基于亮氨酸拉链的组合物和使用方法与流程

基于亮氨酸拉链的组合物和使用方法
1.相关申请的交叉引用
2.本申请要求2018年8月16日提交的美国临时专利申请第62/765,058号和2019年1月29日提交的美国临时专利申请第62/798,168号的优先权，将其全部内容均通过引用并入本文，并要求其优先权。
发明领域
3.本公开的主题提供用于基于细胞的免疫疗法的组合物和系统。它涉及包括膜结合多肽和可溶性多肽的系统，以及使用它们的方法。


背景技术：

4.基于细胞的免疫疗法或过继细胞疗法是具有癌症治疗治愈潜力的疗法。通过引入对所选抗原具有特异性的嵌合抗原受体(car)，可以将t细胞和其他免疫细胞修饰成靶向肿瘤抗原。使用car的靶向t细胞疗法已展现出在治疗血液恶性肿瘤方面的最新临床成功。为了确保以最小的毒性有效根治癌症，基于car的治疗可能需要靶向多种肿瘤抗原，并且通常需要将较大的重组构建体放入t细胞和其他免疫细胞中。然而，很难以所需的效率将大量遗传信息稳定地整合到原代t细胞中；这是当前细胞工程的技术限制。随着病毒载体插入物接近和超过病毒的包装极限，逆转录病毒和慢病毒都显示出病毒滴度的显著降低(逆转录病毒约为6
‑
8kb，慢病毒约为10
‑
12kb)。病毒滴度低导致转导效率低，以及每个细胞整合的拷贝数低，导致基因构建体表达的水平较低。因此，需要新的遗传工程策略来表达靶向多种抗原的更大的car构建体，并且需要能够以最小的毒性和脱靶活性来诱导有效的根除癌症的治疗策略。


技术实现要素：

5.本公开的主题提供一种系统，其包括：a)膜结合多肽，其包括：i)跨膜结构域，ii)细胞内结构域，和iii)包括第一二聚化结构域和阻断间隔区的细胞外结构域；和b)可溶性多肽，其包括：i)第二二聚化结构域，和ii)与抗原结合的抗原结合结构域。在某些实施方式中，第一二聚化结构域和第二二聚化结构域中的每一个均包括亮氨酸拉链结构域，并且当膜结合多肽和可溶性多肽不是由相同细胞表达时，阻断间隔区阻止膜结合多肽与可溶性多肽的二聚。
6.在某些实施方式中，阻断间隔区的长度不超过约25个氨基酸。在某些实施方式中，阻断间隔区的长度为约5个氨基酸至约25个氨基酸。在某些实施方式中，阻断间隔区是截短的cd28间隔区或igg1铰链。
7.本公开的主题提供一种系统，其包括：a)膜结合多肽，其包括：i)跨膜结构域，ii)细胞内结构域，和iii)包括第一二聚化结构域和能够与第一二聚化结构域二聚的第二二聚化结构域的细胞外结构域，和b)可溶性多肽，其包括i)能够与第一二聚化结构域二聚的第三二聚化结构域，和ii)与抗原结合的抗原结合结构域。在某些实施方式中，第一二聚化结
构域和第二二聚化结构域中的每一个均包括亮氨酸拉链结构域。
8.在某些实施方式中，抗原选自肿瘤抗原、病原体抗原、免疫检查点分子、活化受体和造血谱系细胞的生物标志物。在某些实施方式中，抗原是肿瘤抗原。在某些实施方式中，肿瘤抗原选自cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd19、cd20、cd22、vpreb、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd70、cd79a、cd79b、cll
‑
1/clec12a、cd123、il
‑
3r复合物、tim
‑
3、bcma、taci、slamf7、cd244、epcam、e
‑
钙粘蛋白、b7
‑
h3(也称为“cd276”)、b7
‑
h4及其组合。
9.在某些实施方式中，抗原是活化受体。在某些实施方式中，抗原结合结构域与活化受体的结合能够激活抗原呈递细胞(apc)。在某些实施方式中，apc是专职性apc。在某些实施方式中，专职性apc选自树突状细胞、巨噬细胞、b细胞及其组合。在某些实施方式中，apc是非专职性apc。在某些实施方式中，apc是髓系谱系的细胞。在某些实施方式中，髓系谱系的细胞选自树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞及其组合。在某些实施方式中，活化受体选自cd40、toll样受体(tlr)、flt3、rank、gm
‑
csf受体及其组合。
10.在某些实施方式中，抗原是免疫检查点分子。在某些实施方式中，抗原结合结构域与免疫检查点分子的结合能够阻断免疫应答细胞中的免疫检查点信号。在某些实施方式中，免疫检查点分子选自pd
‑
l1、cd200、b7
‑
h3、b7
‑
h4、hvem、半乳凝素9、pd
‑
1、ctla
‑
4、cd200r、tim
‑
3、lag
‑
3、tigit及其组合。
11.在某些实施方式中，抗原是造血谱系细胞的生物标志物。在某些实施方式中，造血谱系细胞的生物标志物选自cd3、cd16、cd33、c
‑
kit、cd161、cd19、cd20、vpreb、促黄体生成激素受体(lhcgr)、cd123、il
‑
3r复合物、clec12a/cll
‑
1及其组合。在某些实施方式中，系统包括至少四个可溶性多肽，其中每个可溶性多肽的抗原结合结构域与不同的造血谱系细胞的生物标志物结合。在某些实施方式中，至少四个可溶性多肽中的每一个均包括有包括亮氨酸拉链结构域的二聚化结构域。在某些实施方式中，系统包括与cd3结合的第一可溶性多肽、与cd19结合的第二可溶性多肽、与cd161结合的第三可溶性多肽和与c
‑
kit结合的第四可溶性多肽。
12.在某些实施方式中，系统进一步包括c)嵌合抗原受体(car)，其包括与第二抗原结合的第二抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内活化结构域。在某些实施方式中，该系统进一步包括d)抑制性受体，其包括亮氨酸拉链结构域，其中抑制性受体与第三抗原结合。在某些实施方式中，抑制性受体是基于酪氨酸磷酸酶的抑制性受体。在某些实施方式中，酪氨酸磷酸酶选自ptprj、ptprc、ptpn22和ptpn6。在某些实施方式中，抑制性受体在不存在第三抗原的情况下，组成性地抑制car和/或使所述car失活。在某些实施方式中，抑制性受体与第三抗原的结合阻止car被抑制性受体抑制和/或失活。
13.本公开的主题提供一种系统，其包括：a)膜结合多肽，其包括跨膜结构域、细胞内结构域和包括第一二聚化结构域的细胞外结构域，和b)可溶性多肽，其包括能够与第一二聚化结构域二聚的第二二聚化结构域和细胞因子或趋化因子。在某些实施方式中，第一二聚化结构域和第二二聚化结构域中的每一个均包括亮氨酸拉链结构域。
14.在某些实施方式中，细胞因子选自il
‑
1、il
‑
2、il
‑
3、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12、il
‑
15、il
‑
17、il
‑
18、il
‑
21、il
‑
22、il
‑
36及其组合。
15.在某些实施方式中，趋化因子选自ccl1、ccl8、ccl16、ccl17、ccl18、ccl22及其组合。
16.在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞外结构域还包括第三二聚化结构域，并且其中第二二聚化结构域能够在第一二聚化结构域和第三二聚化结构域之间的二聚之前，与第一二聚化结构域进行二聚。
17.对于本文公开的任何系统，在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞外结构域还在第一二聚化结构域和第二二聚化结构域之间包括接头。在某些实施方式中，接头包括seq id no：3所示的氨基酸序列。
18.对于本文公开的任何系统，在某些实施方式中，膜结合多肽和/或可溶性多肽还包括标签。在某些实施方式中，标签包括被第一抗体识别的表位标签。在某些实施方式中，表位标签选自myc
‑
标签、ha
‑
标签、flag
‑
标签、v5
‑
标签、t7
‑
标签及其组合。在某些实施方式中，标签包括与底物结合的亲和标签。在某些实施方式中，亲和标签选自his
‑
标签、strep
‑
标签、e
‑
标签、链霉亲和素结合蛋白标签(sbp
‑
标签)及其组合。在某些实施方式中，膜结合多肽和/或可溶性多肽还包括被抗体识别的模拟表位，其中抗体与模拟表位的结合介导包括膜结合多肽的细胞的耗竭。在某些实施方式中，模拟表位是cd20。
19.对于本文公开的任何系统，在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞内结构域包括一种或多种免疫活化分子。在某些实施方式中，细胞内结构域不包括一种或多种免疫活化分子。
20.对于本文公开的任何系统，在某些实施方式中，第一二聚化结构域包括seq id no：1、seq id no：2或seq id no：67所示的氨基酸序列，并且第二二聚化结构域和第三二聚化结构域中的每一个均包括seq id no：2、seq id no：1或seq id no：67所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，可溶性多肽和膜结合多肽在由相同细胞表达时能够形成二聚体。在某些实施方式中，可溶性多肽和膜结合多肽在由不同细胞表达时，由于膜结合多肽的第一二聚化结构域和第二二聚化结构域之间的二聚，不能形成二聚体。
21.对于本文公开的任何系统，在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞内结构域包括cd3ζ结构域、共刺激结构域或其片段或组合。
22.对于本文公开的任何系统，在某些实施方式中，该系统还包括自杀模块(suicide module)。在某些实施方式中，自杀模块是诱导型胱天蛋白酶9多肽(icasp9)。
23.对于本文公开的任何系统，在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞外结构域还在第一二聚化结构域和跨膜结构域之间包括间隔区(spacer)/铰链结构域。在某些实施方式中，间隔区/铰链结构域包括被抗体识别的表位，其中抗体与表位的结合介导包括膜结合多肽的细胞的耗竭。在某些实施方式中，间隔区/铰链结构域包括thy1.1分子、环状cd20模拟表位或截短的egfr分子(egfrt)。
24.对于本文公开的任何系统，在某些实施方式中，可溶性多肽的抗原结合结构域包括单链可变片段(scfv)、可溶性配体、细胞因子、非scfv类抗原识别基序或其片段或组合。
25.对于本文公开的任何系统，在某些实施方式中，膜结合多肽由第一载体表达。在某些实施方式中，可溶性多肽由第二载体表达。在某些实施方式中，第一载体和/或第二载体是病毒载体或基于转座子的载体。
26.对于本文公开的任何系统，在某些实施方式中，亮氨酸拉链是正交拉链。
27.对于本文公开的任何系统，在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞外结构域还包括共刺激配体或其片段。在某些实施方式中，共刺激配体选自肿瘤坏死因子(tnf)家族成
员、免疫球蛋白(ig)超家族成员及其组合。
28.在某些实施方式中，tnf家族成员选自4
‑
1bbl、ox40l、cd70、gitll、cd40l、cd30l及其组合。在某些实施方式中，共刺激配体是cd30l。
29.在某些实施方式中，ig超家族成员选自cd80、cd86、icoslg及其组合。
30.在某些实施方式中，细胞外结构域还包括分子的显性负型(dominant negative form)或其片段。在某些实施方式中，所述分子选自免疫检查点分子的抑制剂、肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)成员、转化生长因子β(tgfβ)受体及其组合。在某些实施方式中，免疫检查点分子选自pd
‑
1、ctla
‑
4、b7
‑
h3、b7
‑
h4、btla、tim
‑
3、lag
‑
3、tigit、lair1、cd200、cd200r、hvem、2b4、cd160、半乳凝素9及其组合。在某些实施方式中，免疫检查点分子是pd
‑
1。在某些实施方式中，tnfrsf成员选自fas、肿瘤坏死因子受体、ox40、cd40、cd27、cd30、4
‑
1bb(也称为“cd137”)及其组合。在某些实施方式中，显性负受体(dominant negative receptor)包括tgfβrii的细胞外结构域或其片段。
31.本公开的主题提供包括本文公开的系统的细胞。在某些实施方式中，细胞是免疫应答细胞。在某些实施方式中，细胞是淋巴谱系的细胞或髓系谱系的细胞。在某些实施方式中，细胞选自t细胞、自然杀伤(nk)细胞、可从中分化出淋巴样细胞的干细胞。在某些实施方式中，干细胞是多能干细胞。在某些实施方式中，多能干细胞是胚胎干细胞或诱导的多能干细胞。在某些实施方式中，细胞是t细胞。在某些实施方式中，t细胞选自细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞、自然杀伤t(nkt)细胞。在某些实施方式中，细胞是调节性t细胞。在某些实施方式中，细胞是自体的。在某些实施方式中，细胞是同种异体的。
32.本公开的主题提供包括本文公开的细胞和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
33.本公开的主题提供用于增加免疫应答细胞的免疫活性的方法，其包括将有效量的本文公开的细胞或系统引入免疫应答细胞。
34.本公开的主题提供一种减少受试者中肿瘤负荷的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的细胞或药物组合物。在某些实施方式中，所述方法在受试者中减少肿瘤细胞的数量、减小肿瘤大小和/或根除肿瘤
35.本公开的主题提供一种用于治疗和/或预防受试者中肿瘤的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的细胞或药物组合物。
36.本公开的主题提供一种用于激活受试者中抗原呈递细胞(apc)的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的细胞或药物组合物。
37.本公开的主题提供一种核酸组合物，其包括(a)编码膜结合多肽的第一多核苷酸，上述膜结合多肽包括：i)跨膜结构域，ii)细胞内结构域，和iii)包括第一二聚化结构域和阻断间隔区的细胞外结构域，和(b)编码可溶性多肽的第二多核苷酸，上述可溶性多肽包括：i)第二二聚化结构域，和ii)与抗原结合的抗原结合结构域。在某些实施方式中，第一二聚化结构域和第二二聚化结构域中的每一个均包括亮氨酸拉链结构域，并且当膜结合多肽和可溶性多肽不是由相同细胞表达时，阻断间隔区阻止膜结合多肽与可溶性多肽的二聚。
38.本公开的主题提供一种核酸组合物，其包括(a)编码膜结合多肽的第一多核苷酸，上述膜结合多肽包括：i)跨膜结构域，ii)细胞内结构域，和iii)包括第一二聚化结构域和能够与第一二聚化结构域二聚的第二二聚化结构域的细胞外结构域，和(b)编码可溶性多
肽的第二多核苷酸，上述可溶性多肽包括i)能够与第一二聚化结构域二聚的第三二聚化结构域，和ii)与抗原结合的抗原结合结构域。在某些实施方式中，第一二聚化结构域和第二二聚化结构域中的每一个均包括亮氨酸拉链结构域。
39.本公开的主题提供一种核酸组合物，其包括(a)编码膜结合多肽的第一多核苷酸，上述膜结合多肽包括跨膜结构域和包括第一二聚化结构域的细胞外结构域，和(b)编码可溶性多肽的第二多核苷酸，上述可溶性多肽包括能够与第一二聚化结构域二聚的第二二聚化结构域和细胞因子或趋化因子，在某些实施方式中，第一二聚化结构域和第二二聚化结构域中的每一个均包括亮氨酸拉链结构域。
40.在某些实施方式中，第一多核苷酸由第一载体编码，第二多核苷酸由第二载体编码。在某些实施方式中，第一载体和/或第二载体是病毒载体。在某些实施方式中，病毒载体是逆转录病毒载体。在某些实施方式中，逆转录病毒载体是慢病毒载体。在某些实施方式中，第一载体和/或第二载体是基于转座子的载体。在某些实施方式中，第一载体与第二载体相同。在某些实施方式中，第一载体与第二载体相同，例如，第一和第二载体的载体主链可以是相同的，而由第一载体和第二载体编码/表达的多肽或蛋白质可以不同。
41.本公开的主题还提供包括本文公开的任何核酸组合物的载体的组合。
附图说明
42.结合附图可以理解以下通过实施例的方式给出的详细描述，但并不旨在将本发明限于所描述的特定实施方式。
43.图1描绘了根据本公开主题的某些实施方式的基于亮氨酸拉链的构建体。
44.图2描绘了根据本公开主题的某些实施方式的基于亮氨酸拉链的构建体。
45.图3描绘了根据本公开主题的某些实施方式的基于亮氨酸拉链的构建体的“涂染(painting)”行为。
46.图4描绘了根据本公开主题的某些实施方式的基于亮氨酸拉链的构建体在t细胞中的表达。
47.图5描绘了zipr
‑
car cd8α铰链和igg1铰链的“涂染”的区别。
48.图6描绘了根据本公开主题的某些实施方式的基于亮氨酸拉链的构建体的细胞毒性活性。
49.图7描绘了根据本公开主题的某些实施方式的基于亮氨酸拉链的构建体的细胞毒性活性。
50.图8描绘了根据本公开的主题的某些实施方式的基于亮氨酸拉链的构建体的功能。
51.图9描绘了根据本公开主题的某些实施方式的基于亮氨酸拉链的构建体的细胞毒性活性。
52.图10描绘了根据本公开的主题的某些实施方式的基于亮氨酸拉链的构建体。
53.图11描绘了根据本公开的主题的某些实施方式的基于亮氨酸拉链的构建体。
54.图12描绘了根据本公开的主题的某些实施方式的基于亮氨酸拉链的构建体。
55.图13描绘了根据本公开的主题的某些实施方式的基于亮氨酸拉链的构建体。
56.图14描绘了根据本公开的主题的某些实施方式的经典car
‑
构建体的活性。
57.图15描绘了根据本公开主题的某些实施方式的基于亮氨酸拉链的构建体。
58.图16描绘了根据本公开的主题的某些实施方式的基于亮氨酸拉链的构建体。
59.图17描绘了根据本公开的主题的某些实施方式的基于亮氨酸拉链的构建体。
60.图18描绘了根据本公开主题的某些实施方式的基于亮氨酸拉链的构建体。
61.图19描绘了根据本公开的主题的某些实施方式的基于亮氨酸拉链的构建体。
62.图20描绘了根据本公开的主题的某些实施方式的基于亮氨酸拉链的构建体。
63.图21描绘了基于亮氨酸拉链的无化学疗法的hct调理方案模型系统。
64.图22描绘了表达cd3 car的t细胞对同族杀伤(fratricide)的促进作用。
65.图23描绘了表达靶向cd117/kit的kit
‑
car的t细胞的活性。
66.图24描绘了cll
‑
1/clec12a car的活性。
67.图25a
‑
25c描绘了根据本公开主题的某些实施方式的基于亮氨酸拉链的构建体的活性。(a)和(c)表达zipr
‑
car；(c)zipr
‑
car的细胞杀伤活性。
68.图26a和26b描绘了包括附加趋化因子的亮氨酸拉链构建体的系统及其活性。图26a描绘了包括附加趋化因子的rr12ee345l亮氨酸拉链和基于ee12rr345l 28z亮氨酸拉链的zipr
‑
car的系统。ccl17和ccl22与ccr4相互作用；ccl1与ccr8相互作用。图26b显示了表达ccr4或ccr8的el4通过系统的裂解。
具体实施方式
69.本公开的主题提供系统以及该系统在免疫治疗中的用途。该系统包括膜结合多肽和可溶性多肽，其中可溶性多肽能够与膜结合多肽二聚。该系统可以增强免疫应答细胞的免疫活性。
70.1.定义
71.除非另有定义，否则本文中使用的所有科技术语具有本领域技术人员通常理解的含义。以下参考文献为技术人员提供了对本公开的主题中使用的许多术语的通常定义：singleton等，微生物学和分子生物学词典(dictionary of microbiology and molecular biology)(1994年第2版)；剑桥科学技术词典(the cambridge dictionary of science and technology)(walker编著，1988)；遗传学词汇(the glossary of genetics)，第5版，r.rieger等(编著)，springer verlag(1991)；和hale&marham，哈珀
·
柯林斯生物学词典(the harper collins dictionary of biology)(1991年)。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有以下赋予它们的含义。
72.如本文所用，术语“约”或“近似”是指在特定值的可接受误差范围内，如本领域普通技术人员所确定的，其将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在3个或超过3个标准偏差之内。另外可选地，“约”可以表示给定值的至多20％、优选至多10％、更优选至多5％、再更优选至多1％的范围。另外可选地，特别是关于生物系统或方法，该术语可以意指在数值的一个数量级内，优选在5倍之内，更优选在2倍之内。
