谷氨酰胺合成酶用于治疗脂肪性肝病的用途的制作方法

健康的肝通常不会含有任何脂肪，或者含有非常少的脂肪。酒精性和非酒精性肝病两者在早期都以肝中脂肪沉积出现为标志。由过量酒精摄入引起的酒精相关肝病(ARLD)，如果不进行治疗，在严重性方面从脂肪沉积出现增加至肝炎及肝硬化。在其最严重的时候，ARLD可能发展成肝癌。类似地，非酒精相关脂肪性肝病(NAFLD)始于肝中脂肪的增加，通常在超重或肥胖的人中。NAFLD还具有从肝中脂肪沉积到肝纤维化、瘢痕和肝硬化几个严重阶段。目前，除了改变酒精摄入及改变饮食和生活方式以外，不存在针对脂肪性肝病的治疗。脂肪性肝病可以被称为脂肪变性或单纯性脂肪变性。脂肪积累可能伴有炎症，这是称为脂肪性肝炎的状况，并且比单纯性脂肪肝或单纯性脂肪变性更严重。NAFLD可能由代谢因素引起，其中一些可能有遗传原因，诸如糖原贮积病、Weber-Christian病等。其他原因包括营养不足、营养不良以及使用药物或毒素，包括化学疗法和抗逆转录病毒疗法。脂肪性肝病的病理表现为在肝细胞的细胞核周围出现小脂肪泡。随着泡尺寸的增加，细胞核可能被推到细胞的外围，使细胞呈现印戒(signetring)外观。当脂肪在组织加工期间溶解时，泡通常显现是空的。合并的大的泡可能形成囊肿，这被认为是不可逆的。该状况的管理还可以包括饮食控制，以限制蛋白摄入并确保足够的营养摄入，包括蛋白和/或氮摄入以及肠胃外卡路里摄入的管理。然而，尽管在状况的治疗和管理方面有所改进，但目前的疗法是非特异性的，并不总能成功地管理状况。因此，存在对用于脂肪性肝病的另外的或改进的疗法的持续需求。本发明试图解决此需求，并且基于以下的概念：使用谷氨酰胺合成酶来治疗脂肪性肝病。特别地，本发明提供了谷氨酰胺合成酶，该谷氨酰胺合成酶用于通过降低受试者肝中脂肪沉积的量来治疗脂肪性肝病。谷氨酰胺合成酶可以以核酸分子作为基因疗法被提供至受试者。可选地，谷氨酰胺合成酶可以以蛋白疗法施用。谷氨酰胺合成酶(GS)催化以下反应：谷氨酸(Glutamate)+ATP+NH3→谷氨酰胺+ADP+磷酸(phosphate)。本发明基于出乎意料的观察，即谷氨酰胺合成酶的施用逆转肝细胞中脂肪肝的症状。具体地，谷氨酰胺合成酶已被显示具有降低或消除肝细胞中脂肪沉积的作用。本发明还基于出乎意料的观察，即谷氨酰胺合成酶的施用预防肝组织中纤维化的进展。具体地，谷氨酰胺合成酶已被显示具有降低或消除肝组织中纤维化的作用。谷氨酰胺是重要的氨基酸，其具有多于一种功能，包括维持消化道通透性和免疫功能，这两者都可以有助于谷氨酰胺合酶在NAFLD治疗中的这种观察到的出乎意料的作用。另外地，GS和降氨剂(诸如氮清除剂，例如苯乙酸的药学上可接受的盐，诸如苯乙酸钠)的组合使用具有协同效应，并且可以进一步提高GS降低或消除肝中脂肪沉积的活性。因此，在一方面，本发明提供了谷氨酰胺合成酶(GS)，该谷氨酰胺合成酶(GS)用于通过降低或消除肝中脂肪沉积来治疗脂肪性肝病。GS降低或改善脂肪性肝病的细胞效应，诸如肝细胞或组织中的脂肪沉积，并且因此逆转或预防肝组织中脂肪性肝病的进展，特别是单纯性脂肪性肝病的进展。因此，本发明提供了GS，所述GS用于在治疗或预防脂肪性肝病和相关肝病包括肝炎、纤维化、肝硬化和癌症的方法中使用。在合适的实施方案中，GS被提供用于通过降低或消除肝中的脂肪沉积来治疗脂肪性肝病，GS可以与降氨剂组合使用。在另一方面，本发明提供了一种降氨剂，所述降氨剂用于与GS组合使用，用于通过降低或消除肝中的脂肪沉积来治疗脂肪性肝病。本发明的相关方面还提供了GS用于制备组合物(例如药物组合物或营养组合物，例如药物或补充剂)的用途，该组合物用于通过降低或消除肝中的脂肪沉积来治疗脂肪性肝病。