉大鼠。将橡胶套管(外径2mm)插入结肠，其末端距肛门约8cm，位于结肠脾曲(splenicflexure)附近。将溶解在50％(v/v)水溶液中的2,4,6‑三硝基苯磺酸(tnbs；sigmachemicalco,stlouis,missouri,usa))通过橡胶套管(15mg/0.3ml/大鼠)注射入结肠。诱导结肠炎后72小时，将seqidno:1的肽每天腹膜内注射1次(30mg/kg),施用7天后，处死大鼠。每天上午9点测量大鼠的体重，在大鼠处死后，用游标卡尺(mitutoyo,japan)测量从盲肠到肛门的结肠长度。105.在实验的第8天，从大鼠中取出大肠并用肉眼观察。结果，其中通过注射tnbs诱导结肠炎的组(tnbs)的大肠显著短于正常组，并且表现出大肠组织充血。然而，在诱导结肠炎后注射了seqidno:1的肽的组表现类似于正常组(con)，表明结肠炎被显著抑制(图6a)。106.另外，取出的大肠长度的测量结果显示，与正常组相比，其中通过tnbs注射诱导结肠炎的组(tnbs)的大肠长度显著减少，但注射了seqidno:1的肽的组中的大肠长度与正常组相似。107.将取出的大肠冷冻并储存在‑70℃，从大肠的肌肉层收集粘膜组织，测量粘膜组织的重量，并在三重洗涤缓冲液(50mmtris‑hcl,ph8.0,150mmnacl,0.1％脱氧胆酸钠和1mm苯基甲磺酰氟)中裂解10mg粘膜组织并匀浆。然后，用elisa试剂盒(r&d,minneapolis,mn,usa)测定p40、tnf‑α和il‑12。108.结果显示，在用tnbs处理的组中，p40、tnf‑α和il‑12的表达增加，而在注射了seqidno:1的肽的组中p40、tnf‑α和il‑12的表达减少，类似于正常组(图6c)。109.试验例4合成肽对肝脏疾病标志物gdf15和atf3蛋白表达减少的影响的测定结果110.进行蛋白质印迹以确定seqidnos:1至4的肽对gdf15和atf3蛋白表达的变化的影响。将hepg2细胞以70％的密度铺在6孔板上。16小时后，将细胞用含0.5％fbs的dmem培养基饥饿处理2小时。用含有浓度为200μm的seqidno:1至4的每一种肽处理细胞，持续2小时，然后用浓度为200μm的棕榈酸(palmiticacid)处理以诱导炎性反应，持续24小时。使用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的ripa裂解缓冲液(25mmtris·hclph7.6,150mmnacl,1％np‑40,1％脱氧胆酸钠，0.1％sds)裂解细胞。通过bca蛋白测定法定量检测蛋白质，通过蛋白质印迹来检测gdf15、atf3、fas和微管蛋白的表达水平。通过在8％的sdspage凝胶上加载等量的每种样品和尺寸标记，然后电泳约2小时，并转移到硝酸纤维素膜上来进行蛋白质印迹。将进行转移的膜用5％脱脂乳封闭1小时，并以1:1000的比例与一抗反应过夜。然后，用含有0.1％tween‑20的tbst洗涤膜，并与附接有辣根过氧化物酶(hrp)的二抗反应1小时，之后用ecl底物检测化学发光。111.结果显示，当单独用棕榈酸处理时，作为肝病标志物的gdf15和atf3蛋白的表达增inflammation)和脂肪变性之和的指数。肽处理组的nas评分降低了50％或更多，表明非酒精性脂肪肝得到了改善(图10d)。123.尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但本领域的技术人员将会理解，提供本说明书是为了提供优选实施方案以用于说明解释的目的，并且不应该被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围通过所附权利要求书及其等价内容来限定。124.工业适用性125.根据本发明的肽能够通过抑制组蛋白去乙酰化酶(hdac)的磷酸化、抑制gdf15蛋白的表达、抑制atf3蛋白的表达等来实现三重阻断与炎症和代谢性疾病相关的生物标志物，从而减少炎性细胞因子的产生，并有效预防和治疗代谢性疾病。126.序列自由格式文本(sequencefreetext)127.附上电子文件。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3