73.如本文所用，术语“抗体”不仅是指完整的抗体分子，而且是指保留免疫原结合能力的抗体分子的片段。这样的片段在本领域中也是公知的，并且在体外和体内均经常使用。因此，如本文所用，术语“抗体”不仅是指完整的免疫球蛋白分子，而且也指公知的活性片段
f(ab')2和fab。缺少完整抗体fc片段的f(ab')2和fab片段，从循环中清除得更快，并且可能具有更少的完整抗体的非特异性组织结合(wahl等，j.nucl.med.24:316
‑
325(1983))。本发明的抗体包括完整的天然抗体、双特异性抗体；嵌合抗体；fab、fab'、单链v区片段(scfv)、融合多肽和非常规抗体。在某些实施方式中，抗体是糖蛋白，其包括通过二硫键相互连接的至少两个重(h)链和两个轻(l)链。每条重链由重链可变区(在本文中简称为v
h
)和重链恒定(c
h
)区组成。重链恒定区由三个结构域ch1、ch2和ch3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中简称为v
l
)和轻链恒定c
l
区组成。轻链恒定区由一个结构域c
l
组成。v
h
区和v
l
区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，其间散布有更保守的区，称为框架区(fr)。每个v
h
和v
l
由三个cdr和四个fr组成，它们从氨基端到羧基端按以下顺序排列：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)。
74.如本文所用，术语“单链可变片段”或“scfv”是共价连接以形成v
h
::v
l
异二聚体的免疫球蛋白(例如小鼠或人)的重链(v
h
)和轻链(v
l
)的可变区的融合蛋白。v
h
和v
l
直接连接，或通过肽编码接头(linker)(例如约10、15、20、25个氨基酸)连接，该接头将v
h
的n
‑
端与v
l
的c
‑
端连接，或将v
h
的c端与v
l
的n
‑
端连接。
75.如本文所用，“接头”是指共价连接两个或更多个多肽或核酸以使它们彼此连接的官能团(例如，化学的或多肽)。在某些实施方式中，接头包括用于将两个蛋白质偶联在一起(例如，偶联v
h
和v
l
结构域或偶联两个二聚化结构域)的一个或多个氨基酸。接头通常可富含用于柔性的甘氨酸，以及用于溶解度的丝氨酸或苏氨酸。
76.如本文所用，术语“载体”是指当与适当的控制元件结合时能够复制并且可以将基因序列转移到细胞中的任何遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等。因此，该术语包括克隆和表达载体，包括病毒载体和质粒载体。
77.如本文所用，术语“表达载体”是指重组核酸序列，例如重组dna分子，其包括可操作地连接至在特定的宿主机体中表达所必需的适当核酸序列的所需编码序列。在原核生物中表达所必需的核酸序列通常包括启动子、操纵子(可选)和核糖体结合位点，通常与其他序列一起。在真核细胞中表达所必需的核酸序列可以包括但不限于。
78.在某些实施方式中，可用于本公开的主题的核酸分子包括编码抗体或其抗原结合片段的核酸分子。这样的核酸分子不需要与内源性核酸序列100％相同，但是通常将显示出基本同一性。与内源性序列具有“基本同源性”或“基本同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。
79.如本文所用，术语“疾病”是指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何状况或病症，疾病的实例包括肿瘤或者细胞、组织或器官的病原体感染。
[0080]“有效量”(或“治疗有效量”)是足以在治疗后产生有益或期望的临床结果的量。可以以一剂或多剂剂量将有效量施用于受试者。就治疗而言，有效量是足以缓解、改善、稳定、逆转或减缓疾病(例如肿瘤)的进展，或减轻疾病(例如肿瘤)的病理后果的量。包括有效量的剂量通常由医生根据具体情况确定，并且这种确定在本领域普通技术人员的能力范围内。当确定合适的剂量以达到有效量时，通常要考虑若干因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重，所治疗的病症，病症的严重程度以及所施用的细胞(例如改造的免疫细胞)
的形式和有效浓度。
[0081]
如本文所用，术语“肿瘤(neoplasm)”是指以细胞或组织的病理性增生及其随后向其它组织或器官的迁移或侵袭为特征的疾病。肿瘤的生长通常是不受控制的和进行性的，并且在不引起正常细胞增殖或者导致正常细胞增殖停止的条件下发生。肿瘤可影响多种细胞类型、组织或器官，包括但不限于选自以下的器官：皮肤、膀胱、结肠、骨骼、大脑、乳房、软骨、神经胶质、食道、输卵管、胆囊、心脏、肠、肾脏、肝脏、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胸膜、胰腺、前列腺、骨骼肌、脊髓、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、子宫和阴道、或其组织或细胞类型。肿瘤包括癌症，例如黑素瘤、肉瘤、肿瘤(carcinomas)或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。
[0082]
如本文所用，术语“免疫应答细胞”是指在免疫应答中起作用的细胞，并且包括该细胞的祖细胞或该细胞的后代。
[0083]
如本文所用，术语“分离的细胞”是指与天然伴随细胞的分子和/或细胞组分相分离的细胞。
[0084]
如本文所用，术语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”是指物质在不同程度上不含在其原始状态下通常与其伴随的组分。“分离”表示与原始来源或环境隔离的程度。“纯化”表示隔离程度高于分离。“纯化的”或“生物学纯的”蛋白质充分不含其他物质，使得任何杂质均不会实质性地影响蛋白质的生物学特性或引起其他不利后果。也就是说，如果本公开主题的核酸或多肽通过重组dna技术生产时基本不含细胞材料、病毒材料或培养基，或者通过化学合成时基本不含化学前体或其他化学品，则其是纯化的。纯度和均质性通常使用分析化学技术确定，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一个条带。对于可以进行修饰(例如磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同的修饰可以产生不同的分离的蛋白质，可以将其分别纯化。
[0085]
如本文所用，术语“分泌的”是指多肽经由分泌途径通过内质网、高尔基体以及作为在细胞质膜上瞬时融合从而将蛋白质释放到细胞外的囊泡从细胞释放。
[0086]
如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指试图改变所治疗的个体或细胞的疾病进程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理过程中进行。治疗的治疗作用包括，但不限于，预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。通过预防疾病或病症的进展，治疗不仅可以预防在受影响或诊断的受试者或怀疑患有该病症的受试者中由于病症引起的恶化，而且治疗可以在有患病症或怀疑患有该病症风险的受试者中预防该病症的发作或该病症的症状。
[0087]
如本文所用，术语“受试者”是任何动物(例如哺乳动物)，包括，但不限于人类、非人灵长类动物、啮齿动物等(例如，将成为特定治疗的接受者)。
[0088]
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“car”是指包括与能够激活或刺激免疫应答细胞的细胞内信号传导结构域融合的细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域的分子。在某些实施方式中，car的细胞外抗原结合结构域包括scfv。scfv可以源自融合抗体的可变重和轻区。另外可选地或额外地，scfv可以源自fab’s(而不是抗体，例如获自fab文库)。在某些实施方式中，将scfv融合至跨膜结构域，然后融合至细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，car选择成对抗原具有高的结合亲和力或抗体亲抗原性。
[0089]
在某些非限制性实施方式中，car或zipr
‑
car的细胞内信号传导结构域包括cd3ζ多肽，其可以激活或刺激细胞(例如，淋巴谱系的细胞，例如t细胞)。cd3ζ包括3个免疫受体酪氨酸激活基序(itam)，并在抗原结合后将激活信号传递至细胞(例如，淋巴谱系的细胞，例如t细胞)。cd3ζ链的细胞内信号传导结构域是来自内源性tcr的主要信号传递者。
[0090]
在某些非限制性实施方式中，car或zipr
‑
car还可以包括将细胞外抗原结合结构域连接至跨膜结构域的间隔区/铰链区。间隔区可以有足够的柔性，以允许抗原结合结构域在不同方向上取向，以促进抗原识别。间隔区可以是来自igg1的铰链区，或者是免疫球蛋白的ch2ch3区和cd3的片段，cd28多肽的片段，cd8多肽的片段，其变体或合成的间隔区序列。
[0091]
如本文所用，“共刺激分子”是指淋巴细胞响应于抗原所需的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。至少一个共刺激信号传导区可以包括cd28多肽(例如cd28的细胞内结构域或其片段)、4
‑
1bb多肽(例如4
‑
1bb的细胞内结构域或其片段)、ox40多肽(例如ox40的细胞内结构域或其片段)、icos多肽(例如icos的细胞内结构域或其片段)、dap
‑
10多肽(例如dap
‑
10的细胞内结构域或其片段)、或其组合。如本文所用，术语“共刺激配体”是指在细胞表面表达的蛋白质，其一经与其受体结合便会产生共刺激反应，即影响活化信号传导结构域(例如cd3ζ信号传导结构域)提供的刺激的细胞内反应。共刺激配体的非限制性实例包括肿瘤坏死因子(tnf)家族成员、免疫球蛋白(ig)超家族成员或其组合。共刺激配体选自肿瘤坏死因子(tnf)家族成员、免疫球蛋白(ig)超家族成员及其组合。tnf家族成员的非限制性实例包括4
‑
1bbl、ox40l、cd70、gitrl、cd40l和cd30l。ig超家族成员的非限制性实例包括cd80、cd86和icolsg。例如，4
‑
1bbl可以结合4
‑
1bb以提供细胞内信号，该细胞内信号与car信号联合诱导car
+
t细胞的效应细胞功能。包括有包括共刺激信号传导区(包括4
‑
1bb、icos或dap
‑
10共刺激信号传导结构域)的细胞内信号传导结构域的car公开于美国专利7,446,190中，在此将其全文并入作为参考。
[0092]
如本文所用，术语“多聚化”是指形成多聚体(包括二聚体)。多聚化包括二聚化。
[0093]
如本文所用，术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变本公开的包括氨基酸序列的多肽(例如，多肽的细胞外抗原结合结构域)的结合特征的氨基酸修饰。保守修饰可以包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和pcr介导的诱变)将修饰引入本公开的多肽的人scfv中。氨基酸可以根据其物理化学性质(例如电荷和极性)分成几组。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被相同组内的氨基酸取代的氨基酸取代。例如，氨基酸可以按电荷分类：带正电荷的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸，中性电荷氨基酸包括丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。另外，氨基酸可以按极性分类：极性氨基酸包括精氨酸(碱性极性)、天冬酰胺、天冬氨酸(酸性极性)、谷氨酸(酸性极性)、谷氨酰胺、组氨酸(碱性极性)、赖氨酸(碱性极性)、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；非极性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。因此，cdr区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同组的其它氨基酸残基取代，并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的抗体的保留功能(即，上述(c)至(l)中列出的功能)。在某些实施方式中，在指定序列或cdr区内不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个残基被改变。
[0094]
如本文所用，两个氨基酸序列之间的同源性百分比等同于两个序列之间的同一性
百分比。两个序列之间的同一性百分比是上述序列共享的相同位置数的函数(即，％同源性＝相同位置数#/位置总数#
×
100)，其中考虑了空位(gap)数和每个空位的长度，需要引入上述空位以实现两个序列的最佳比对。序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。
[0095]
可以使用e.meyers和w.miller(comput.appl.biosci.,4:11
‑
17(1988))的算法确定两个氨基酸序列之间的同源性百分比，该算法已整合到align程序(2.0版)中，使用pam120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。此外，两个氨基酸序列之间的同源性百分比可以使用needleman和wunsch(j.mol.biol.48:444
‑
453(1970))算法来确定，该算法已整合到gcg软件包(可从www.gcg.com获得)中的gap程序中，使用blossum 62矩阵或pam250矩阵，并且空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。
[0096]
额外地或另外可选地，本公开的主题的氨基酸序列可以进一步用作“查询序列”对公共数据库进行搜索，例如，以识别相关序列。可以使用altschul等(1990)j.mol.biol.215:403
‑
10的xblast程序(2.0版)执行这种搜索。可以使用xblast程序进行blast蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本文公开的指定序列(例如，scfv m903、m904、m905、m906和m900的重链和轻链可变区序列)同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如altschul等，(1997)nucleic acids res.25(17):3389
‑
3402中所述使用gapped blast。当使用blast和gapped blast程序时，可以使用各个程序(例如xblast和nblast)的默认参数。
[0097]
2.膜结合多肽和可溶性多肽
[0098]
本公开的主题提供包括膜结合多肽和可溶性多肽的系统和方法，其中可溶性多肽能够与膜结合多肽二聚。
[0099]
2.1膜结合多肽
[0100]
在某些实施方式中，膜结合多肽包括跨膜结构域和细胞外结构域。在某些实施方式中，膜结合多肽还包括铰链/间隔区结构域和/或细胞内结构域。
[0101]
2.1.1细胞外结构域
[0102]
在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞外结构域包括二聚化结构域。二聚化结构域包括亮氨酸拉链结构域。在某些实施方式中，二聚化结构域能够与包括在膜结合多肽中的一个或多个二聚化结构域进行二聚。在某些实施方式中，二聚化结构域能够与包括在本文公开的可溶性多肽中的一个或多个二聚化结构域进行二聚。
[0103]
在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞外结构域包括第一二聚化结构域和能够与第一二聚化结构域在细胞表面二聚的第二二聚化结构域。在某些实施方式中，第一二聚化结构域包括第一亮氨酸拉链结构域。在某些实施方式中，第二二聚化结构域包括第二亮氨酸拉链结构域。
[0104]
在某些实施方式中，亮氨酸拉链结构域包括真核转录因子的碱性区亮氨酸拉链(bzip)类别的二聚化结构域。在某些实施方式中，亮氨酸拉链结构域包括可以与另一α螺旋单体进行二聚的特定α螺旋单体。在某些实施方式中，亮氨酸拉链结构域包括ee结构域，其包括一个或多个酸性氨基酸，例如谷氨酸(e)。在某些实施方式中，亮氨酸拉链结构域包括rr结构域，其包括一个或多个碱性氨基酸，例如精氨酸(r)。在某些实施方式中，第一亮氨酸拉链结构域包括rr结构域，而第二亮氨酸拉链结构域包括ee结构域。
[0105]
在某些实施方式中，rr结构域包括与seq id no：1所示的氨基酸序列或其片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，rr结构域包括seq id no：1的修饰(物)或其片段。在某些实施方式中，修饰包括最多一个、最多两个或最多三个氨基酸取代。seq id no：1提供如下。
[0106][0107]
编码seq id no：1的氨基酸序列的示例性核苷酸序列如seq id no：58所示，其提供如下。
[0108][0109]
在某些实施方式中，rr结构域包括seq id no：1的修饰，其中该修饰由一个氨基酸取代组成或具有一个氨基酸取代。在某些实施方式中，rr结构域包括seq id no：59或seq id no：60所示的氨基酸序列。seq id no：59和seq id no：60提供如下。
[0110][0111]
编码seq id no：59的氨基酸序列的示例性核苷酸序列如seq id no：61所示，其提供如下。
[0112][0113]
编码seq id no：60的氨基酸序列的示例性核苷酸序列如seq id no：62所示，其提供如下。
[0114][0115]
在某些实施方式中，rr结构域包括seq id no：1的修饰，其中修饰由两个氨基酸取代组成或具有两个氨基酸取代。在某些实施方式中，rr结构域包括seq id no：63或seq id no：64所示的氨基酸序列。seq id no：63和seq id no：64提供如下。
[0116][0117]
编码seq id no：63的氨基酸序列的示例性核苷酸序列如seq id no：65所示，其提供如下。
[0118][0119]
编码seq id no：64的氨基酸序列的示例性核苷酸序列如seq id no：66所示，其提供如下。
[0120][0121]
在某些实施方式中，rr结构域包括seq id no：1的修饰，其中修饰由三个氨基酸取代组成或具有三个氨基酸取代。在某些实施方式中，rr结构域包括seq id no：67或seq id no：68所示的氨基酸序列。seq id no：67和seq id no：68提供如下。
[0122][0123]
编码seq id no：67的氨基酸序列的示例性核苷酸序列如seq id no：69所示，其提供如下。
[0124][0125]
编码seq id no：68的氨基酸序列的示例性核苷酸序列如seq id no：70所示，其提供如下。
[0126][0127]
在某些实施方式中，修饰位于亮氨酸拉链的rr结构域的“g”残基中。在某些实施方式中，修饰降低了膜结合多肽和连接的可溶性多肽之间的异二聚化亲和力。
[0128]
在某些实施方式中，ee结构域包括与seq id no：2所示的氨基酸序列或其片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，ee结构域包括seq id no：2的修饰(物)或其片段。在某些实施方式中，修饰包括最多一个、最多两个或最多三个氨基酸取代。seq id no：2提供如下。
[0129][0130]
编码seq id no：2的氨基酸序列的示例性核苷酸序列如seq id no：71所示，其提供如下。
[0131][0132]
在某些实施方式中，细胞外结构域还在第一二聚化结构域和第二二聚化结构域之间包括接头。在某些实施方式中，接头包括seq id no：3或seq id no：20所示的氨基酸序列。seq id no：3和20提供如下。
[0133][0134]