在合适的实施方案中，该组合物可以与降氨剂组合使用。本发明的另外的方面还提供降氨剂用于制备组合物的用途，该组合物用于与GS组合使用，用于通过降低或消除肝中的脂肪沉积来治疗脂肪性肝病。在另外的方面，本发明提供了GS和降氨剂用于制备组合物的用途，该组合物用于通过降低或消除肝中的脂肪沉积来治疗脂肪性肝病。在另外的方面，本发明提供了一种治疗受试者中的脂肪性肝病的方法，该方法通过降低或消除肝中的脂肪沉积来治疗受试者中的脂肪性肝病，该方法包括将GS施用至所述受试者(更特别地，施用至有相应需要的受试者)。在合适的实施方案中，该方法还包括施用降氨剂。在合适的实施方案中，该方法可以包括将谷氨酰胺合成酶(GS)和降氨剂同时、顺序或随后施用至所述受试者。本发明的方法可以包括诊断受试者患有脂肪性肝病的步骤。本发明的方法可以包括在治疗期间和治疗后监测患有脂肪性肝病的受试者。还提供了一种组合物，该组合物包含GS，用于通过降低或消除受试者肝中的脂肪沉积来治疗脂肪性肝病。合适地，包含GS的组合物可以是药物组合物或营养组合物，例如药物或补充剂。合适地，该组合物可以还包含降氨剂。本发明还涉及包含GS和降氨剂的组合物。合适地，该组合物可以是药物组合物或营养组合物。合适地，该组合物可以用于通过降低或消除肝中的脂肪沉积来治疗脂肪性肝病。在另一方面，本发明提供了一种细胞，该细胞包含选自由以下组成的组的表达载体：用于在治疗脂肪性肝病中使用的编码谷氨酰胺合成酶或其生物活性片段或变体的表达载体，以及与降氨剂组合使用、用于在治疗脂肪性肝病中使用的编码谷氨酰胺合成酶或其生物活性片段或变体的表达载体。在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含编码谷氨酰胺合成酶或其生物活性片段或变体的表达载体、以及另外的治疗剂。合适地，另外的治疗剂可以是针对脂肪性肝病有效的剂。合适地，针对脂肪性肝病有效的剂是降氨剂或氨基酸或其尿素循环中间体。可以提供该试剂盒用于在治疗脂肪性肝病的方法中使用。在另一方面，本发明提供了包含GS和另外的治疗剂的产品，该产品作为组合的制备物在治疗脂肪性肝病中单独使用、同时使用或顺序使用。合适地，另外的治疗剂可以是针对脂肪性肝病有效的剂。合适地，针对高氨血症有效的剂是降氨剂或氨基酸或其尿素循环中间体。更合适地，另外的治疗剂是氮清除剂。在另一方面，本发明提供了谷氨酰胺合成酶(GS)，该谷氨酰胺合成酶(GS)用于通过降低或消除肝中纤维化来治疗晚期脂肪性肝病。因此，GS逆转或预防脂肪性肝病的进展，特别是进展性(advanced)或晚期(latestage)脂肪性肝病和肝硬化的进展。因此，本发明提供了GS，该GS用于在通过降低或消除肝中的纤维化来治疗或预防晚期脂肪性肝病(包括肝炎、纤维化、肝硬化和癌症)的方法中使用。在合适的实施方案中，该组合物可以与降氨剂组合使用。在另一方面，本发明提供了一种降氨剂，所述降氨剂与GS组合使用，用于通过降低或消除肝中的纤维化来治疗脂肪性肝病。本发明的相关方面还提供了GS用于制备组合物(例如药物组合物或营养组合物，例如药物或补充剂)的用途，该组合物用于通过降低或消除肝中的纤维化来治疗脂肪性肝病。在合适的实施方案中，可以提供GS用于制备组合物(例如药物组合物或营养组合物，例如药物或补充剂)的用途，所述组合物与降氨剂组合使用，用于通过降低或消除肝中的纤维化来治疗脂肪性肝病。该组合物可以用于GS和降氨剂的组合、同时、单独或顺序施用。本发明的另外的方面还提供了降氨剂用于制备组合物的用途，该组合物用于与GS组合使用，用于通过降低或消除肝中的纤维化来治疗脂肪性肝病。在另外的方面，本发明提供了GS和降氨剂用于制备组合物的用途，该组合物用于通过降低或消除肝中的纤维化来治疗脂肪性肝病。