在某些实施例中，二聚化结构域包括正交拉链。正交拉链是卷曲的螺旋结构域，仅与它们的特定配偶体形成异二聚体，而不与其他拉链结构域形成异二聚体。在某些实施方式中，正交性是指与其他分子组非交叉反应(即“正交”)的分子组(例如，亮氨酸拉链)。例如，a+b＝ab，c+d＝cd，但a和b均不与c或d结合，反之亦然。
[0135]
在某些实施方式中，膜结合多肽的第一和第二亮氨酸拉链结构域是一对正交拉链，即，第一和第二亮氨酸拉链结构域是彼此形成异二聚体的特定配偶体。正交拉链包括，但不限于，rr/ee拉链、fos/jun拉链和fos/synzip拉链。fos/jun拉链先前公开于ransone等，genes dev.1989jun；3(6):770
‑
81；kohler等，biochemistry.(2001jan)；9；40(1):130
‑
42，其通过引用并入本文。fos/synzip拉链先前公开于grigoryan等，nature.(2009)；458,859
‑
864；reinke等，j am chem soc.(2010)；132,6025
‑
6031，其通过引用并入本文。
[0136]
在某些实施方式中，正交拉链包括与rr/ee拉链、fos/jun拉链或fos/synzip拉链或其片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，和/或可任选包括最多一个或最多两个或最多三个保守氨基酸取代。
[0137]
synzip
‑
9、fos和jun拉链的实例分别如seq id no：4、5和6所示。
[0138][0139]
在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞外结构域还在二聚化结构域和跨膜结构域之间包括间隔区/铰链结构域。
[0140]
在某些实施方式中，间隔区/铰链结构域具有足够的柔性，以允许二聚化结构域在不同方向上取向，以促进在与本文公开的可溶性多肽二聚化之后的抗原识别。间隔区可以是来自igg1的铰链区，或者是免疫球蛋白的ch2ch3区和cd3的片段，cd28多肽的片段，cd8多肽的片段，与任何前述者具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同一性的变体，或合成的间隔区序列。
[0141]
在某些实施方式中，间隔区/铰链结构域包括被抗体识别的表位。在某些实施方式中，抗体与表位的结合介导包括膜结合多肽的细胞的缺失。在某些实施方式中，间隔区/铰链结构域包括thy1.1分子、截短的egfr分子(egfrt)、cd22免疫球蛋白样结构域表位、igg/fc结构域(可以是来自任何igg的fc)、cd2、cd20环状模拟表位、cd30、cd52或her2。
[0142]
在某些实施方式中，thy1.1分子包括或具有seq id no：95所示的氨基酸序列。
[0143][0144]
在某些实施方式中，egfrt包括或具有seq id no：96所示的氨基酸序列。
[0145][0146]
在某些实施方式中，膜结合多肽还包括阻断间隔区，其中当膜结合多肽和可溶性多肽不是由相同细胞表达时，阻断间隔区能够阻止膜结合多肽与可溶性多肽的二聚。在某些实施方式中，阻断间隔区包括不超过约20至约30个氨基酸残基的最小间隔区。在某些实施方式中，阻断间隔区包括不超过约25个氨基酸残基。在某些实施方式中，阻断间隔区包括
约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个氨基酸残基。在某些实施方式中，阻断间隔区包括约5个氨基酸残基至约25个氨基酸残基，约5个氨基酸残基至约20个氨基酸残基，约10个氨基酸残基至约25个氨基酸残基或者约10个氨基酸残基至约20个氨基酸残基。
[0147]
在某些实施方式中，阻断间隔区包括与seq id no：7或21所示的截短的cd28间隔区或其片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，阻断间隔区包括与seq id no：8或22所示的igg1铰链或其片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性的氨基酸序列。在某些实施方式中，阻断间隔区包括seq id no：7、seq id no：8、seq id no：21和seq id no：22的修饰，其中所述修饰包括最多一个、最多两个或最多三个氨基酸取代。
[0148][0149]
在某些实施方式中，阻断间隔区的长度不超过约25个氨基酸。在某些实施方式中，阻断间隔区的长度为约5个氨基酸至约25个氨基酸。在某些实施方式中，阻断间隔区是截短的cd28间隔区或igg1铰链。
[0150]
在某些非限制性实施方式中，膜结合多肽的细胞外结构域包括至少一种共刺激配体或其片段。
[0151]
共刺激性配体的非限制性实例包括肿瘤坏死因子(tnf)家族成员、免疫球蛋白(ig)超家族成员及其组合。在某些实施方式中，共刺激配体选自肿瘤坏死因子(tnf)家族成员、免疫球蛋白(ig)超家族成员及其组合。在某些实施方式中，tnf家族成员选自4
‑
1bbl、ox40l、cd70、gitrl、cd40l和cd30l。
[0152]
在某些实施方式中，共刺激配体是cd30l。表达cd30l的系统可以将cd30靶向于t细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
[0153]
在某些实施方式中，ig超家族成员选自cd80、cd86和icolsg。
[0154]
在某些实施方式中，共刺激配体是cd80。在某些实施方式中，cd80是小鼠cd80。在某些实施方式中，cd80包括seq id no：72所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，cd80是人cd80。在某些实施方式中，cd80包括seq id no：73所示的氨基酸序列。seq id no：72和73提供如下。
[0155]
[0156]
在某些实施方式中，共刺激配体是4
‑
1bbl。在某些实施方式中，4
‑
1bbl是小鼠4
‑
1bbl。在某些实施方式中，4
‑
1bbl包括seq id no：74所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，4
‑
1bbl是人4
‑
1bbl。在某些实施方式中，4
‑
1bbl包括seq id no：75所示的氨基酸序列。seq id no：74和75提供如下。
[0157][0158]
在某些非限制性实施方式中，膜结合多肽的细胞外结构域还包括显性负分子或其片段。在某些实施方式中，显性负分子选自免疫检查点分子的抑制剂、肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)成员和tgfβ受体。在某些实施方式中，免疫检查点分子选自pd
‑
1、ctla
‑
4、b7
‑
h3、b7
‑
h4、btla、tim
‑
3、lag
‑
3、tigit、lair1、cd200、cd200r、hvem、2b4、cd160、半乳凝素9及其组合。在某些实施方式中，免疫检查点分子是pd
‑
1。在某些实施方式中，tnfrsf成员选自fas、肿瘤坏死因子受体、ox40、cd40、cd27、cd30、4
‑
1bb及其组合。在某些实施方式中，显性负受体包括tgfβrii的细胞外结构域或其片段。
[0159]
在某些非限制性实施方式中，显性负分子是免疫检查点分子的抑制剂。免疫检查点分子抑制剂的显性负(dn)型的细节在wo2017/040945和wo2017/100428中公开，其全部内容均通过引用并入本文。在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞外结构域还包括wo2017/040945中公开的免疫检查点抑制剂的显性负型。在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞外结构域还包括wo2017/100428中公开的免疫检查点抑制剂的显性负型。
[0160]
在某些实施方式中，显性负分子是pd
‑
1显性负(即，pd
‑
1dn)分子。在某些实施方式中，pd
‑
1dn包括(a)至少一个包括配体结合区的pd
‑
1细胞外结构域的片段和(b)跨膜结构域。
[0161]
在某些实施方式中，pd
‑
1dn是小鼠pd
‑
1dn。在某些实施方式中，pd
‑
1dn包括或具有seq id no：76所示的氨基酸序列，其提供如下。
[0162][0163]
在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞外结构域还包括标签。在某些实施方式中，标签包括被第一抗体识别的表位标签。表位标签的非限制性实例包括myc
‑
标签、ha
‑
标签、flag
‑
标签、v5
‑
标签和t7
‑
标签。
[0164]
在某些实施方式中，标签包括与底物结合的亲和标签。亲和标签的非限制性实例包括his
‑
标签、strep
‑
标签、e
‑
标签和链霉亲和素结合蛋白标签(sbp
‑
标签)。
[0165]
此外，膜结合多肽的细胞外结构域可还包括被第二抗体识别的模拟表位。第二抗体与模拟表位的结合可以介导包括膜结合多肽的细胞的耗竭。在某些实施方式中，模拟表
位是被抗cd20抗体识别的cd20模拟表位。在某些实施方式中，抗cd20抗体是利妥昔单抗。在某些实施方式中，cd20模拟表位是环状cd20模拟表位。
[0166]
在某些实施方式中，cd20模拟表位包括或具有seq id no：77所示的氨基酸序列，其提供。
[0167][0168]
2.1.2跨膜结构域
[0169]
不同的跨膜结构域可以导致不同的受体稳定性。根据本公开的主题，跨膜结构域可以包括cd8多肽(例如，cd8的跨膜结构域或其片段)、cd28多肽(例如，cd28的跨膜结构域或其片段)、cd3ζ多肽(例如cd3ζ的跨膜结构域或其片段)、cd4多肽(例如cd4的跨膜结构域或其片段)、4
‑
1bb多肽(例如4
‑
1bb的跨膜结构域或其片段)、ox40多肽(例如ox40的跨膜结构域或其片段)、icos多肽(例如icos的跨膜结构域或其片段)、cd2多肽(例如cd2的跨膜结构域或片段)、合成的肽(不基于与免疫反应相关的蛋白质)或其组合。
[0170]
在某些实施方式中，膜结合多肽的跨膜结构域包括cd8多肽(例如，cd8的跨膜结构域或其片段)。在某些实施方式中，cd8多肽包括或具有与ncbi参考编号np_001139345.1(seq id no：9)的序列或其片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，和/或可以任选地包括至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，cd8多肽包括或具有作为seq id no：9的连续片段的氨基酸序列，其长度为至少20或至少30或至少40或至少50且至多235个氨基酸。另外可选地或额外地，在非限制性的各种实施方式中，cd8多肽包括或具有seq id no：9的氨基酸1至235、1至50、50至100、100至150、150至200、183至203或200至235的氨基酸序列。在某些实施方式中，膜结合多肽的跨膜结构域包括cd8多肽，该cd8多肽包括或具有seq id no：9的氨基酸183至203的氨基酸序列。seq id no：9提供如下。
[0171][0172]
在某些实施方式中，cd8多肽包括或具有与ncbi参考编号aaa92533.1(seq id no：10)的序列或其片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，和/或可以任选地包括至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，cd8多肽包括或具有作为seq id no：10的连续片段的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50、或至少60、或至少70、或至少100、或至少200且至多247个氨基酸。另外可选地或额外地，在非限制性的各种实施方式中，cd8多肽包括或具有seq id no：10的氨基酸1至247、1至50、50至100、100至150、150至200或200至247的氨基酸序列。seq id no：10提供如下。
[0173][0174]
在某些实施方式中，cd8多肽包括或具有seq id no：11所示的氨基酸序列，其提供如下：
[0175][0176]
在某些实施方式中，cd8多肽包括或具有seq id no：12所示的氨基酸序列，其提供如下：
[0177][0178]
在某些实施方式中，膜结合多肽的跨膜结构域包括cd28多肽(例如，cd28的跨膜结构域或其片段)。cd28多肽可以具有ncbi参考编号p10747或np_006130(seq id no：14)的序列或其片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，和/或可以任选地包括至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，cd28多肽包括或具有作为seq id no：14的连续片段的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50且至多220个氨基酸。另外可选地或额外地，在非限制性的各种实施方式中，cd28多肽包括或具有seq id no：14的氨基酸1至220、1至50、50至100、100至150、114至220、150至200、153至179或200至220的氨基酸序列。在某些实施方式中，本文公开的膜结合多肽的跨膜结构域包括cd28多肽，该cd28多肽包括或具有seq id no：14的氨基酸153至179的氨基酸序列。seq id no：14提供如下：
[0179][0180]
在某些实施方式中，膜结合多肽的跨膜结构域包括cd28多肽，该cd28多肽包括或具有如下提供的seq id no：22所示的氨基酸序列。
[0181][0182]
在某些实施方式中，膜结合多肽的跨膜结构域包括cd28多肽，该cd28多肽包括或具有如下提供的seq id no：23所示的氨基酸序列。
[0183][0184]
在某些实施方式中，膜结合多肽的跨膜结构域包括cd4多肽(例如，cd4的跨膜结构域或其片段)。cd4多肽可以具有与ncbi参考编号np_038516.1(seq id no：78)的序列或其片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，和/或可以任选地包括至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，cd4多肽包括或具有作为seq id no：78的连续片段的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50且至多457个氨基酸。另外可选地或额外地，在非限制性的各种实施方式中，cd4多肽
包括或具有seq id no：78的氨基酸1至457、1至50、50至100、100至150、150至200、200至250、250至300、300至350、350至400、395至417或400至457的氨基酸序列。在某些实施方式中，本文公开的膜结合多肽的跨膜结构域包括cd4多肽，该cd4多肽包括或具有seq id no：78的氨基酸395至417。seq id no：78提供如下：
[0185][0186]
在某些实施方式中，膜结合多肽的跨膜结构域包括cd4多肽(例如，cd4的跨膜结构域或其片段)。cd4多肽可以具有与ncbi参考编号np_000607.1(seq id no：78)的序列或其片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，和/或可以任选地包括至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，cd4多肽包括或具有作为seq id no：78的连续片段的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50且至多458个氨基酸。另外可选地或额外地，在非限制性的各种实施方式中，cd4多肽包括或具有seq id no：78的氨基酸1至457、1至50、50至100、100至150、150至200、200至250、250至300、300至350、350至400、397至418或400至457的氨基酸序列。在某些实施方式中，本文公开的膜结合多肽的跨膜结构域包括cd4多肽，该cd4多肽包括或具有seq id no：78的氨基酸397至418。seq id no：78提供如下：
[0187][0188]
2.1.3细胞内结构域
[0189]
在某些非限制性实施方式中，膜结合多肽还包括细胞内结构域。在某些非限制性实施方式中，细胞内结构域向细胞(例如淋巴谱系的细胞，例如t细胞)提供激活信号。在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞内结构域包括免疫活化分子。在某些实施方式中，免疫活化分子是cd3ζ多肽。
[0190]
在某些非限制性实施方式中，膜结合多肽的细胞内结构域包括cd3ζ多肽或其片段。cd3ζ多肽可以激活或刺激细胞。cd3ζ包括3个itam，并在抗原结合后将激活信号传递至细胞(例如，淋巴谱系的细胞，例如t细胞)。cd3ζ
‑
链的细胞内信号传导结构域是来自内源性tcr的信号的主要传递者。在某些实施方式中，cd3ζ多肽包括或具有与ncbi参考编号np_932170(seq id no：15)的序列或其片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的
氨基酸序列，和/或可以任选地包括至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些非限制性实施方式中，cd3ζ多肽包括或具有作为seq id no：15的连续片段的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50且至多164个氨基酸。另外可选地或额外地，在非限制性的各种实施方式中，cd3ζ多肽包括或具有seq id no：15的氨基酸1至164、1至50、50至100、52至164、100至150、或150至164的氨基酸序列。在某些实施方式中，cd3ζ多肽包括或具有seq id no：15的氨基酸52至164的氨基酸序列。seq id no：15提供如下：
[0191][0192]
在某些实施方式中，cd3ζ多肽包括或含有与含有ncbi参考编号np_001106864.2(seq id no：13)的序列或其片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，和/或可以任选地包括至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些非限制性实施方式中，cd3ζ多肽包括或具有作为seq id no：13的连续片段的氨基酸序列，其长度为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50、或至少约90、或至少约100且至多188个氨基酸。另外可选地或额外地，在非限制性的各种实施方式中，cd3ζ多肽包括或具有seq id no：13的氨基酸1至164、1至50、50至100、100至150、或150至188的氨基酸序列。seq id no：13提供如下：
[0193][0194]
在某些实施方式中，cd3ζ多肽包括或具有seq id no：17所示的氨基酸序列，其提供如下：
[0195][0196]
在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞内结构域包括鼠cd3ζ多肽。
[0197]
在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞内结构域包括人cd3ζ多肽。
[0198]
在某些非限制性实施方式中，膜结合多肽的细胞内结构域向细胞提供激活信号和刺激信号。在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞内结构域包括至少一个共刺激分子或其片段。
[0199]
在某些实施方式中，至少一个共刺激信号传导区包括cd28多肽(例如，cd28的细胞内结构域或其片段)、4
‑
1bbb多肽(例如，4
‑
1bb的细胞内结构域或片段)、ox40多肽(例如ox40的细胞内结构域或其片段)、icos多肽(例如icos的细胞内结构域或其片段)、dap
‑
10多肽(例如dap
‑
10的细胞内结构域或其片段)或其组合。在某些实施方式中，至少一个共刺激信号传导区包括cd28多肽。在某些实施方式中，至少一个共刺激信号传导区包括cd28的细胞内结构域或其片段。
[0200]
在某些实施方式中，共刺激分子是cd28多肽(例如，cd28的细胞内结构域或其片段)。cd28多肽可以包括或具有与ncbi参考编号p10747或np_006130(seq id no：14)的序列
或其片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，和/或可以任选地包括至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，cd28多肽包括或具有作为seq id no：14的连续片段的氨基酸序列，其长度为至少20、或至少30、或至少40、或至少50且至多220个氨基酸。另外可选地或额外地，在非限制性的各种实施方式中，cd28多肽包括或具有seq id no：14的氨基酸1至220、1至50、50至100、100至150、150至200或200至220的氨基酸序列。在某些实施方式中，cd28多肽包括或具有seq id no：14的氨基酸181至220的氨基酸序列。
[0201]
在某些实施方式中，cd28多肽包括或具有与ncbi参考编号np_031668.3(seq id no：16)的序列或其片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，和/或可以任选地包括至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，cd28多肽包括或具有作为seq id no：16的连续片段的氨基酸序列，其长度为至少约20、或至少约30、或至少约40、或至少约50且至多218个氨基酸。另外可选地或额外地，在非限制性的各种实施方式中，cd28多肽包括或具有seq id no：16的氨基酸1至218、1至50、50至100、100至150、150至200或200至218的氨基酸序列。在某些实施方式中，cd28多肽包括或具有seq id no：16的氨基酸178至218的氨基酸序列。seq id no：16提供如下：
[0202][0203]
在某些实施方式中，共刺激分子是小鼠cd28多肽。在某些实施方式中，共刺激分子是人cd28多肽。
[0204]
在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞内结构域包括两个共刺激分子，例如，cd28和4
‑
1bb，或cd28和ox40。
[0205]
在某些实施方式中，至少一个共刺激信号传导区包括4
‑
1bb多肽。在某些实施方式中，至少一个共刺激信号传导区包括4
‑
1bb的细胞内结构域或其片段。
[0206]
在某些实施方式中，共刺激分子是4
‑
1bb多肽(例如，4
‑
1bb的细胞内结构域或其片段)。4
‑
1bb可以充当肿瘤坏死因子(tnf)配体并具有刺激活性。4
‑
1bb多肽可以包括或具有与ncbi参考编号p41273或np_001552(seq id no：3)的序列或其片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，和/或可以任选地包括至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。seq id no：3提供如下：
[0207][0208]
根据本公开的主题，“4
‑
1bb核酸分子”是指编码4
‑
1bb多肽的多核苷酸。
[0209]
在某些实施方式中，至少一个共刺激信号传导区包括ox40多肽。在某些实施方式中，至少一个共刺激信号传导区包括ox40的细胞内结构域或其片段。
[0210]
在某些实施方式中，共刺激分子是ox40多肽(例如，ox40的细胞内结构域或其片段)。ox40多肽可以包括或具有与ncbi参考编号p43489或np_003318(seq id no：18)的序列或其片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，和/或可以任选地包括至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。seq id no：18提供如下：
[0211][0212]
根据本公开的主题，“ox40核酸分子”是指编ox40多肽的多核苷酸。
[0213]
在某些实施方式中，至少一个共刺激信号传导区包括icos多肽。在某些实施方式中，至少一个共刺激信号传导区包括icos的细胞内结构域或其片段。
[0214]
在某些实施方式中，共刺激分子是icos多肽(例如，icos的细胞内结构域或其片段)。icos多肽可以包括或具有与ncbi参考编号np_036224(seq id no：19)的序列或其片段具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列，和/或可以任选地包括至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。seq id no：19提供如下：
[0215][0216]
根据本公开的主题，“icos核酸分子”是指编码icos多肽的多核苷酸。
[0217]
在某些实施方式中，至少一个共刺激信号传导区包括两个共刺激分子或其片段。在某些实施方式中，至少一个共刺激信号传导区包括cd28多肽(例如，cd28的细胞内结构域或其片段)和4
‑
1bb多肽(例如，4
‑
1bb的细胞内结构域或其片段)。
[0218]
在某些非限制性实施方式中，单独的膜结合多肽的细胞内结构域不向细胞提供激活信号。在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞内结构域不包括共刺激分子。在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞内结构域不包括cd3ζ多肽。
[0219]
在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞内结构域还包括自杀基因。合适的自杀基因包括，但不限于，单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv
‑
tk)和诱导型胱天蛋白酶9自杀基因(icasp
‑
9)。在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞内结构域还包括截短的人表皮生长因子受体(egfrt)多肽。截短的egfrt多肽可以通过施用抗egfr单克隆抗体(例如西妥昔单抗)启动t细胞消除。
[0220]
在某些实施方式中，膜结合多肽包括synnotch模块。synnotch模块公开于美国专利申请no.9,670,281和morsut等，cell,164,780
‑
791,2016中，在此将其均通过引用整体并入。
[0221]
2.2可溶性多肽
[0222]
在某些实施方式中，可溶性多肽包括能够与本文公开的膜结合多肽中包括的二聚化结构域进行二聚的二聚化结构域。在某些实施方式中，膜结合多肽是本文例如在第2.1节中公开的膜结合多肽。在某些实施方式中，二聚化结构域包括亮氨酸拉链结构域。二聚化结构域可以是2.1.1节中公开的任何二聚化结构域。
[0223]
在某些实施方式中，可溶性多肽包括二聚化结构域和能够结合抗原的抗原结合结构域。
[0224]
在某些实施方式中，可溶性多肽包括二聚化结构域和细胞因子或趋化因子。在某些实施方式中，可溶性多肽还包括标签。
[0225]
在某些实施方式中，膜结合多肽的亮氨酸拉链结构域和可溶性多肽的亮氨酸拉链结构域是一对正交拉链，即它们是彼此形成异二聚体的特定配偶体。
[0226]
2.2.1细胞因子/趋化因子
[0227]
在某些实施方式中，细胞因子/趋化因子能够增强免疫应答细胞的免疫应答和/或引起恶性或感染细胞的细胞死亡。在某些实施方式中，细胞因子/趋化因子是抗肿瘤细胞因子/趋化因子。在某些实施方式中，细胞因子或趋化因子包括或具有与细胞因子/趋化因子具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％的同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，和/或可以任选地包括至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。细胞因子的非限制性实例包括il
‑
1、il
‑
2、il
‑
3、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12、il
‑
15、il
‑
17、il
‑
18、il
‑
21、il
‑
22、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)、ifn
‑
γ、cxcl1、il
‑
23和cxcl10。趋化因子的非限制性实例包括ccl1、ccl17、ccl8、ccl16、ccl18和ccl22。
[0228]
ccl1/ccl8/ccl16/ccl18配体可以与ccr8相互作用或配对。ccl17/ccl22配体可以与ccr4相互作用或配对。这些受体是调节性t细胞的靶标，并且t细胞淋巴瘤和b细胞淋巴瘤的子集使它们成为可能的治疗靶标。
[0229]
在某些实施方式中，趋化因子是ccl1。在某些实施方式中，ccl1是小鼠ccl1。在某些实施方式中，小鼠ccl1包括seq id no：80所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，ccl1是人ccl1。在某些实施方式中，人ccl1包括seq id no：81所示的氨基酸序列。seq id no：80和81提供如下。
[0230][0231]
在某些实施方式中，趋化因子是ccl17。在某些实施方式中，ccl17是小鼠ccl17。在某些实施方式中，小鼠ccl17包括seq id no：82所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，ccl17是人ccl17。在某些实施方式中，人ccl17包括seq id no：83所示的氨基酸序列。seq id no：82和83提供如下。
[0232]
[0233]
在某些实施方式中，趋化因子是ccl18。在某些实施方式中，ccl18是人ccl18。在某些实施方式中，人ccl18包括seq id no：84所示的氨基酸序列。seq id no：84提供如下。
[0234][0235]
在某些实施方式中，趋化因子是ccl22。在某些实施方式中，ccl22是小鼠ccl22。在某些实施方式中，小鼠ccl22趋化因子包括seq id no：85所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，ccl22是人ccl22。在某些实施方式中，人ccl22包括seq id no：86所示的氨基酸序列。seq id no：85和86提供如下。
[0236][0237]
2.2.2抗原结合结构域
[0238]
在某些实施方式中，可溶性多肽的抗原结合结构域包括单链可变片段(scfv)、可溶性配体、细胞因子或非scfv类抗原识别基序，或其组合。
[0239]
在某些非限制性实施方式中，可溶性多肽的抗原结合结构域(体现为例如scfv或其类似物)与抗原结合的解离常数(k
d
)为约2
×
10
‑7m或更小。在某些实施方式中，k
d
为约2
×
10
‑7m或更小，约1
×
10
‑7m或更小，约9
×
10
‑8m或更小，约1
×
10
‑8m或更小，约9
×
10
‑9m或更小，约5
×
10
‑9m或更小，约4
×
10
‑9m或更小，约3
×
10
‑9m或更小，约2
×
10
‑9m或更小，或约1
×
10
‑9m或更小。在某些非限制性实施方式中，k
d
为约3
×
10
‑9m或更小。在某些非限制性实施方式中，k
d
为约1
×
10
‑9m至约3
×
10
‑7m。在某些非限制性实施方式中，k
d
为约1.5
×
10
‑9m至约3
×
10
‑7m。
[0240]
抗原结合结构域(例如，在scfv或其类似物中)的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定法(elisa)、放射免疫测定法(ria)、facs分析法、生物测定法(例如生长抑制)或western blot测定法来测定。这些测定法中的每一种通常通过采用对目标复合物具有特异性的标记试剂(例如抗体或scfv)来检测特定目标蛋白质
‑
抗体复合物的存在。例如，scfv可以被放射性标记并用于放射免疫测定法(ria)(参见，例如，weintraub,b.，放射免疫测定的原理(principles of radioimmunoassays)，放射配体测定技术的第七次培训课程(seventh training course on radioligand assay techniques)，内分泌学会(the endocrine society)，1986年3月，通过引用并入本文)。放射性同位素可以通过诸如使用γ计数器或闪烁计数器的方法或通过放射自显影来检测。在某些实施方式中，抗原结合结构域用荧光标记物标记。荧光标记物的非限制性示例包括绿色荧光蛋白(gfp)、蓝色荧光蛋白(例如ebfp、ebfp2、azurite和mkalama1)、青色荧光蛋白(例如ecfp、cerulean和cypet)和黄色荧光蛋白(例如，yfp、citrine、venus和ypet)。
[0241]
在某些实施方式中，可溶性多肽的抗原结合结构域特异性结合抗原。在某些实施方式中，抗原结合结构域是scfv。在某些实施方式中，scfv是人scfv。在某些实施方式中，scfv是人源化的scfv。在某些实施方式中，scfv是鼠scfv。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是fab，其任选地被交联。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是f(ab)2。在某些实施方式中，任何前述分子均可以包括在具有异源序列的融合蛋白中，以形成细胞
外抗原结合结构域。在某些实施方式中，通过用抗原
‑
fc融合蛋白来筛选scfv噬菌体文库，从而鉴别scfv。在某些实施方式中，抗原是肿瘤抗原。在某些实施方式中，抗原是病原体抗原。
[0242]
2.2.3抗原
[0243]
在某些实施方式中，可溶性多肽的抗原结合结构域与肿瘤抗原结合。任何肿瘤抗原均可以用于本文所述的肿瘤相关的实施方式中。抗原可以表达为肽或完整的蛋白质或其片段。完整的蛋白质或其片段可以是天然的或诱变的。肿瘤抗原的非限制性实例包括cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd19、cd20、cd22、vpreb、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd70、cd79a、cd70b、cll
‑
1/clec12a、cd123、il
‑
3r复合物、tim
‑
3、bcma、taci、slamf7、cd244、e
‑
钙粘蛋白、b7
‑
h3、b7
‑
h4、碳酸酐酶ix(ca1x)、癌胚抗原(cea)、cd10、cd34、cd38、cd41、cd44、cd49f、cd56、cd74、cd133、cd138、巨细胞病毒(cmv)感染细胞的抗原(例如细胞表面抗原)、上皮糖蛋白2(egp
‑
2)、上皮糖蛋白40(egp
‑
40)、上皮细胞粘附分子(epcam)、受体酪氨酸蛋白激酶erb
‑
b2,3,4(erb
‑
b2,3,4)、叶酸结合蛋白(fbp)、胎儿乙酰胆碱受体(achr)、叶酸受体α、神经节苷脂g2(gd2)、神经节苷脂g3(gd3)、人表皮生长因子受体2(her
‑
2)、人端粒酶逆转录酶(htert)、白介素13受体亚基α
‑
2(il
‑
13rα2)、κ轻链、激酶插入结构域受体(kdr)、lewis y(ley)、ll细胞粘附分子(l1cam)、黑素瘤抗原家族a,1(mage
‑
a1)、粘蛋白16(muc16)、粘蛋白1(muc1)、间皮素(msln)、erbb2、magea3、p53、mart1、gp100、蛋白酶3(pr1)、酪氨酸酶、存活蛋白、htert、epha2、nkg2d配体、癌
‑
睾丸抗原ny
‑
eso
‑
1、胎粪抗原(h5t4)、前列腺干细胞抗原(psca)、前列腺特异性膜抗原(psma)、ror1、肿瘤相关糖蛋白72(tag
‑
72)、血管内皮生长因子r2(vegf
‑
r2)和wilms肿瘤蛋白(wt
‑
1)、bcma、nkcs1、egf1r、egfr
‑
viii、cd99、adgre2、ccr1、lilrb2、prame和erbb。
[0244]
在某些实施方式中，可溶性多肽的抗原结合结构域与人cd19多肽结合。在某些实施方式中，可溶性多肽的抗原结合结构域与人cd19蛋白的细胞外结构域结合。
[0245]
在某些实施方式中，可溶性多肽的抗原结合结构域与免疫检查点分子结合。免疫检查点分子的非限制性实例包括pd
‑
l1、cd200、b7
‑
h3、b7
‑
h4、hvem、半乳凝素9、pd
‑
1、ctla
‑
4、cd200r、tim
‑
3、lag
‑
3和tigit。
[0246]
在某些实施方式中，可溶性多肽的抗原结合结构域与活化受体结合，其中抗原结合结构域与活化受体的结合能够激活抗原呈递细胞(apc)。免疫检查点分子的非限制性例子包括cd40、toll样受体(tlr)、flt3、rank和gm
‑
csf受体。
[0247]
在某些实施方式中，可溶性多肽的抗原结合结构域与造血谱系细胞的生物标志物结合。免疫检查点分子的非限制性实例包括cd3、cd16、cd33、c
‑
kit、cd161、cd19、cd20、vppreb、促黄体生成激素受体(lhcgr)、cd123、il
‑
3r复合物、clec12a/cll
‑
1。
[0248]
在某些实施方式中，可溶性多肽的抗原结合结构域与病原体抗原结合，例如用于治疗和/或预防病原体感染或其他感染性疾病，例如在免疫受损的受试者中。病原体的非限制性实例包括能够引起疾病的病毒、细菌、真菌、寄生虫和原生动物。
[0249]
病毒的非限制性实例包括逆转录病毒科(retroviridae)(例如，人免疫缺陷病毒，例如hiv
‑
1(也称为hdtv
‑
iii、lave或htlv
‑
iii/lav或hiv
‑
iii；以及其他分离株，例如hiv
‑
lp)；小rna病毒科(picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、肠病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)；杯状病毒科(calciviridae)(例如引起肠胃炎的菌株)；披膜病
毒科(togaviridae)(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(flaviridae)(例如登革热病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(coronoviridae)(例如冠状病毒)；弹状病毒科(rhabdoviridae)(例如水疱性口炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(filoviridae)(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(paramyxoviridae)(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(orthomyxoviridae)(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(bungaviridae)(例如汉坦病毒、bunga病毒、静脉病毒和奈拉病毒)；沙粒病毒科(arena viridae)(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(reoviridae)(例如呼肠孤病毒、环状病毒(orbiviurses)和轮状病毒)；双rna病毒科(birnaviridae)；嗜肝dna病毒科(hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(parvovirida)(细小病毒)；乳多空病毒科(papovaviridae)(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(herpesviridae)(单纯疱疹病毒(hsv)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(cmv)、疱疹病毒)；痘病毒科(poxviridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(iridoviridae)(例如非洲猪瘟病毒)；以及未分类的病毒(例如，丁型肝炎的病原体(被认为是乙肝病毒的缺陷卫星(defective satellite))，非甲、非乙型肝炎的病原体(类1＝内部传播；类2＝经肠胃外传播(即，丙型肝炎)；诺沃克(norwalk)和相关病毒，以及星状病毒)。