在另外的方面，本发明提供了一种疗受试者中的脂肪性肝病的方法，所述方法通过降低或消除肝中的纤维化来治疗受试者中的脂肪性肝病，该方法包括将GS施用至所述受试者(更特别地，施用至有相应需要的受试者)。在合适的实施方案中，该方法还包括施用降氨剂。在合适的实施方案中，该方法可以包括将谷氨酰胺合成酶(GS)和降氨剂同时、顺序或随后施用至所述受试者。本发明的方法可以包括诊断受试者患有脂肪性肝病的步骤。本发明的方法可以包括在治疗期间和治疗后监测患有脂肪性肝病的受试者。还提供了一种组合物，该组合物包含GS，用于通过降低或消除受试者肝中的纤维化来治疗脂肪性肝病。合适地，包含GS的组合物可以是药物组合物或营养组合物，例如药物或补充剂。合适地，该组合物可以还包含降氨剂。本发明还涉及包含GS和降氨剂的组合物。合适地，该组合物可以是药物组合物或营养组合物。合适地，该组合物可以用于通过降低或消除肝中的纤维化来治疗脂肪性肝病。在另一方面，本发明提供了一种细胞，该细胞包含选自由以下组成的组的表达载体：用于在治疗脂肪性肝病中使用的编码谷氨酰胺合成酶或其生物活性片段或变体的表达载体，以及与降氨剂组合使用、用于通过降低或消除受试者肝中的纤维化来治疗脂肪性肝病的编码谷氨酰胺合成酶或其生物活性片段或变体的表达载体。在另一方面，可以提供如本文定义的试剂盒，用于在通过降低或消除肝中的纤维化来治疗脂肪性肝病的方法中使用。在另一方面，本发明提供了包含GS和另外的治疗剂的产品，该产品作为组合的制备物在通过降低或消除肝中的纤维化来治疗脂肪性肝病中单独使用、同时使用或顺序使用。合适地，另外的治疗剂可以是针对脂肪性肝病有效的剂。合适地，针对高氨血症有效的剂是降氨剂或氨基酸或其尿素循环中间体。更合适地，另外的治疗剂是氮清除剂。本发明可以用于治疗患有获得性或遗传性脂肪性肝病的受试者。受试者可以患有与尿素循环障碍(UCD)相关的遗传性(继承性(inherited))脂肪性肝病。受试者可以由于缺乏尿素循环酶或转运蛋白而患有遗传性紊乱。因此，本发明涉及患有脂肪性肝病的受试者的治疗，其中受试者患有UCD病或其他遗传获得性高氨血症疾病，优选地鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏(即导致鸟氨酸转氨甲酰酶蛋白异常表达的鸟氨酸转氨甲酰酶基因的突变或遗传异常)。患有UCD或其他遗传获得性高氨血症的受试者可以表现出脂肪性肝病的症状，例如肝细胞中的脂肪沉积或肝组织的纤维化。受试者可以患有遗传性紊乱，诸如与脂肪性肝病相关的糖原贮积紊乱或ChristianWeber病。受试者可以患有获得性脂肪性肝病，并且可以具有选自由糖尿病、肥胖症、营养不良、过量酒精摄入和药物使用组成的组的一种或更多种状况。受试者可以具有上述状况之一，并且被诊断为处于发展脂肪性肝病的风险。如本文描述的本发明还涉及例如在离体治疗方法中治疗从受试者取出的肝组织。术语“GS”可以包括GS蛋白，或编码GS蛋白或其活性片段的核酸序列。本文的GS在其范围内包括该蛋白的任何生物活性片段或变体或核酸序列。术语“GS蛋白”可以可选地表述为“具有谷氨酰胺合成酶(GS)活性的蛋白”。如下文更详细描述的，术语“蛋白”在本文广泛使用以包括任何蛋白质分子，包括肽和多肽，以及蛋白或多肽片段；GS蛋白不必须是或对应于自然界中出现的全长GS酶(例如天然或野生型GS)并且包括截短的或其他变体。也如下文更详细描述的，还包括了GS蛋白与其他分子的缀合物或融合物。术语“脂肪性肝病”包括肝细胞内存在脂肪沉积的任何状况。这样的状况包括遗传性或获得性脂肪性肝病(脂肪变性)，包括ARLD和NAFLD以及来源于脂肪性肝病的状况，诸如肝的炎症(脂肪性肝炎，包括NASH)、肝炎(酒精性和非酒精性)、肝硬化、纤维化和肝癌。本发明的方面可以用于降低或消除肝中的脂肪沉积，和/或完全或部分地逆转肝的纤维化或瘢痕。本发明的方面还可以用于抑制或逆转脂肪性肝病的进展，例如减缓或预防从单纯性脂肪肝到脂肪性肝炎(包括NASH)、纤维化、从纤维化、肝硬化或肝癌的疾病进展。本发明的方面涉及通过逆转疾病症状来治疗或预防疾病，例如逆转脂肪肝和/或纤维化的症状。因此，本发明的方面涉及降低或消除肝中的脂肪沉积和/或瘢痕。因此，本发明的方面涉及治疗或预防脂肪性肝病和相关肝病，包括肝炎、纤维化、肝硬化和癌症。在脂肪性肝病中，可以观察到氨水平升高。因此，可以观察到>40μmol/L、60μmol/L或70μmol/L或80μmol/L或更高，例如41μmol/L、42μmol/L、45μmol/L、50μmol/L、55μmol/L、60μmol/L、70μmol/L或80μmol/L或更高的血浆(或血液)氨浓度。例如，>100μmol/L，以及特别地150μmol/L或更高的血浆氨浓度，当伴有正常阴离子隙(aniongap)和正常血浆葡萄糖浓度时，可能与脂肪性肝病(例如由于尿素循环酶(UCE)的表达和/或活性中的变化)相关，或者可能与之不相关。脂肪性肝病可以使用成像程序来检测，例如超声、CT扫描或MRI；根据本领域熟知和使用的技术，高于正常水平的肝酶诸如丙氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶的血液测试(例如在血浆或血清或任何血液来源的样品中)；通过染色或肝活检来测量肝组织中胶原比例面积，以检测肝或肝组织中的症状，诸如脂肪沉积或纤维化或瘢痕。这样的确定和分析可以与临床评估例如肝功能测试等组合。也可以进行家族史调查和/或分子遗传学测试和/或评估。因此，本发明可以包括诊断受试者的脂肪性肝病、高氨血症症状或导致脂肪肝或高氨血症的遗传性紊乱(例如UCD)的步骤。在本发明的其他方面，受试者是已经被诊断为患有脂肪性肝病、或为具有导致脂肪肝的遗传性紊乱(例如UCD)或导致脂肪性肝病的较高风险的状况(例如糖尿病、肥胖症、营养不良、过量酒精摄入或药物使用)的人。在本文，内部命名AM-535是指谷氨酰胺合成酶，并且可以包括具有一个或更多个N末端接头和任选地聚(his)(poly(his))标签的人类GS。AM-535可以包括聚乙二醇化形式的GS。AM-535在实施例中进一步描述。如本文使用的，述及用于根据本发明使用的谷氨酰胺合成酶或GS蛋白包括述及所有形式的酶活性GS以及酶活性变体，所述酶活性GS包括人类GS和来自非人类动物(诸如小鼠、牛(cow)、兔、大鼠、猴、黑猩猩和狗等)的GS，或来自其他来源(包括例如真菌、植物或细菌)的GS。因此，代表性的GS蛋白包括与以下具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的那些或其酶活性片段：以SEQIDNO:1或SEQIDNO:2或SEQIDNO:4列出的GS多肽(人类GS，分别为前体形式、成熟形式和N末端加标签的形式)或以SEQIDNO.6(来自嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)菌株30SC的GS)或SEQIDNO.7(来自玉米(corn,ZeaMays)的GS)列出的GS多肽。例如，述及GS还可以包括N末端和/或C末端截短的多肽或氨基酸修饰的蛋白(例如翻译后修饰，诸如腺苷酸化或其他修饰，诸如可能影响蛋白的结构或活性的氨基酸多态性)。GS还可以包括蛋白的多聚体。