[0250]
细菌和/或真菌的非限制性实例包括巴氏杆菌(pasteurella)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococcus)、大肠杆菌(escherichia coli)、假单胞菌属(pseudomonas species)和沙门氏菌属(salmonella species)。传染性细菌的具体实例包括但不限于，幽门螺杆菌(helicobacter pyloris)、伯氏疏螺旋体(borelia burgdorferi)、嗜肺军团菌(legionella pneumophilia)、分枝杆菌属(mycobacteria sps)(例如结核分枝杆菌(m.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(m.avium)、胞内分枝杆菌(m.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(m.kansaii)、戈登分枝杆菌(m.gordonae))、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、淋病奈瑟氏菌(neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseria meningitidis)、单核细胞增生性李斯特菌(listeria monocytogenes)、酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)(a组链球菌)、无乳链球菌(streptococcus agalactiae)(b组链球菌)、链球菌(viridans组)、粪链球菌(streptococcus faecalis)、牛链球菌(streptococcus bovis)、链球菌(厌氧属)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、致病性弯曲杆菌属(pathogenic campylobacter sp.)、肠球菌属(enterococcus sp.)、流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)、炭疽杆菌(bacillus antracis)、白喉棒状杆菌(corynebacterium diphtheriae)、棒状杆菌属(corynebacterium sp.)、红斑丹毒丝菌(erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(clostridium perfringers)、破伤风梭菌(clostridium tetani)、产气肠杆菌(enterobacter aerogenes)、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)、多杀性巴斯德氏菌(pasturella multocida)、拟杆菌属(bacteroides sp.)、具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(streptobacillus moniliformis)、梅毒螺旋体(treponema pallidium)、极细密螺旋体(treponema pertenue)、钩端螺旋体(leptospira)、立克次氏体(rickettsia)、曲霉属(aspergillus species)和衣氏放线菌(actinomyces israelli)。
[0251]
2.2.4标签
[0252]
在某些实施方式中，可溶性多肽还包括标签。在某些实施方式中，标签包括表位标签，其包括被抗体识别的表位。在某些实施方式中，表位标签选自myc
‑
标签、ha
‑
标签、flag
‑
标签、v5
‑
标签、t7
‑
标签及其组合。在某些实施方式中，标签包括与底物结合的亲和标签。在某些实施方式中，亲和标签选自his
‑
标签、strep
‑
标签、e
‑
标签、链霉亲和素结合蛋白标签(sbp
‑
标签)及其组合。
[0253]
此外，可溶性多肽还可以包括被第二抗体识别的模拟表位。第二抗体与模拟表位的结合可以介导包括膜结合多肽的细胞的耗竭。在某些实施方式中，模拟表位是被抗cd20抗体识别的cd20模拟表位。在某些实施方式中，抗cd20抗体是利妥昔单抗(rituxumab)。在某些实施方式中，cd20模拟表位是环状cd20模拟表位。
[0254]
在某些实施方式中，cd20模拟表位包括或具有如下提供的seq id no：77所示的氨基酸序列。
[0255][0256]
3.系统
[0257]
本公开的主题提供用于免疫疗法的系统。在某些实施方式中，该系统包括本文公开的膜结合多肽和本文公开的可溶性多肽。
[0258]
3.1.具有阻断间隔区的功能性分选拉链构建体
[0259]
本公开的主题提供一种系统，其包括：a)本文公开的膜结合多肽(例如，包括：i)跨膜结构域、ii)细胞内结构域和iii)包括第一二聚化结构域和阻断间隔区的细胞外结构域的膜结合多肽)，和b)本文公开的可溶性多肽(例如，包括i)能够与第一二聚化结构域二聚的第二二聚化结构域和ii)与抗原结合的抗原结合结构域的可溶性多肽)。在某些实施方式中，第一二聚化结构域和第二二聚化结构域中的每一个均包括亮氨酸拉链结构域，并且当膜结合多肽和可溶性多肽不是由相同细胞表达时，阻断间隔区阻止膜结合多肽与可溶性多肽的二聚
[0260]
在某些实施方式中，阻断间隔区的长度不超过约25个氨基酸。在某些实施方式中，阻断间隔区的长度为约5个氨基酸至约25个氨基酸。在某些实施方式中，阻断间隔区是截短的cd28间隔区或igg1铰链。
[0261]
3.2.具有自阻断特征的功能性分选拉链构建体
[0262]
本公开的主题提供一种系统，其包括：a)本文公开的膜结合多肽(例如，包括：i)跨膜结构域、ii)细胞内结构域和iii)包括第一二聚化结构域和能够与第一二聚化结构域二聚的第二二聚化结构域的细胞外结构域的膜结合多肽)，和b)本文公开的可溶性多肽(例如，包括i)能够与第一二聚化结构域二聚的第三二聚化结构域和ii)与抗原结合的抗原结合结构域的可溶性多肽)。在某些实施方式中，第一二聚化结构域和第二二聚化结构域中的每一个均包括亮氨酸拉链结构域。
[0263]
在某些实施方式中，抗原选自肿瘤抗原、病原体抗原、免疫检查点分子、活化受体和造血谱系细胞的生物标志物。
[0264]
3.2.1靶向肿瘤抗原的功能性分选拉链构建体
[0265]
本公开的主题提供用于靶向肿瘤抗原的系统，其包括本文公开的任何膜结合多肽和/或任何可溶性多肽，或本文公开的任何系统。在某些实施方式中，任选地包括在本文公开的任何系统中的本文公开的可溶性多肽的抗原结合结构域的抗原是肿瘤抗原。在某些实
施方式中，肿瘤抗原选自cd2、cd3、cd4、cd5、cd7、cd8、cd19、cd20、cd22、vpreb、cd79a、cd79b、cd30、cd33、cd38、cd40、cd44v6、cd70、cll
‑
1/clec12a、cd123、il
‑
3r复合物、tim
‑
3、bcma、taci、slamf7、cd244、epcam、e
‑
钙粘蛋白、b7
‑
h3、b7
‑
h4及其片段或组合。
[0266]
3.2.2.用于激活apc的功能性分选拉链构建体
[0267]
本公开的主题提供用于激活apc的系统，其包括本文公开的任何膜结合多肽和/或任何可溶性多肽，或本文公开的任何系统。在某些实施方式中，任选地包括在本文公开的任何系统中的可溶性多肽的抗原结合结构域的抗原是活化受体。在某些实施方式中，抗原结合结构域与活化受体的结合能够激活抗原呈递细胞(apc)。在某些实施方式中，apc是专职性apc。在某些实施方式中，专职性apc选自树突状细胞、巨噬细胞、b细胞及其组合。在某些实施方式中，apc是非专职性apc。在某些实施方式中，apc是髓系谱系的细胞。在某些实施方式中，髓系谱系的细胞选自树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞及其组合。在某些实施方式中，活化受体选自cd40、toll样受体(tlr)、flt3、rank、gm
‑
csf受体及其片段或组合。
[0268]
3.2.3.靶向免疫检查点阻断剂的功能性分选拉链构建体
[0269]
本公开的主题提供用于靶向免疫检查点阻断剂(blocker)的系统，其包括本文公开的任何膜结合多肽和/或任何可溶性多肽，或本文公开的任何系统。在某些实施方式中，任选地包括在本文公开的任何系统中的本文公开的可溶性多肽的抗原结合结构域的抗原是免疫检查点分子。在某些实施方式中，抗原结合结构域与免疫检查点分子的结合能够阻断免疫应答细胞中的免疫检查点信号。在某些实施方式中，免疫检查点分子选自pd
‑
l1、cd200、b7
‑
h3、b7
‑
h4、hvem、半乳凝素9、pd
‑
1、ctla
‑
4、cd200r、tim
‑
3、lag
‑
3、tigit及其片段或组合。
[0270]
3.2.4.用于造血干细胞移植调理方案的功能性分选拉链构建体
[0271]
本公开的主题提供用于造血干细胞移植的调理方案(conditioning regimen)的系统，其包括本文公开的任何膜结合多肽和/或任何可溶性多肽，或本文公开的任何系统。在某些实施方式中，任选地包括在本文公开的任何系统中的本文公开的可溶性多肽的抗原结合结构域的抗原是造血谱系细胞的生物标志物。在某些实施方式中，造血谱系细胞的生物标志物选自cd3、cd16、cd33、c
‑
kit、cd161、cd19、cd20、vpreb/cd179a(preb细胞受体)、促黄体生成激素受体(lhcgr)、cd123、il
‑
3r复合物、clec12a/cll
‑
1及其组合。在某些实施方式中，该系统包括至少四个可溶性多肽，其中每个可溶性多肽的抗原结合结构域与不同的造血谱系细胞的生物标志物结合。在某些实施方式中，至少四个可溶性多肽的每一种均包括有包括亮氨酸拉链结构域的二聚化结构域。在某些实施方式中，该系统包括结合cd3的第一可溶性多肽、结合cd19的第二可溶性多肽、结合cd161的第三可溶性多肽和结合c
‑
kit的第四可溶性多肽。
[0272]
在某些实施方式中，与膜结合多肽(也称为“捕获亮氨酸拉链”或“跨膜捕获亮氨酸拉链”)相互作用的二聚化结构域是可溶性多肽(也称为如“分泌的亮氨酸拉链”或“分泌的分子”)的附加的异二聚化亮氨酸拉链，其还包括亲和标签和与靶标抗原结合的抗原结合结构域(例如，scfv或配体)。参见例如图1，左侧的系统。如果膜结合多肽和可溶性多肽与相同的异二聚化亮氨酸拉链结构域(例如，ee12rr345l)相互作用，则它们可以具有相同的异二聚化亮氨酸拉链结构域(例如，rr12ee345l)。在某些实施方式中，多种可溶性多肽(例如，四个可溶性多肽)的亮氨酸拉链和膜结合多肽的亮氨酸拉链是非正交拉链，即简并拉链，其允
许所有抗原均被膜结合多肽(包括zipr
‑
car的cd3ζ)靶向，导致造血系统的成分被效应细胞杀死。
[0273]
3.2.5.具有and
‑
car的功能性分选拉链构建体
[0274]
本公开的主题提供用于造血干细胞移植的调理方案的系统，其包括本文公开的任何膜结合多肽和/或任何可溶性多肽，或本文公开的任何系统。在某些实施方式中，该系统还包括c)嵌合抗原受体(car)，其包括第二抗原结合结构域(例如，一个t与第二抗原结合)、跨膜结构域和细胞内激活结构域。car可以激活免疫应答细胞，例如t细胞。在某些实施方式中，该系统还包括有包括亮氨酸拉链结构域的抑制性受体，其中抑制性受体与第三抗原结合，例如，包括与第三抗原结合的第三抗原结合结构域的抑制性受体。抑制性受体可以是膜结合的。抑制性受体可以是基于酪氨酸磷酸酶的抑制性受体。在某些实施方式中，酪氨酸磷酸酶选自ptprj、ptprc、ptpn22和ptpn6。在不存在第三抗原的情况下，抑制性受体例如通过去磷酸化来组成性地抑制car和/或使car失活。抑制性受体与第三抗原的结合阻止car被抑制性受体抑制和/或失活，例如，一经结合抑制性受体，抑制性受体便不抑制car。总之，抑制性受体是组成性抑制性的，但可以在存在第三抗原的情况下“关闭”(例如，抑制性受体的car抑制能力被关闭)。
[0275]
3.3.具有膜结合细胞因子和/或趋化因子的拉链构建体
[0276]
本公开的主题提供一种系统，其包括：a)本文公开的膜结合多肽(例如，包括跨膜结构域、细胞内结构域和包括第一二聚化结构域的细胞外结构域的膜结合多肽)和b)可溶性多肽(例如，包括能够与第一二聚化结构域二聚的第二二聚化结构域和细胞因子或趋化因子的可溶性多肽)。在某些实施方式中，第一二聚化结构域和第二二聚化结构域中的每一个均包括亮氨酸拉链结构域。
[0277]
在某些实施方式中，细胞因子选自il
‑
1、il
‑
2、il
‑
3、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12、il
‑
15、il
‑
17、il
‑
18、il
‑
21、il
‑
22及其组合。
[0278]
在某些实施方式中，趋化因子选自ccl1、ccl17、ccl8、ccl16、ccl18、ccl22及其组合。
[0279]
在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞外结构域还包括第三二聚化结构域，并且其中第二二聚化结构域能够在第一二聚化结构域和第三二聚化结构域之间的二聚之前与第一二聚化结构域二聚。
[0280]
3.4.本文公开的系统的共同特征
[0281]
本文公开的膜结合多肽或可溶性多肽的任何特征均可以应用于本文公开的系统，例如第3.1、3.2和3.3节中公开的系统。以下示例性特征适用于本文公开的任何系统，例如第3.1、3.2和3.3节中公开的系统。
[0282]
在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞外结构域还在第一二聚化结构域和第二二聚化结构域之间包括接头。在某些实施方式中，接头包括seq id no：3所示的氨基酸序列。
[0283]
在某些实施方式中，第一二聚化结构域包括seq id no：1、seq id no：2或seq id no：67所示的氨基酸序列，并且第二和第三二聚化结构域中的每一个均包括seq id no：2、seq id no：1或seq id no：67所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，当由相同细胞表达时，可溶性多肽和膜结合多肽能够形成二聚体。在某些实施方式中，可溶性多肽和膜结合多肽在由不同细胞表达时，由于膜结合多肽的第一二聚化结构域和第二二聚化结构域之间的
二聚，不能形成二聚体
[0284]
在某些实施方式中，膜结合多肽的细胞内结构域包括cd3
‑
ζ结构域、共刺激结构域或其组合。
[0285]
在某些实施方式中，系统还包括自杀模块。在某些实施方式中，自杀模块是诱导型胱天蛋白酶9多肽(icasp9)。
[0286]
在某些实施方式中，细胞外结构域还在第一二聚化结构域和跨膜结构域之间包括间隔区/铰链结构域。在某些实施方式中，间隔区/铰链结构域包括第一抗体的表位，其中抗体与表位的结合介导包括膜结合多肽的细胞的耗竭。在某些实施方式中，间隔区/铰链结构域包括thy1.1分子、环状cd20模拟表位或截短的egfr分子(egfrt)。
[0287]
在某些实施方式中，可溶性多肽的抗原结合结构域包括单链可变片段(scfv)、可溶性配体、细胞因子、非scfv类抗原识别基序或其组合。
[0288]
在某些实施方式中，膜结合多肽由第一载体表达。在某些实施方式中，可溶性多肽由第二载体表达。在某些实施方式中，第一载体和/或第二载体是病毒载体或基于转座子的载体。在某些实施方式中，第一载体与第二载体相同。
[0289]
在某些实施方式中，亮氨酸拉链结构域是正交拉链。
[0290]
在某些实施方式中，膜结合多肽和/或可溶性多肽还包括标签。在某些实施方式中，标签包括被第一抗体识别的表位标签。在某些实施方式中，表位标签选自myc
‑
标签、ha
‑
标签、flag
‑
标签、v5
‑
标签、t7
‑
标签及其组合。在某些实施方式中，标签包括与底物结合的亲和标签。在某些实施方式中，亲和标签选自his
‑
标签、strep
‑
标签、e
‑
标签、链霉亲和素结合蛋白标签(sbp
‑
标签)及其组合。
[0291]
在某些实施方式中，膜结合多肽和/或可溶性多肽还包括被抗体识别的模拟表位，其中抗体与模拟表位的结合介导包括膜结合多肽的细胞的耗竭。在某些实施方式中，模拟表位是cd20。
[0292]
3.5.示例性系统
[0293]
在某些实施方式中，膜结合多肽包括ee12rr345l亮氨酸拉链、myc标签、cd28共刺激结构域、cd3ζ多肽、e2a肽和thy1.1多肽。(无间隔区；仅有一短接头：aaasgsl[seq id no：94]；无myc染色)。在某些实施方式中，膜结合多肽包括seq id no：24。
[0294][0295]
在某些实施方式中，膜结合多肽包括ee12rr345l亮氨酸拉链、myc标签、cd28ec
‑
9c铰链、cd28共刺激结构域、cd3ζ多肽、e2a肽和thy1.1多肽。(cd28
‑
铰链9个氨基酸的间隔区；无myc染色)。
[0296]
在某些实施方式中，膜结合多肽包括seq id no：25。
[0297][0298]
在某些实施方式中，膜结合多肽包括v5标签、ee12rr345l亮氨酸拉链、igg1铰链、cd28共刺激结构域、cd3ζ多肽、e2a肽和thy1.1多肽。(igg1铰链间隔区。v5标签染色识别膜结合多肽的表面表达)。
[0299]
在某些实施方式中，膜结合多肽包括seq id no：26。
[0300][0301]
在某些实施方式中，膜结合多肽包括反向四环素控制的反式激活因子3(rtta3)、p2a肽、v5标签、ee12rr345l亮氨酸拉链、igg1铰链、cd28共刺激结构域、cd3ζ多肽、e2a肽和thyl.l多肽。(具有igg1铰链间隔区的四环素诱导型zipr
‑
car；含有rtta3四环素诱导型反式激活因子；zipr scfv载体含有自灭活逆转录病毒中的四环素应答元件tre3g序列。v5标签染色识别膜结合多肽的表面表达)。在某些实施方式中，膜结合多肽包括seq id no：27。
[0302][0303]
在某些实施方式中，膜结合多肽包括ee12rr345l亮氨酸拉链、myc标签、cd8ec铰链、cd28共刺激结构域、cd3ζ多肽、e2a肽和thy1.1多肽。(cd8间隔区；阳性myc染色)。在某些实施方式中，膜结合多肽包括seq id no：28。
[0304][0305]
在某些实施方式中，可溶性多肽包括cd19 scfv、flag标签、rr12ee345l亮氨酸拉链、t2a肽和蓝色荧光蛋白(bfp)。在某些实施方式中，可溶性多肽包括seq id no：29。
[0306][0307]
在某些实施方式中，系统包括cd19 scfv、flag标签、rr12ee345l亮氨酸拉链、p2a肽、cd20 scfv、第二flag标签、第二rr12ee345l亮氨酸拉链、t2a肽和蓝色荧光蛋白(bfp)。在某些实施方式中，该系统包括seq id no：30和31。
[0308][0309]
在某些实施方式中，系统包括cd19 scfv、flag标签、rr12ee345l亮氨酸拉链、p2a肽、cd20 scfv、第二flag标签、第二rr12ee345l亮氨酸拉链、e2a肽、il
‑
3多肽、第三flag标签、第三rr12ee345l亮氨酸拉链、t2a肽和蓝色荧光蛋白(bfp)。在某些实施方式中，系统包括seq id no：32和33。
[0310][0311]
在某些实施方式中，可溶性多肽包括与flag标记的rr12ee345l亮氨酸拉链融合的
小鼠il
‑
7多肽、e2a肽和蓝色荧光蛋白(bfp)。在某些实施方式中，可溶性多肽包括seq id no：34。
[0312][0313]