因此，术语“GS蛋白”包括保留GS酶活性的所有天然形式的GS酶或多肽以及其酶活性片段或变体，包括具有一个或更多个氨基酸取代、添加(包括插入和延伸)或缺失的合成来源的多肽和修饰的多肽。因此，GS可以是或可以来源于落入酶分类EC6.3.1.2的任何酶。它可以是具有GS活性的任何多肽或肽。GS活性可以定义为将谷氨酸和氨转化为谷氨酰胺的能力，例如根据上述反应方案。GS活性可以使用本领域已知的和在文献中描述的测定或测试(例如功能活性测定)进行评估或确定。例如，GS酶活性测定描述于Listrom等人，Biochem.J.1997,328,159-163中。对GS活性的测定还描述于下文的实施例(参见实施例2和4)中。人类GS被表达为373个氨基酸的多肽(如以SEQIDNO.1所示)。这代表表达的完整的“前体”蛋白，然后进一步加工成具有氨基酸2-373的成熟形式(在体内仅N末端甲硫氨酸被去除以产生372个氨基酸的成熟蛋白，如以SEQIDNO.2所示)。以SEQIDNO.3列出的示例性多核苷酸代表编码多肽SEQIDNO.1的cDNA。如下文实施例中制备和使用的，SEQIDNO.4代表修饰的人类GS蛋白，包含带有N末端His标签和接头序列的GS多肽SEQIDNO.1。如下文实施例中使用的，SEQIDNO.5是编码多肽SEQIDNO.4的cDNA序列，针对细菌中的表达进行了密码子优化。人类GS已进行了充分的表征(参见例如Listrom等人，1997,同上)。来自其他生物体(包括植物和细菌)的GS酶也已被鉴定，并且这样的其他GS酶的核酸和氨基酸序列是本领域熟知的，并且在可自由获得的数据库中提供，诸如，例如美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)核苷酸(ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)和蛋白(ncbi.nlm.nih.gov/protein)数据库。尽管植物或细菌GS酶和人类GS之间的序列同一性可能低，但结构和功能相似性高。因此，植物或细菌GS，或者实际上来自其他生物体的GS，或者其氨基酸序列变体可以被使用。作为代表性的实例，SEQIDNO.6列出了来自嗜酸乳杆菌菌株30SC的GS的氨基酸序列，其与人类GS具有23.8％的序列同一性，并且与干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)的GS具有61.9％的序列同一性，并且SEQIDNO.7列出了来自玉米(corn，maize，ZeaMays)的GS的氨基酸序列，其与人类GS具有55.7％的序列同一性。GS通常以包含多于一个(即2个或更多个)单体亚基的多聚体出现。例如，上文提供的GS氨基酸序列代表这样的单体亚基。人类GS最常被报道为五聚体或十聚体(5个或10个亚基)。如本文使用的，GS可以作为单体和/或多聚体提供。多聚体可以包含2个或更多个单体亚基，例如2个至20个、2个至16个、2个至15个、2个至14个或2个至12个亚基。重组GS可以活性五聚体、十聚体或其他多聚体存在，或者作为活性单体存在。在本文提供的方法中使用的GS蛋白，可以通过本领域已知的任何方法获得，诸如重组方法、蛋白分离和纯化方法以及化学合成方法，提供显示酶活性的所得的GS。因此，GS可以是重组GS、从组织分离的天然GS或化学合成的GS。修饰GS多肽，诸如以SEQIDNO:1列出的多肽，以产生在本文提供的方法中使用的酶活性GS变体完全在本领域技术人员的能力范围内。例如，本领域技术人员应理解，在参与底物结合的位置或在活性位点的修饰，与在这些关键区域以外的位置的修饰相比被容许的可能性较小。任何GS多肽都可以使用本领域熟知的方法，诸如本领域描述的那些方法进行测试。GS多肽可以被可操作地连接至一个或更多个接头和/或标签序列。接头序列可以是任何合适的肽序列，合适地1个至30个氨基酸，更合适地1个至20个氨基酸，更合适地1个至10个氨基酸。最合适的接头序列的长度可以是3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸。合适地，接头序列可以包含甘氨酸和/或丝氨酸残基以提供柔性。最合适的接头可以是GGGS或GGGGS。GS可以被可操作地连接至两个或更多个接头，这些接头可以相同或者可以不同。合适地，一个或更多个接头可以被可操作地连接(直接地或经由另一个肽序列间接地)至多肽的N末端。在提供两个或更多个接头的情况下，任何一个接头序列可以被直接可操作地连接至另一个接头，或者经由间插序列间接连接至另一个载体。标签序列可以是任何肽序列，适合地其与用于分离蛋白的基质结合。合适的标签是本领域已知且可得的，并且包括例如壳多糖结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、Strep-标签和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)以及聚(His)标签。聚(his)标签可以是HHHHHH或任何合适数目的His残基。在合适的实施方案中，用于本发明的GS序列可以以下列构造提供：接头-标签-接头-GS。最合适地，接头可以如上定义，并且更合适地是GGGS或GGGGS。标签可以如上定义，并且最合适地是聚(his)标签。最合适地，GS序列可以以GGGS-聚(his)-GGGGS-GS的形式提供。合适地，GS序列以GGGS-聚(his)-GGGGS-人类GS的形式提供。合适地，人类GS是SEQIDNO1。还提供了编码如本文定义的GS蛋白和任何接头和/或标签序列的核酸序列。如本文描述的，这样的核酸序列可以在载体中提供。在以核酸分子提供GS的情况下，核酸分子可以是编码GS的全长天然序列，例如如SEQIDNO.2所示的序列，或者可以是其生物活性片段或变体。术语“生物活性”是指编码显示出将谷氨酸转化为谷氨酰胺的能力的谷氨酰胺合成酶(SEQIDNO:1)的核酸的片段或变体。根据SEQIDNO:1的蛋白由根据SEQIDNo:2中的核酸序列编码。编码GS或其生物活性片段或变体的核酸分子可以在载体中提供。载体可以是表达载体。载体可以包含编码谷氨酰胺合成酶的生物活性片段或变体的SEQIDNO:2的片段或变体。在合适的实施方案中，该载体还编码降氨剂。如本文使用的术语“变体”是指包含多肽SEQIDNO:1的一级结构的改变的多肽。合适地，变体可以与多肽SEQIDNO:1共有70％或更多的同一性；与多肽SEQIDNO:1共有80％或更多的同一性；与多肽SEQIDNO:1共有90％或更多的同一性；与多肽SEQIDNO:1共有95％或更多的同一性；与多肽SEQIDNO:1共有96％或更多的同一性；与多肽SEQIDNO:1共有97％或更多的同一性；与多肽SEQIDNO:1共有98％或更多的同一性；或者与多肽SEQIDNO:1共有甚至99％或更多的同一性。参考根据SEQIDNO:1的序列，变体可以以1％或更多、2％或更多、3％或更多、4％或更多、5％或更多、10％或更多、20％或更多或甚至30％或更多区别于多肽SEQIDNO:1。如本文使用的术语“片段”是指包含多肽SEQIDNO:1的一级结构长度改变的多肽。合适的片段可以包含SEQIDNO:1全长的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。