在某些实施方式中，可溶性多肽包括与flag标记的rr12ee345l亮氨酸拉链融合的小鼠il
‑
15多肽、e2a肽和蓝色荧光蛋白(bfp)，并且包括小鼠il
‑
2信号肽。在某些实施方式中，可溶性多肽包括seq id no：35。
[0314][0315]
在某些实施方式中，可溶性多肽包括与flag标记的rr12ee345l亮氨酸拉链融合的小鼠il
‑
21多肽、e2a肽和蓝色荧光蛋白(bfp)。
[0316]
在某些实施方式中，可溶性多肽包括seq id no：36。
[0317][0318]
在某些实施方式中，可溶性多肽包括与flag标记的rr12ee345l亮氨酸拉链融合的小鼠il
‑
21多肽、e2a肽和蓝色荧光蛋白(bfp)，并且包括小鼠il
‑
2信号肽。在某些实施方式中，可溶性多肽包括seq id no：37。
[0319][0320]
在某些实施方式中，系统包括小鼠il
‑
7多肽、rr12ee345l亮氨酸拉链、flag标签、p2a肽、sil
‑
15多肽、第二flag标签、第二rr12ee345l亮氨酸拉链、e2a肽和蓝色荧光蛋白
(bfp)。在某些实施方式中，系统包括seq id no：38。
[0321][0322]
在某些实施方式中，可溶性多肽包括与flag标记的rr12ee345l亮氨酸拉链融合的ccl1多肽。在某些实施方式中，可溶性多肽包括seq id no：87。
[0323][0324]
编码seq id no：87的氨基酸序列的示例性核苷酸序列如seq id no：88所示，其提供如下。
[0325][0326]
在某些实施方式中，可溶性多肽包括与flag标记的rr12ee345l亮氨酸拉链融合的ccl17多肽。在某些实施方式中，可溶性多肽包括seq id no：89。
[0327][0328]
编码seq id no：89的氨基酸序列的示例性核苷酸序列如seq id no：90所示，其提供如下。
[0329][0330]
在某些实施方式中，可溶性多肽包括与flag标记的rr12ee345l亮氨酸拉链融合的
ccl22多肽。在某些实施方式中，可溶性多肽包括seq id no：91。
[0331][0332]
编码seq id no：91的氨基酸序列的示例性核苷酸序列在如下提供的seq id no：92中给出。
[0333][0334]
亮氨酸拉链构建体中包括的元件的示例性序列如下。
[0335]
链间接头：sggggsdpeft[seq id no:93]
[0336]
2a肽序列：
[0337]
e2aqctnyallklagdvesnpgp[seq id no：39]f2avkqtlnfdllklagdvesnpgp[seq id no：40]p2aatnfsllkqagdveenpgp[seq id no：41]t2aegrgslltcgdveenpgp[seq id no：42]
[0338]
标签序列：
[0339]
flagdykddddk[seq id no：43]myceqkliseedl[seq id no：44]v5(额外的接头带下划线)gkpipnpllgldstggggsgggs[seq id no：45]
[0340]
信号肽序列：
[0341]
小鼠κ前导序列metdtlllwvlllwvpgstg[seq id no：46]小鼠cd8αmaspltrflslnllllgesiilgsgea[seq id no：47]小鼠il
‑
2mysmqlascvtltlvllvns[seq id no：48]小鼠il
‑
3mvlassttsihtmlllllmlfhlglq[seq id no：49]小鼠il
‑
7mfhvsfryifgipplilvllpvtss[seq id no：50]小鼠il
‑
21mertlvclvviflgtva[seq id no：51]
[0342]
其他序列：
[0343][0344]
4.细胞
[0345]
本公开的主题提供细胞，其包括本文公开的膜结合多肽、可溶性多肽和/或系统。在某些实施方式中，多肽和/或系统能够激活或抑制免疫应答细胞。在某些实施方式中，多肽和/或系统能够促进免疫应答细胞的抗肿瘤作用。细胞可以用多肽和/或系统转导，使得细胞共表达多肽和/或系统。在某些实施方式中，细胞是免疫应答细胞。细胞可以是淋巴谱系或髓系谱系的细胞。
[0346]
淋巴谱系的细胞可以产生抗体，调节细胞免疫系统，检测血液中的外来物，以及检测宿主中的外来细胞，等等。淋巴谱系的细胞的非限制性实例包括t细胞、b细胞、树突状细胞、自然杀伤(nk)细胞、可从中分化出淋巴样细胞的干细胞。在某些实施方式中，干细胞是多能干细胞。在某些实施方式中，多能干细胞是胚胎干细胞或诱导的多能干细胞。
[0347]
在某些实施方式中，细胞是t细胞。t细胞可以是在胸腺中成熟的淋巴细胞，主要负责细胞介导的免疫。t细胞参与适应性免疫系统。本公开的主题的t细胞可以是任何类型的t细胞，包括但不限于辅助t细胞、细胞毒性t细胞、记忆t细胞(包括中央记忆t细胞、干细胞样记忆t细胞(或干样记忆t细胞)和两种效应记忆t细胞：例如t
em
细胞和t
emra
细胞)、调节性t细胞(也称为抑制性t细胞)、自然杀伤t细胞、粘膜相关的不变性t细胞和γδt细胞。细胞毒性t细胞(ctl或杀伤t细胞)是能够诱导被感染的体细胞或肿瘤细胞死亡的t淋巴细胞的子集。通过引入本文公开的任何多肽或系统，可以对患者自身的t细胞进行基因修饰，以靶向特定抗原。t细胞可以是cd4
+
t细胞或cd8
+
t细胞。在某些实施方式中，t细胞是cd4
+
t细胞。在某些实施方式中，t细胞是cd8
+
t细胞。
[0348]
在某些实施方式中，细胞是自然杀伤细胞。自然杀伤(nk)细胞可以是淋巴细胞，它是细胞介导的免疫力的一部分，并在先天免疫应答中起作用。nk细胞不需要事先激活即可
对靶细胞执行细胞毒性作用。
[0349]
在某些实施方式中，细胞是人淋巴细胞。在某些实施方式中，人淋巴细胞包括但不限于外周供体淋巴细胞，例如，在以下文献中公开者：sadelain,m.等,2003,nat rev cancer 3:35
‑
45(公开了经基因修饰以表达car的外周供体淋巴细胞)；morgan,r.a.等,2006science 314:126
‑
129(公开了经基因修饰以表达包括α和β异二聚体的全长肿瘤抗原识别性t细胞受体复合物的外周供体淋巴细胞)；panelli,m.c.,等.2000j immunol 164:495
‑
504；panelli,m.c.,等.2000j immunol 164:4382
‑
4392(公开了源自肿瘤活组织检查中的肿瘤浸润淋巴细胞(til)的淋巴细胞培养物)；和dupont,j.,等.2005cancer res 65:5417
‑
5427；papanicolaou,g.a.,等.2003blood 102:2498
‑
2505(公开了使用人工抗原递呈细胞(aapc)或脉冲树突状细胞的选择性地在体外扩增的抗原特异性外周血白细胞)。细胞(例如，t细胞)可以是自体的、非自体的(例如，同种异体的)、或者在体外源自工程化祖细胞或干细胞。
[0350]
在某些实施方式中，细胞是髓系谱系的细胞。在某些实施方式中，髓系谱系的细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、红细胞和血小板。
[0351]
本公开的细胞能够调节肿瘤微环境。肿瘤具有微环境，其通过一系列机制利用恶性细胞抑制宿主的免疫反应，从而保护自身免受免疫监视、识别和消除。免疫抑制因子包括但不限于浸润调节性cd4
+
t细胞(treg)、髓样衍生抑制细胞(mdsc)、肿瘤相关巨噬细胞(tam)、包括tgf
‑
β的免疫抑制细胞因子以及靶向由激活的t细胞表达的免疫抑制受体(ctla
‑
4和pd
‑
1)的配体的表达。这些免疫抑制机制在维持耐受性和抑制不适当的免疫应答中起作用，但是在肿瘤微环境内，这些机制阻止了有效的抗肿瘤免疫应答。这些免疫抑制因子在遇到靶肿瘤细胞时可以共同诱导过继转移的修饰的t细胞(例如，car t细胞)的明显无反应性或凋亡。
[0352]
在某些实施方式中，本公开的细胞具有增强的细胞持久性(persistance)。在某些实施方式中，本公开的细胞具有降低的凋亡和/或无反应性。
[0353]
未纯化的ctl来源可以是本领域已知的任何来源，例如骨髓、胎儿、新生儿或成年或其他造血细胞来源，例如胎儿肝、外周血或脐带血。可以采用各种技术来分离细胞。例如，阴性选择方法可以最初除去非ctl。对于阳性和阴性选择，单克隆抗体(mab)对于鉴别与特定细胞谱系和/或分化阶段相关的标志物都特别有用。
[0354]
最初可以通过相对粗略的分离除去大部分末端分化的细胞。例如，最初可以使用磁珠分离来去除大量不相关的细胞。在某些实施方式中，在细胞分离之前将去除总造血细胞的至少约80％，通常至少约70％。
[0355]
分离方法包括，但不限于，密度梯度离心；重置；偶联至改变细胞密度的颗粒；用抗体包被的磁珠进行磁分离；亲和色谱；与mab结合或结合使用的细胞毒性剂，包括但不限于补体和细胞毒素；以及用附着在固体基质例如板、芯片上的抗体淘选，淘析(elutriation)，或任何其它方便的技术。
[0356]
分离和分析的技术包括，但不限于，流式细胞术，其可以具有不同的复杂程度，例如多个颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道。
[0357]
通过使用与死细胞相关的染料，例如碘化丙啶(pi)，可以将细胞与死细胞区分。在
某些实施方式中，将细胞收集在包括2％胎牛血清(fcs)或0.2％牛血清白蛋白(bsa)的培养基或任何其它合适的例如无菌的等渗培养基中。
[0358]
5.核酸组合物和载体
[0359]
本公开内容的主题提供核酸组合物，其包括编码本文公开的膜结合多肽(例如，在第1节中公开)的第一多核苷酸和编码本文公开的可溶性多肽(例如，在第2节中公开)的第二多核苷酸。还提供包括此类核酸组合物的细胞。
[0360]
在某些实施方式中，由第一多核苷酸编码的膜结合多肽包括：i)跨膜结构域，ii)细胞内结构域，和iii)包括第一二聚化结构域和阻断间隔区的细胞外结构域，由第二多核苷酸编码的可溶性多肽包括：i)第二二聚化结构域，和ii)与抗原结合的抗原结合结构域。在某些实施方式中，第一二聚化结构域和第二二聚化结构域中的每一个均包括亮氨酸拉链结构域，并且当膜结合多肽和可溶性多肽不是由相同细胞表达时，阻断间隔区阻止膜结合多肽与可溶性多肽的二聚。
[0361]
在某些实施方式中，由第一多核苷酸编码的膜结合多肽包括：i)跨膜结构域，ii)细胞内结构域，和iii)包括第一二聚化结构域和能够与第一二聚化结构域二聚的第二二聚化结构域的细胞外结构域，由第二多核苷酸编码的可溶性多肽包括：i)能够与第一二聚化结构域二聚的第三二聚化结构域，和ii)与抗原结合的抗原结合结构域。在某些实施方式中，第一二聚化结构域和第二二聚化结构域中的每一个均包括亮氨酸拉链结构域。
[0362]
在某些实施方式中，由第一多核苷酸编码的膜结合多肽包括跨膜结构域和包括第一二聚化结构域的细胞外结构域，由第二多核苷酸编码的可溶性多肽包括能够与第一二聚化结构域二聚的第二二聚化结构域和细胞因子或趋化因子。在某些实施方式中，第一二聚化结构域和第二二聚化结构域中的每一个均包括亮氨酸拉链结构域。
[0363]
在某些实施方式中，第一多核苷酸包括在第一载体中，第二多核苷酸包括在第二载体中。在某些实施方式中，第一载体和/或第二载体是病毒载体或基于转座子的载体。在某些实施方式中，病毒载体是逆转录病毒载体。在某些实施方式中，逆转录病毒载体是慢病毒载体。第一载体可以与第二载体相同，或者与第二载体不同。在某些实施方式中，第一载体与第二载体相同，例如，第一载体和第二载体的载体主链可以相同，而由第一载体和第二载体编码/表达的多肽或蛋白质可以不同。
[0364]
细胞(例如，t细胞)的基因修饰可以通过将基本上均质的细胞组合物用重组dna构建体转导来实现。在某些实施方式中，逆转录病毒载体用于将dna构建体引入细胞。例如，可以将编码本文公开的任何多肽或系统的多核苷酸克隆到逆转录病毒载体中，表达可以由其内源性启动子、由逆转录病毒长末端重复序列、或者由对关注的靶细胞类型具有特异性的启动子来驱动。在某些实施方式中，逆转录病毒载体是γ
‑
逆转录病毒载体。在某些实施方式中，逆转录病毒载体是慢病毒载体。也可以使用非病毒载体。
[0365]
对于细胞的初始基因修饰以包括本文公开的多肽和/或系统，通常使用逆转录病毒载体用于转导，然而也可以使用任何其他合适的病毒载体或非病毒递送系统。多肽和/或系统可以构建在单个多顺反子表达盒中，单个载体的多个表达盒中，或者多个载体中。产生多顺反子表达盒的元件的实例包括，但不限于，各种病毒和非病毒内部核糖体进入位点(ires，例如，fgf
‑
1ires、fgf
‑
2ires、vegf ires、igf
‑
ii ires、nf
‑
κb ires、runx1 ires、p53 ires、甲型肝炎ires、丙型肝炎ires、瘟病毒ires、口蹄疫病毒ires、小核糖核酸病毒
ires、脊髓灰质炎病毒ires和脑心肌炎病毒ires)和可裂解的接头(例如2a肽，例如p2a、t2a、e2a和f2a肽)。逆转录病毒载体和合适的包装系的组合也是合适的，其中衣壳蛋白将会对于感染人细胞起作用。各种产生双嗜性(amphotropic)病毒的细胞系是已知的，其包括，但不限于，pa12(miller等，(1985)mol.cell.biol.5:431
‑
437)；pa317(miller等，(1986)mol.cell.biol.6:2895
‑
2902)；和crip(danos等，(1988)proc.acad.sci.usa 85:6460
‑
6464)。非双嗜性粒子也是合适的，例如，用vsvg、rd114或galv包膜假型化的粒子和本领域已知的任何其它粒子。
[0366]
可能的转导方法还包括细胞与生产细胞(producer cell)的直接共培养，例如通过bregni等.(1992)blood 80:1418
‑
1422的方法，或者在存在或不存在适当生长因子和聚阳离子的情况下用单独的病毒上清液或浓缩的载体原液(stocks)培养，例如通过xu等.(1994)exp.hemat.22:223
‑
230；和hughes等.(1992)j.clin.invest.89:1817的方法。
[0367]
可以使用其它的转导病毒载体来修饰细胞。在某些实施方式中，所选择的载体表现出高的感染效率、向宿主细胞基因组中的稳定整合和重组基因产物的持久表达(参见，例如，cayouette等,human gene therapy 8:423
‑
430,1997；kido等,current eye research 15:833
‑
844,1996；bloomer等,journal of virology 71:6641
‑
6649,1997；naldini等,science 272:263
‑
267,1996；和miyoshi等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.94:10319,1997)。可以使用的其它病毒载体包括，例如，腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体、牛痘病毒、牛乳头状瘤病毒或疱疹病毒，例如爱泼斯坦
‑
巴尔(epstein
‑
barr)病毒(也参见，例如，以下文献中的病毒：miller,human gene therapy 15
‑
14,1990；friedman,science 244:1275
‑
1281,1989；eglitis等,biotechniques 6:608
‑
614,1988；tolstoshev等,current opinion in biotechnology 1:55
‑
61,1990；sharp,the lancet 337:1277
‑
1278,1991；cornetta等,nucleic acid research and molecular biology 36:311
‑
322,1987；anderson,science 226:401
‑
409,1984；moen,blood cells 17:407
‑
416,1991；miller等,biotechnology 7:980
‑
990,1989；legal la salle等,science 259:988
‑
990,1993；和johnson,chest l07:77s
‑
83s,1995)。逆转录病毒载体的开发特别充分，已用于临床机构(rosenberg等,n.engl.j.med 323:370,1990；anderson等,u.s.pat.no.5,399,346)。
[0368]
非病毒方法也可以用于细胞的基因修饰。例如，通过在脂质转染(feigner等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.84:7413,1987；ono等,neuroscience letters 17:259,1990；brigham等,am.j.med.sci.298:278,1989；staubinger等,methods in enzymology 101:512,1983)、脱唾液酸血清类粘蛋白
‑
聚赖氨酸缀合(wu等,journal of biological chemistry 263:14621,1988；wu等,journal of biological chemistry 264:16985,1989)的存在下，或者通过手术条件下的微注射(wolff等,science 247:1465,1990)施用核酸，将核酸分子引入细胞中。其它非病毒的基因转移方式包括使用磷酸钙、deae葡聚糖、电穿孔和原生质体融合的体外转染。脂质体也可能对将dna递送到细胞中有益。也可以通过将正常核酸离体转移到可培养的细胞类型(例如，自体的或异源的原代细胞或其后代)中来完成将正常基因移植到受试者的受影响组织中，之后，将细胞(或其后代)注射到目标组织中或全身注射。重组受体也可以使用转座酶或靶向核酸酶(例如锌指核酸酶、大范围核酸酶或tale核酸酶、crispr)衍生或获得。瞬时表达可通过rna电穿孔获得。在某些实施方式中，重组受体可以通过基于转座子的载体引入。在某些实施方式中，基于转座子的载体包括转座子(又称
可转座元件)。在某些实施方式中，转座子可以被转座酶识别。在某些实施方式中，转座酶是睡美人转座酶(sleeping beauty transposase)。
[0369]
所得细胞可以在与未修饰的细胞相似的条件下生长，由此修饰的细胞可以被扩增并用于多种目的。
[0370]
6.多肽和类似物
[0371]
本公开主题中还包括修饰成当在细胞中表达时增强其治疗功效的cd28、cd8、cd80、4
‑
1bbl和cd3ζ多肽，本文公开的膜结合多肽，以及本文公开的可溶性多肽或其片段。本公开的主题提供通过产生序列改变来优化氨基酸序列或核酸序列的方法。这样的改变可以包括某些突变、缺失、插入或翻译后修饰。本文公开的主题还包括本文公开的任何天然存在的多肽(包括，但不限于，cd8、cd28、cd80、4
‑
1bbl和cd3ζ)的类似物。类似物可以通过氨基酸序列差异、通过翻译后修饰或通过两者与本文公开的天然存在的多肽不同。类似物可表现出与本公开主题的天然存在的氨基酸序列的全部或部分具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％的同源性。序列比较的长度是至少5、10、15或20个氨基酸残基，例如至少25、50或75个氨基酸残基，或超过100个氨基酸残基。同样，在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用blast程序，其概率得分在e
‑3和e
‑
100
之间，指示密切相关的序列。修饰包括多肽的体内和体外化学衍生，例如乙酰化、羧化、磷酸化或糖基化；这样的修饰可以在多肽合成或加工过程中或在用分离的修饰酶处理之后发生。类似物也可以通过一级结构(primary sequence)的改变而不同于天然存在的多肽。这些包括天然的和诱导的基因变异(例如，由通过辐射或暴露于乙烷甲基硫酸盐(ethanemethylsulfate)的随机诱变或者通过定点诱变引起，如以下文献中所述：sambrook,fritsch和maniatis,molecular cloning:a laboratory manual(分子克隆：实验室手册)(第2版)，csh press,1989或ausubel等，同上)。另外还包括环化的肽、分子和类似物，其含有除l
‑
氨基酸以外的残基，例如d
‑
氨基酸或非天然存在的或合成的氨基酸，例如β或γ氨基酸。
[0372]