事实上，合适的变体可以包含SEQIDNO:1的至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在合适的实施方案中，表达载体可以是病毒的或非病毒的。作为实例，合适的病毒表达载体可以来源于选自由以下组成的组的病毒：副粘病毒、逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、痘病毒、甲病毒属和疱疹病毒。其他合适的病毒载体将是本领域技术人员已知的。合适的非病毒表达载体可以选自由以下组成的组：无机颗粒表达载体(诸如磷酸钙、二氧化硅和金)、基于脂质的颗粒表达载体(例如阳离子脂质、脂质纳米乳液和固体脂质纳米颗粒)和基于聚合物的颗粒表达载体(例如肽、聚乙烯亚胺、壳聚糖和树状大分子)。其他合适的非病毒表达载体将是本领域技术人员已知的。术语还包括GS蛋白的前药，它是一种本身不显示GS活性的形式，但其在施用至受试者后可以被转化为活性GS。因此，如本文使用，述及GS蛋白或多肽的“酶活性”是指能够催化谷氨酸和氨转化为谷氨酰胺的GS蛋白或多肽。典型地，酶活性GS蛋白或多肽显示出以SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6或SEQIDNO:7列出的GS多肽的酶活性的至少以下或约以下：30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。如本文使用的术语“受试者”包括任何人类或非人类的动物，并且特别是指哺乳动物，包括例如人类、灵长类动物、家畜动物(例如绵羊、猪、牛(cattle)、马、驴)、实验室实验动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠)、伴侣动物(例如狗、猫)和圈养野生动物(例如狐狸、袋鼠、鹿)。优选地，哺乳动物是人类或实验室实验动物。甚至更优选地，哺乳动物是人类。如本文使用的，术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”是指补救或改善状况或症状，阻止状况或疾病的形成，或以无论任何方式另外阻止、阻碍、减缓、减少或逆转状况或疾病或其他不期望的症状的进展的任何和所有使用。具体地，在本发明中，“治疗”意指通过降低或消除肝中的脂肪沉积来完全或部分地逆转脂肪性肝病的症状。以这种方式，肝中存在的甘油三酯泡收缩或被消除。肝病(诸如炎症、纤维化或瘢痕)的进行性症状也可以被完全或部分地逆转。因此，术语“治疗(treating)”和“预防(preventing)”及类似的术语应在其最广泛的范围内加以考虑。例如，治疗不一定意味着患者接受治疗直到完全康复，而是包括患者或受试者的状况、或疾病或状况的症状的任何改进(improvement)或改善(amelioration)。因此，例如在遗传性脂肪性肝病而不是获得性脂肪性肝病的情况下，根据本发明的治疗当然不治疗潜在的遗传性紊乱，而是治疗所导致的脂肪性肝病的临床状况。在显示多于一种症状或以多于一种症状为特征的状况中，治疗或预防不一定需要补救、改善、阻止、阻碍、减缓、减少或逆转所有的所述症状，而是可以补救、改善、阻止、阻碍、减缓、减少或逆转一种或更多种所述症状。在合适的实施方案中，根据本发明的“治疗”导致肝中脂肪水平降低，例如降低至正常或健康水平，例如不存在脂肪或存在非常少的脂肪泡；不存在脂肪囊肿；细胞核正常且无移位，无纤维化或最少/健康水平的纤维化。因此，治疗包括恢复正常或健康的肝脂肪水平。治疗也可以包括降低或消除肝组织中的纤维化。