除了全长多肽，本公开主题还提供本文公开的任何多肽或肽结构域的片段。如本文所用，术语“片段”是指至少5、10、13或15个氨基酸。在某些实施方式中，片段包括至少20个连续氨基酸、至少30个连续氨基酸或至少50个连续氨基酸。在某些实施方式中，片段包括至少60至80、100、200、300或更多个连续氨基酸。片段可以通过本领域技术人员已知的方法产生，或者可以由正常的蛋白质加工产生(例如，从初生多肽中去除生物活性不需要的氨基酸，或者通过另外可选的mrna剪接或另外可选的蛋白质加工事件去除氨基酸)。
[0373]
非蛋白质类似物具有设计成模仿本文公开的蛋白质/肽的功能活性的化学结构。这样的类似物可能超过原始多肽的生理活性。类似物设计的方法在本领域中是众所周知的，并且可以根据这样的方法通过修饰化学结构来进行类似物的合成，以使所得的类似物在细胞中表达时增加原始多肽的抗肿瘤活性。这些化学修饰包括，但不限于，取代替代的r基团和改变参考多肽的特定碳原子处的饱和度。在某些实施方式中，蛋白质类似物对体内降解具有相对抗性，在施用时导致更持久的治疗效果。用于测量功能活性的测定包括但不限于以下实施例中描述的那些。
[0374]
7.给药
[0375]
可以将包括本公开的细胞的组合物系统地或直接提供给受试者，以诱导和/或增
强对抗原的免疫应答和/或治疗和/或预防肿瘤、病原体感染或感染性疾病。在某些实施方式中，将本公开的细胞或包括其的组合物直接注射到所关注的器官(例如，受肿瘤影响的器官)中。另外可选地，例如通过向循环系统(例如，肿瘤脉管系统)中给药，将本公开的细胞或包括其的组合物间接地提供给所关注的器官。在施用细胞或组合物之前、期间或之后，可以提供扩增和分化剂，以在体外或体内增加t细胞、nk细胞或ctl细胞的产生。
[0376]
可以在任何生理上可接受的载体中内施用本公开的细胞，通常是血管内给药，但也可以将它们引入骨骼或其它方便的部位，其中细胞可以找到合适的再生和分化部位(例如胸腺)。通常，将施用至少约1
×
105个细胞，最终达到约1
×
10
10
个或更多。本公开的细胞可以包括纯化的细胞群。本领域技术人员可以使用各种众所周知的方法，例如荧光激活细胞分选(facs)，容易地确定群体中本公开的细胞的百分比。在包括本公开的细胞的群体中，纯度的合适范围是约50％至约55％、约5％至约60％、以及约65％至约70％。在某些实施方式中，纯度为约70％至约75％、约75％至约80％、或约80％至约85％。在某些实施方式中，纯度为约85％至约90％、约90％至约95％、以及约95％至约100％。剂量可以由本领域技术人员容易地调节(例如，纯度降低可能需要增加剂量)。可以通过注射、导管等引入细胞。
[0377]
本公开的组合物可以是包括本公开的细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。给药可以是自体的或异体的。例如，可以从一个受试者获得细胞，并将其施用于相同受试者或不同的相容受试者。外周血来源的细胞或其后代(例如，体内、离体或体外来源)可以经由局部注射施用，包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外给药。当施用本公开的主题的治疗性组合物(例如，包括本公开的细胞的药物组合物)时，可以将其配制成单位剂量可注射形式(溶液剂、悬浮剂、乳剂)。
[0378]
8.制剂
[0379]
包括本公开的细胞的组合物可以方便地以无菌液体制剂的形式提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳剂、分散剂或粘性组合物，其可以缓冲至选定的ph。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物在某种程度上更方便施用，尤其是通过注射。另一方面，可以在适当的粘度范围内配制粘性组合物，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包括载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，其含有，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。
[0380]
可以通过将细胞掺入所需量的适当溶剂中，并根据需要掺入不同量的其它成分来制备无菌注射溶液。这样的组合物可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等混合。组合物也可以是冻干的。组合物可以含有辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、ph缓冲剂、胶凝剂或增粘剂、防腐剂、矫味剂、颜料等，其取决于给药途径和所需制剂。可以参考标准文本，例如“remington's pharmaceutical science”，1985年第17版，以制备合适的制剂而无需进行过多的实验，在此将上述标准文本引入作为参考。
[0381]
可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，其包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，确保防止微生物的作用。通过使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶，可以延长可注射药物形式的吸收。然而，根据本公开的主题，所使用的任何媒介物、稀
释剂或添加剂将必须与细胞或其祖细胞相容。
[0382]
组合物可以是等渗的，即它们可以具有与血液和泪液相同的渗透压。组合物的所需等渗性可以使用氯化钠或其它药学上可接受的试剂例如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其它无机或有机溶质来实现。氯化钠可以特别适用于含有钠离子的缓冲剂。
[0383]
如果需要，可使用药学上可接受的增稠剂将组合物的粘度保持在选定水平。例如，甲基纤维素容易且经济地获得并且易于使用。其它合适的增稠剂包括，例如，黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的浓度可以取决于选择的试剂。重要的是要使用能够达到所选粘度的用量。显然，合适载体和其它添加剂的选择将取决于确切的给药途径和特定剂型的性质，例如液体剂型(例如，是否将组合物配制成溶液剂、悬浮液、凝胶剂或其它液体形式，例如定时释放形式或液体填充形式)。
[0384]
对于所治疗的受试者，要施用的细胞数量将有所不同。在一实施方式中，将104至约10
10
、约105至约109、或约106至约108的本公开的细胞施用于人受试者。可以以更少的数量施用更有效的细胞。在某些实施方式中，将至少约1
×
108、约2
×
108、约3
×
108、约4
×
108、或约5
×
108的本公开的细胞施用于人受试者。可以根据每个受试者的个体因素，包括其大小、年龄、性别、体重和具体受试者的状况，来精确地确定将被视为有效的剂量。本领域技术人员从本公开和本领域知识中可以容易地确定剂量。
[0385]
本领域技术人员可以容易地确定组合物中的和在方法中施用的细胞和任选的添加剂、媒介物和/或载体的量。通常，(除活性细胞和/或试剂以外的)任何添加剂在磷酸盐缓冲盐水中的存在量为0.001％至50％(重量)溶液，并且活性成分以微克至毫克的数量级存在，例如约0.0001wt％至约5wt％、约0.0001wt％至约1wt％、约0.0001wt％至约0.05wt％或约0.001wt％至约20wt％、约0.01wt％至约10wt％或约0.05wt％至约5wt％。对于要施用于动物或人的任何组合物，可以确定如下：毒性，例如通过在合适的动物模型例如啮齿类动物如小鼠中确定致死剂量(ld)和ld50；组合物的剂量，其中的组分浓度和引起合适反应的施用组合物的时机。根据技术人员的知识、本公开和本文引用的文献，这些确定不需要过度的实验。并且，可以确定连续给药的时间而无需过多的实验。
[0386]
9.治疗方法
[0387]
本公开的主题提供在对其有需要的受试者中诱导和/或增加免疫应答的方法。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的细胞或包括此类细胞的药物组合物。本文公开的细胞和包括其的组合物可以用于治疗和/或预防受试者中的肿瘤。本公开的细胞和包括其的组合物可以用于延长患有肿瘤的受试者的存活。本公开的细胞和包括其的组合物也可以用于治疗和/或预防受试者诸如免疫功能低下的人受试者中的病原体感染或其它感染性疾病。这些方法包括施用有效量的本公开的细胞或包括这些细胞的组合物(例如药物组合物)，以达到期望的效果，无论是减轻现有病症还是预防复发。对于治疗来说，施用的量是有效产生所需效果的量。可以一次或多次给药来提供有效量。可以大剂量(bolus)或通过连续灌注来提供有效量。
[0388]“有效量”(或“治疗有效量”)是足以在治疗后产生有益或期望的临床结果的量。可以以一剂或多剂剂量将有效量施用于受试者。就治疗而言，有效量是足以缓解、改善、稳定、逆转或减慢疾病进展或以其它方式减少疾病病理后果的量。有效量通常由医师根据具体情况确定，并且在本领域技术人员的能力范围内。当确定合适的剂量以达到有效量时，通常要
考虑若干因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重、所治疗的疾病、疾病的严重程度以及所施用的细胞的形式和有效浓度。
[0389]
对于使用抗原特异性t细胞的过继免疫疗法，通常输注约106‑
10
10
范围内(例如约109)的细胞剂量。一经将本公开的细胞施用于宿主并随后分化，诱导特异性针对特定抗原的t细胞。修饰的细胞可以通过本领域已知的任何方法施用，其包括，但不限于，静脉内、皮下、结内、肿瘤内、鞘内、胸膜内、腹膜内以及直接向胸腺给药。
[0390]
本公开的主题提供用于治疗和/或预防受试者中的肿瘤的方法。该方法可以包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的本公开的细胞或包括这些细胞的组合物(例如药物组合物)。
[0391]
肿瘤的非限制性实例包括血液癌症(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、结肠癌、肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、胶质母细胞瘤、喉癌、黑素瘤、神经母细胞瘤、腺癌、神经胶质瘤、软组织肉瘤和各种癌(包括前列腺癌和小细胞肺癌)。可以用包括本文公开的系统的细胞治疗的其他癌包括肿瘤学领域中已知的任何癌，其包括，但不限于，星形细胞瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、少突神经胶质瘤(oligodenroglioma)、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、原始神经外胚层肿瘤(pnet)、软骨肉瘤、成骨肉瘤、胰腺导管腺癌、小细胞和大细胞肺腺癌、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌(bronchoalveolarcarcinoma)、上皮腺癌(epithelial adenocarcinoma)及其肝转移、淋巴管肉瘤、淋巴管内膜肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、肝癌、胆管癌、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、基底细胞癌、汗腺瘤、乳头状癌、皮脂腺癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、wilms’肿瘤、睾丸肿瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、白血病、多发性骨髓瘤、waldenstrom’s巨球蛋白血症和重链疾病、诸如导管和小叶腺癌的乳腺肿瘤、子宫颈的鳞状和腺癌、子宫和卵巢上皮癌、前列腺腺癌、膀胱移行鳞状细胞癌、b和t细胞淋巴瘤(结节性和弥漫性)浆细胞瘤、急慢性白血病、恶性黑素瘤、软组织肉瘤和平滑肌肉瘤。在某些实施方式中，肿瘤选自血液癌症(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、结肠癌、肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、成胶质细胞瘤和喉癌。在某些实施方式中，本公开的细胞和包括其的组合物可以用于治疗和/或预防不适合于常规治疗措施的血液癌症(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)或卵巢癌。
[0392]
受试者可以患有疾病的晚期形式，在这种情况下，治疗目标可以包括缓解或逆转疾病进展和/或减轻副作用。受试者可以具有已经对其进行过治疗的病史，在这种情况下，治疗目标通常包括降低或延迟复发风险。
[0393]
治疗的合适的人受试者通常包括可以通过临床标准区分的两个治疗组。患有“晚期疾病”或“高肿瘤负荷”的受试者是携带临床上可测量的肿瘤的受试者。临床上可测量的肿瘤是可以根据肿瘤瘤体检测的肿瘤(例如，通过触诊、cat扫描、超声检查、乳房x线影像或x射线；单独的阳性生化或组织病理学标志物不足以识别该人群)。将药物组合物施用于这些受试者，以引发抗肿瘤反应，目标为减轻其状况。理想地，结果是减小了肿瘤瘤体，但是任何临床改善均构成受益。临床改善包括降低风险或进展速度或减轻肿瘤的病理后果。
[0394]
第二组合适的受试者在本领域中称为“辅助组”。这些受试者是有肿瘤史但对另一
(gait，1984)；“动物细胞培养(animal cell culture)”(freshney，1987)；“酶学方法(methods in enzymology”“实验免疫学手册(handbook of experimental immunology)”(weir，1996)；“哺乳动物细胞的基因转移载体(gene transfer vectors for mammalian cells)”(miller和calos，1987年)；“分子生物学的最新方法(current protocols in molecular biology)”(ausubel，1987)；“pcr：聚合酶链反应(pcr:the polymerase chain reaction)”(mullis，1994)；“免疫学最新方法(current protocols in immunology)”(coligan，1991年)。这些技术适用于本文公开的多核苷酸和多肽的产生，并且因此可以在制备和实施本发明中予以考虑。在以下部分中将讨论用于具体实施例的特别有用的技术。
[0403]
提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供有关如何制备和使用本公开的系统和方法的完整公开和描述，而不旨在限制发明人认为的他们的发明的范围。
[0404]
实施例1
‑
具有scfv亮氨酸拉链分选亲和标签的嵌合抗原受体
[0405]
开发基于亮氨酸拉链的二元亲和标签系统，以允许细胞的选择性分选并同时与两个病毒载体共转导，以允许转移更大量的遗传信息而不会超出病毒的包装限制。在该系统中，一种病毒载体编码连接有亲和标签(例如flag、streptag、myc等)的亮氨酸拉链(例如rr12ee345l)(图1)。第二病毒载体编码具有高度最适性(predilection)的膜结合亮氨酸拉链(例如，ee12rr345l)，以与rr12ee345l
‑
亲和标签亮氨酸拉链形成异二聚体。当共转导到相同靶细胞中时，发生膜结合ee12rr345l亮氨酸拉链对rr1ee2345l
‑
亲和标签的表面捕获，从而允许通过流式细胞术和使用与对亲和标签特异性抗体缀合的磁珠的免疫磁选对亲和标签进行表面检测。
[0406]
开发二元car系统，其中通用接合体(universal adaptor)car可以与scfv分子在细胞外配对，以产生能够通过基因修饰的t细胞靶向肿瘤细胞的功能性car分子。上述基于亮氨酸拉链的分选策略用于用两个载体来改造t细胞。载体1编码对多个肿瘤抗原具有特异性的多个scfv
‑
亲和标签
‑
亮氨酸拉链(例如rr12ee345l)，以通过肿瘤相关抗原的下调来限制肿瘤免疫逃逸。载体2编码基于亮氨酸拉链的car(有时也称为基于亮氨酸拉链受体的car，“zipr
‑
car”)(例如ee1rr345l:cd28ζ)，以及其他分子，其包括，但不限于：基于简并亮氨酸拉链的ccr(如下所述)、细胞因子和自杀基因(图1和2)。如图1所示，阻断的亮氨酸拉链car(“zipr
‑
car”)构建体允许对用scfv
‑
亲和标记的亮氨酸拉链转导的细胞进行分选，并将scfv的表面表达限制于双重转导的细胞。未阻断的亮氨酸拉链car允许在细胞外提供scfv(注入宿主或从其他细胞递送)。亮氨酸拉链car载体可以编码多个基因，其包括细胞因子、自杀基因、共刺激分子等。scfv载体可以编码至少4种抗原特异性。某些zipr
‑
car似乎固有地被阻断，不需要表达额外连接的阻断亮氨酸拉链(右图)，以避免细胞外配对途径(“涂染”)。参见例如图3和6。如图3所示，涂染zipr
‑
car能够从介质中捕获可溶性标记的异二聚化亮氨酸拉链。非涂染亮氨酸拉链仅可以在t细胞内部生产过程中获得标记的异二聚化亮氨酸拉链。其他合适的间隔区包括cd28铰链、非二聚cd8和igg1。其他合适的标签包括strep
‑
标签、ha
‑
标签、his
‑
标签等。如图6所示，cd19/cd20 scfv载体促进了ee
‑
car对cd19或cd20
+
细胞的杀伤，并且仅有myc
‑
标签的间隔区导致了靶标杀伤效果。表达双重cd19/cd20scfv
‑
flag
‑
rr12ee345l/ee
‑
car复合物的小鼠t细胞能够特异性地杀伤表达cd19或cd20的靶细胞(或门)。与较大的cd8细胞外结构域铰链间隔区相比，缺少间隔区的zipr
‑
car促进了增强的靶标杀伤作用。
[0407]
基于亮氨酸拉链的car可以包括“自阻断”特征，以允许选择性地分选用载体1和载体2共转导的t细胞。在某些情况下，zipr
‑
car是自阻断的，没有添加连接的异二聚化拉链(请参见图1、3和5)。例如，如图5所示，尽管在bfp+thy1.1+群体中flag标签的染色强度相同，但flag标签并不经由细胞外分泌结合至igg1间隔区zipr
‑
car(参见图5的左中图)。由于不存在“涂染的”细胞群体，具有igg1间隔区的绝对flag+细胞较少(参见图5的下图)。当共整合到相同的t细胞中时，载体1和载体2导致与zipr
‑
car结合的亲和标记的scfv的表达，从而导致表达结合scfv的抗原的靶标的杀伤(参见图4、6、7和9)。如图4所示，检测了各种标签的表达，其中cd19 scfv被捕获；并且t细胞能够杀伤cd19
+
靶标。自阻断功能允许在单一t细胞中选择性地表达基因限定的一组亮氨酸拉链scfv，其不能明显地结合外源性分泌或注入的拉链scfv。另外，自阻断功能允许对已整合scfv载体和zipr
‑
car载体的t细胞进行分选。如图7所示，cd19/cd20scfv载体促进了ee
‑
car对cd19或cd20
+
细胞的杀伤，并且仅有myc
‑
标签的间隔区促进了较大的cd19靶标的靶向杀伤。如图9所示，cd19/cd20/il
‑
3scfv载体促进了ee
‑
car对表达cd19、cd20或cd123/cd131(il
‑
3r)的细胞的杀伤。特别是，cd19/cd20 scfv+zipr
‑
car t细胞能够杀伤cd19+和cd20+靶标(靶向小鼠b细胞和b细胞白血病)。参见图9。il
‑
3拉链因子(zipperkine)+zipr
‑
car t细胞能够杀伤il
‑
3r+靶标(靶向小鼠早期髓样细胞和b细胞和急性髓性白血病)。参见图9。与cd19、cd20和il3r
+
靶标相比，无间隔区和igg1 zipr
‑
car促进了等同的裂解。参见图9。
[0408]
开发膜结合亮氨酸拉链的新设计，其可以抑制其他细胞分泌的可溶性标记的亮氨酸拉链的结合，但仍允许内部产生的标记拉链的结合，而没有实施例1中所述的自阻断特征。这种膜结合多肽包括非常小的细胞外结构域，例如包括不超过20个氨基酸残基的间隔区/铰链结构域，其排除了抗体表位(如thy1.1或egfrt)。例如，包括cd8间隔区的膜结合亮氨酸拉链多肽表现出可溶性scfv亮氨酸拉链的结合，所述可溶性scfv亮氨酸拉链由表达膜结合多肽的相同细胞以及由其他细胞表达。然而，包括截短的cd28 9氨基酸间隔区或igg1铰链的膜结合亮氨酸拉链多肽仅结合在与膜结合多肽相同的细胞中表达的可溶性scfv亮氨酸拉链。
[0409]
图25a
‑
25c进一步表明四环素诱导的zipr
‑
car系统能够实现药物诱导的zipr
‑
car表达和双转导细胞的macs分选。将原代t细胞用两个载体双重转导：(1)含有四环素应答元件(tre3g)的自灭活逆转录病毒，该四环素应答元件驱动用flag标记并与rr12ee345l亮氨酸拉链融合的cd19和cd20 scfv的表达，和(2)编码固有阻断的igg1
‑
铰链zipr
‑
car、rtta3(tet反式激活因子)和thy1.1的逆转录病毒(图25a)。基于flag对细胞进行macs分选，以获得高纯度的zipr
‑
car群体(图25b)。在强力霉素(scfvs诱导)的存在下，具有cd19和cd20 scfv亮氨酸拉链的zipr
‑
car表达t细胞优先杀伤cd19和cd20阳性靶标(图25c)。在高e:t比下，由于启动子的基础活性，在不存在强力霉素的情况下，cd20 scfv观察到靶标裂解(见右图a)。将t细胞与bm185萤火虫荧光素酶转导的具有cd19或cd20表达的靶标一起孵育。24小时后，将靶标存活率评估为残留的萤光素酶活性。
[0410]
实施例2
‑
基于亮氨酸拉链的嵌合共刺激受体(ccr)，其被缀合有亮氨酸拉链和分选亲和标签的分泌的免疫检查点阻断scfv激活
[0411]
嵌合共刺激受体(ccr)包括scfv和共刺激结构域，但缺少zap70结合基序，例如cd3ζ。ccr可以诱导对t细胞的抗原特异性共刺激，而不发送tcr样信号，因此并不会激活t细胞
杀伤功能。传统上，这些分子包括单个scfv，并且限于单个靶抗原。但是，它们可以使用异二聚化亮氨酸拉链来设计，以结合多个zipper
‑
scfv(图10和11)。如图10所示，基于亮氨酸拉链的car和ccr从同一组scfv诱导cd3ζ信号传导和共刺激信号传导。t细胞可以改造成表达zipr
‑
car和zipr
‑
ccr，以响应于共享的scfv结合的相同抗原来促进增强的共刺激作用(即zipr
‑
car和zipr
‑
ccr在该系统中使用相同的亮氨酸拉链)。参见图10。zipr
‑
car结合一组不同的scfv，zipr
‑
ccr也可以用于实现与门(and
‑
gate)行为，例如，与rr12ee345l和ee12rr345l相比，使用fos/jun或fos/synzip异二聚体。参见图10。图11显示基于cd137共刺激信号传导结构域的zipr
‑
ccr，及其在tclip杂交瘤中的表达。其他合适的共刺激信号传导结构域包括，但不限于，cd28、icos等。
[0412]
在临床前和临床研究中均已显示，抗体介导的免疫调节检查点分子(例如pd
‑
l1、ctla
‑
4、cd200、tim
‑
3、b7
‑
h3和b7
‑
h4)的阻断，通过阻断递送给t细胞的负性共刺激信号来促进针对肿瘤的免疫反应。用抗体阻断这些分子的另外可选的方法是，通过表达与免疫调节检查点配体结合、并且递送正性共刺激信号的ccr来改造t细胞。然而，该方法受到单个细胞中可表达的ccr蛋白质数量的限制。
[0413]
为了克服该限制，开发双载体系统来修饰t细胞，以表达对多个免疫调节检查点配体(例如，pd
‑
l1、cd200和b7
‑
h4)具有特异性的scfv
‑
亲和标签
‑
亮氨酸拉链(例如，rr12ee345l)，其具有相应的基于亮氨酸拉链的ccr(例如ee1rr2345l:cd137)(图12
‑
14)。图12示出基于zipr的ccr，其具有结合的检查点阻断和t细胞共刺激信号传导。t细胞可以改造成分泌与zipr
‑
ccr结合的scfv
‑
亲和标签
‑
亮氨酸拉链。一种方法涉及分泌scfv，该scfv可以阻断免疫调节检查点，例如pd
‑
l1，并经由转换受体机制将响应于这些分子而正常转导的负性信号转换成正性共刺激信号。图13显示了靶向多种抑制性配体的结合的检查点阻断和共刺激转换受体。负性共刺激配体被分泌的scfv
‑
亮氨酸拉链阻断。zipr
‑
ccr将负信号转换为正共刺激信号。多重zipr
‑
ccr平台允许多种免疫检查点配体被阻断并且被转换成正性信号分子。如图14所示，表达靶向免疫检查点的典型car的t细胞能够杀伤免疫检查点分子阳性的靶标，其验证了针对免疫检查点的scfv。
[0414]
该系统的优点包括：(1)允许靶向和阻断多种免疫检查点途径；(2)响应于肿瘤细胞或耗尽的t细胞，将负性信号转化成正性共刺激信号；以及(3)允许表达构建体的t细胞的高纯度分选。ccr信号传导结构域可以包括多个类别的共刺激分子，其包括，但不限于：cd28家族成员(cd28、icos)、tnf超家族成员(cd134、cd137)和stat3/stat5激活序列。该系统可以增强改造的以及内源性的免疫应答。
[0415]
实施例3
‑
基于亮氨酸拉链的嵌合共刺激受体(ccr)，其被分泌的缀合有亮氨酸拉链和分选亲和标签的细胞因子融合物激活
[0416]
t细胞可以经由反式呈递来接收细胞因子信号，其中另一种细胞经由表面呈递将细胞因子递送至t细胞(例如，il
‑
15)。另外，人工抗原呈递细胞已改造成将例如il
‑
15和il
‑
21的细胞因子反式递呈至t细胞用于体外扩增。
[0417]
本公开的主题提供附加至细胞因子例如il
‑
3、il
‑
7、il
‑
15、il
‑
18或il
‑
21的亮氨酸拉链，以局部提供t细胞递送的细胞因子刺激(图8)。如图8所示，il
‑
3“拉链因子”将zipr
‑
car转化成基于il
‑
3的受体。il
‑
3“拉链因子”包括具有c
‑
端flag
‑
标签的il
‑
3细胞因子和rr12ee345l亮氨酸拉链。il
‑
3拉链因子被zipr
‑
car捕获，并反式呈递到t细胞的表面，以产
生可以靶向表达il
‑
3r复合物的细胞的受体。通过激活zipr
‑
ccr，细胞因子:细胞因子
‑
受体相互作用激活ccr，并导致双向激活(图15和16)，其激活zipr
‑
ccr转导的t细胞以及肿瘤微环境中的内源性t细胞，从而引起内源性t细胞应答。图15显示基于zipr的ccr，细胞因子拉链诱导了自分泌和旁分泌t细胞活化。t细胞可以被共转导，以与亮氨酸拉链标记的细胞因子(例如il
‑
15和il
‑
21)组合来表达基于亮氨酸拉链的共刺激嵌合受体(zipr
‑
ccr)。表面结合的“反式呈递的”il
‑
15和il
‑
21可以增强t细胞的增殖和存活。该系统可以与靶向表面分子的scfv
‑
拉链组合，以促进t细胞增殖，并且可以与正交zipr
‑
car系统组合，用于激活靶细胞的t细胞杀伤。图16显示基于zipr的ccr，细胞因子亮氨酸拉链诱导自分泌和旁分泌t细胞活化。t细胞可以改造成表达亮氨酸拉链标记的细胞因子，其可以促进t细胞的增殖、存活以及由t细胞产生ifn
‑
γ。ifn
‑
γ可以激活apc分泌il
‑
12，并增加吞噬作用。
[0418]
实施例4
‑
基于亮氨酸拉链的嵌合共刺激受体(ccr)，其被分泌的scfv亮氨酸拉链分选亲和标签激活，其另外激活抗原呈递细胞(apc)
[0419]
休眠的apc导致向t细胞的抗原呈递差以及t细胞的激活差，并且可以促进t细胞的无反应性。临床前模型已显示，apc的激活促进t细胞的激活，消除对cd4 t细胞帮助的需求，并增强肿瘤免疫疗法。因此，开发双载体系统来修饰t细胞，以表达特异性激活apc受体(例如cd40、toll样受体(tlr))的scfv
‑
亲和标签
‑
亮氨酸拉链，其具有相应的基于亮氨酸拉链的ccr(例如ee12rr2345l:cd137)的共表达(图17)。如图17所示，基于zipr的ccr可以诱导结合的抗原呈递细胞激活和t细胞共刺激信号传导。该系统以亲和标记的scfv亮氨酸拉链靶向抗原呈递细胞表面的共刺激受体，并允许分选表达scfv亲和标签的t细胞。scfv亮氨酸拉链可以与抗原呈递细胞上的正性共刺激受体相互作用。该系统可以促进抗原呈递细胞的激活，并同时经由zipr
‑
ccr向t细胞发送正性信号。该系统可以在另外可选地激活的巨噬细胞的情况下促进t细胞的激活。在另一种方法中，可以使用zipr
‑
car对细胞进行分选，并表达正交的亮氨酸拉链，以与ccr相互作用。scfv可以在nfat启动子的下游表达，以仅在car信号传导下游的肿瘤微环境中表达。
[0420]
与实施例2类似，该载体系统通过响应于apc经由ccr直接向t细胞递送正性共刺激信号，从而促进t细胞的活化和增殖。然而，该方法还激活apc，以便上调正性共刺激分子(cd80、cd86)，增强肽呈递和增强促炎性细胞因子的分泌。该系统可以改造成scfv
‑
亲和标签
‑
亮氨酸拉链仅在car介导的nfat信号传导的下游表达，以将apc的激活限制在肿瘤微环境中。该系统可以增强改造的以及内源性免疫应答。
[0421]
实施例5
‑
具有基于亮氨酸拉链的抗原识别基序的形成and逻辑门的基于磷酸酶的负性信号传导嵌合抗原受体(and
‑
car)允许组合的or逻辑门
[0422]
肿瘤相关抗原的非肿瘤特异性，具有非肿瘤靶向毒性，代表了基于car的免疫疗法的当前局限性。一种增强基于car或tcr的免疫应答特异性的方法是将t细胞活化限于表达抗原组合的靶标(and门，例如，在hla不匹配的同种异体造血细胞移植中，表达hla
‑
a2和cd20的细胞)。先前的系统已经显示，具有大的细胞外结构域的基于磷酸酶的受体可以响应于抗原而被选择性地激活，从而使t细胞在存在激活抗原的情况下被“许可”具有活性，在其他情况下则被抑制。如图18所示，使用cd19和cd20抗原对该系统进行了改造。如图18所示，基于磷酸酶嵌合受体的and门允许t细胞选择性杀伤靶标。t细胞可以改造成表达与携带scfv的大型细胞外结构域间隔区连接的磷酸酶(and
‑
car)。如果将间隔区设计为特定大小，
则该构建体对t细胞信号传导具有组成性抑制作用。然而，在存在同源抗原的情况下，抗原
‑
受体对与tcr和car隔离，这些分子的正性信号传导被许可。这将生成功能性and门。但是，该门仅限于由and
‑
car的scfv赋予的单一抗原特异性。
[0423]
然而，肿瘤细胞可能失去许可抗原(例如，cd20)的表达。这样，使t细胞能够响应多种许可抗原而被激活是有利的。但是，在一个细胞中表达多种对多种抗原具有特异性的and
‑
car会增加严格性。另外，and
‑
car dna构建体是大型构建体，需要多个载体来包装所有所需的rna/dna，从而限制了多个构建体的表达。
[0424]
这样，开发基于亮氨酸拉链的and
‑
car系统(例如ee12rr345l igg1 cd148)，其中and
‑
car构建体与对于多种许可抗原具有特异性的scfv
‑
亲和标签
‑
亮氨酸拉链共表达，以允许分选和组合的and/or门，例如，许可要求抗原hla
‑
a2 and(cd20 or cd22 or cd123)(图19)。如图19所示，基于zipr的and
‑
car允许多个许可scfv，从而增加能够激活t细胞的抗原数量。因此，or门与and
‑
car的and门组合。例如，可以将含有针对cd19、cd22和cd123的scfv的pre
‑
b细胞all许可载体与针对hla
‑
a2的car组合，形成and门，其靶向表达hla
‑
a2和cd19、cd22和cd123中的至少一种的细胞(and门+or门)。
[0425]
实施例6
‑
zipr
‑
car t细胞作为用于造血细胞移植(hct)的无化学疗法、无辐射的调理方案
[0426]
hct需要基于化学疗法或放射的调理方案，以杀伤造血祖细胞(hpc)、t细胞、b细胞和骨髓细胞，促进供体hpc的植入并防止宿主t细胞排斥供体hpc。t细胞耗竭的hct是对hct的一种改良，其使用cd34+选择、清髓性化学疗法或放射疗法，以及体内宿主t细胞耗竭(使用抗胸腺细胞球蛋白来补偿供体t细胞的相对减少)，这通常有助于移植。这些调理方案可能导致移植相关的死亡率和晚期毒性，包括器官功能障碍和继发性恶性肿瘤。
[0427]
然而，t细胞可以被修饰成攻击宿主t细胞、hpc、t细胞、b细胞和骨髓细胞，以促进植入。当使用cd3作为靶标时，t细胞必须经历tcr或cd3删除，以便从表面去除cd3抗原。t细胞可以进一步被修饰成表达细胞因子，例如il
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12或il
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18，已经显示上述细胞因子在白血病动物模型中消除了对调理方案的需求。
[0428]
这样，通过由一种载体表达il
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18和icaspase9并且从另一种靶向抗原的载体表达scfv，产生tcr缺失的zipr
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car t细胞，以在供体hpc输注前删除宿主的造血成分，包括hpc(图20和图21)。图20和图21显示基于zipr
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car的无化疗hct调理方案。该系统可以用于血液系统恶性肿瘤或非恶性血液系统疾病(例如镰状细胞性贫血)。宿主t细胞、b细胞和nk细胞被耗竭，以防止传统上通过化学疗法和放射疗法的异体供体骨髓的排斥(其与急性和慢性毒性以及继发性恶性肿瘤的风险有关)。zipr
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car t细胞可以耗竭多个宿主造血细胞谱系。zipr
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car载体可以编码自杀基因，以允许t细胞的耗竭和供体hpc的植入。该系统可以进一步包括靶向cll
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1/clec12a的scfv，以靶向成熟髓系细胞，并且可以包括il
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3拉链因子或cd123 scfv，以靶向早期髓系细胞。t细胞可以被改造成分泌il
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18或其他细胞因子，以促进宿主细胞的根除(eradiation)。在某些实施方式中，从细胞表面删除tcr(例如，通过crispr、pebl或talen等)，以防止同族杀伤，例如，对于cd3 car。
[0429]
该细胞产物可以从通用第三方供体获得，并且可以被冷冻成细胞库，以便在删除tcr时将其输注到任何患者中，消除了移植物抗宿主病(gvhd)的能力。受体造血系统被zipr
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car t细胞删除后，自杀基因可以通过注入icaspase9的化学二聚体激活，导致zipr
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car t细胞的缺失。然后可以输注供体hpc(图21)。
[0430]
证实tcr缺失的zipr
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car t细胞杀伤表达以下抗原的靶细胞的能力：cd3(图22)、cd17/kit(图23)、cd19、cd20、il
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3r(图9)、cll
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1/clec12a(图24)。如图22所示，表达cd3 car的t细胞促进同族杀伤。根据thy1.1报告基因表达，转导表达cd3
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pebl(敲低cd3/tcr表达的蛋白质构建体)的t细胞表现出降低的tcr表达(左图)。cd3
‑
car表达导致同族杀伤(tcr
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β+群体的损失，右图)。组合的cd3
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car+cd3
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pebl转导(中图)在保护thy1.1+cd3
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car t细胞的情况下促进了tcr
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β+群体的损失。pebl、crispr或talen可以用于从t细胞表面消除cd3或tcr表达，并使cd3
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car靶向cd3+受体/宿主t细胞，而不会引起同族杀伤。如图23所示，表达靶向cd117/kit的kit
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car的t细胞成功地杀伤了kit
+
肿瘤细胞和小鼠骨髓kit+细胞。p815肥大细胞瘤表达kit，并被kit
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car+t细胞杀伤。小鼠lsk骨髓祖细胞表达kit，并被kit
‑
car+t细胞杀伤。如图24所示，cll
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1/clec12a car消除了小鼠原发性急性髓细胞白血病。小鼠aml细胞系源自于经mll
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af9易位(translocation)转导的小鼠骨髓，其组成性表达cll
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1。与cll
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1car t细胞一起过夜孵育消除了aml细胞。cll
‑
1在成熟的髓系细胞上表达，并且cll
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1car t细胞除白血病外还可以促进宿主髓系细胞的消除。
[0431]
恶性特异性t细胞群体可以在施用调理方案t细胞产物的同时作为第三方t细胞产物共注入。这种方法的优势包括使用zipr
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car系统靶向多种抗原，使用il
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18促进供体hpc植入，并在zipr
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car载体中包括自杀基因，以允许zipr
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car t细胞的消除，防止供体hpc移植排斥或长期细胞发育不全。
[0432]
实施例7
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附加趋化因子的亮氨酸拉链构建体
[0433]
将t细胞与编码(a)附加趋化因子的rr12ee345l亮氨酸拉链和(b)基于ee12rr345l 28z亮氨酸拉链的zipr
‑
car的分别的载体共转导，如图26a所示。如图26a所示，ccl17和ccl22与ccr4相互作用；ccl1与ccr8相互作用。如图26b所示，共表达zipr
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car和趋化因子拉链(拉链因子)的t细胞介导针对表达ccr4或ccr8的el4的靶标裂解。
[0434]
本公开的主题的实施方式
[0435]
从前文描述中将显而易见的是，可以对本公开的主题进行变化和修改以将其应用于各种用途和条件。这样的实施方式也在所附权利要求的范围内。
[0436]
本文所述变量定义中的要素列表包括将变量定义成列出的要素的任何单个要素或组合(或子组合)。本文所述实施方式包括将该实施方式作为任何单一实施方式或与任何其他实施方式或其部分相结合。
[0437]
本说明书中提到的所有专利和出版物都以相同的程度通过引用并入本文，就如同每个独立的专利和出版物都被具体地和单独地指出通过引用并入一样。