在合适的实施方案中，根据本发明的“治疗”可以包括增加受试者组织中谷氨酰胺合成酶水平和/或活性。这样的增加可以在任何合适的组织(例如肝)中。谷氨酰胺合成酶水平和/或活性的增加可以例如通过测量受试者的谷氨酰胺的水平、谷氨酸的水平，和/或通过确定受试者的谷氨酰胺的水平与谷氨酸的水平之间的比率来确定。增加可以是正常或健康水平，其中例如脂肪性肝病伴随着UCE的降低。应当理解，谷氨酰胺和/或谷氨酸的正常或健康水平可以根据在哪个样品中测量它们而变化。还应当理解，谷氨酰胺和/或谷氨酸的正常或健康水平可以是受试者特有的，并且取决于诸如受试者的体重、饮食、性别和年龄等因素。谷氨酰胺和/或谷氨酸的正常或健康水平将是本领域技术人员已知的。如本文使用的，“改善”指的是状况或疾病的至少一种指标或症状的严重性的减轻。在某些实施方案中，改善包括状况或疾病的一个或更多个指标的进展的延迟或减缓。指标的严重性可以通过本领域技术人员已知的主观或客观的量度确定。如本文使用的，术语“与...相关(associatedwith)”当用于疾病或状况的上下文中时，“与”肝中的脂肪沉积“相关”意指该疾病或状况可以由氨水平升高引起、导致氨水平升高、以氨水平升高为特征或以其他方式与氨水平升高相关。因此，疾病或状况与脂肪肝之间的相关可以是直接的或间接的，并且可以是时间上分离的。同样地，用于确定谷氨酰胺合成酶水平和/或谷氨酰胺合成酶活性的合适的样品包括其中可能存在谷氨酰胺合成酶、谷氨酰胺和/或谷氨酸的任何合适的或期望的样品。这些可以是任何合适的或期望的组织或体液样品。合适的组织的一种实例是肝和/或肌肉组织。便利地，样品可以是任何体液样品，并且通常将是血液或任何血液来源的样品，例如血浆或血清等，但是样品可以是任何其他体液，例如尿液、脑脊液或粪便或组织样品等，例如活检样品或灌洗液或冲洗液样品等。当然这可以取决于待治疗状况的确切性质等。如本文使用的，术语“有效量”在其含义内包括无毒但足以提供期望的效果的GS和/或降氨剂(取决于上下文)的量或剂量。应当理解，蛋白和/或降氨剂的有效量可以不同。示例性治疗有效量在本说明书的其他地方进行具体说明。所需的确切的量或剂量将随受试者不同而变化，取决于诸如被治疗的物种、受试者的年龄和一般状况、被治疗状况的严重性、被施用的特定GS和施用的模式等等。因此，明确规定确切的“有效量”是不合适的。然而，对于任何给定的病例，适当的“有效的量”可由本领域普通技术人员仅使用例行实验确定。事实上，本发明的一个出乎意料的特征是，与文献中报道的5亚基或10亚基多聚体相比，人类GS蛋白可以作为多于一种不同类型多聚体(也包括单体形式)的混合物表达和/或获得。单体形式被显示是有活性的。因此，根据本发明，GS可以作为单体和/或作为多聚体被使用，并且多聚体可以作为单一多聚体形式提供，或者作为不同多聚体形式的混合物(其可以包括或不包括该单体)提供。如下文实施例所报告，可以获得4种或更多种，例如4种至10种，例如5种至8种多聚体形式。多聚体的尺寸范围可以为2个至20个亚基。下文的实施例，用于评估GS多肽催化谷氨酸和氨转化为谷氨酰胺的能力。在一些实例中，根据本文的本发明使用的GS蛋白是使用本领域熟知的原核或真核表达系统产生的重组GS。示例性原核表达系统包括但不限于大肠杆菌(Escherichiacoli)表达系统，并且示例性真核表达系统包括但不限于酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞表达系统。编码GS的核酸可以通过任何合适的方法获得，包括但不限于，肝RNA的RT-PCR和合成核苷酸的合成。用于扩增的引物可以基于诸如上文列出的已知的GS序列来设计。GS的核酸和氨基酸序列是本领域熟知的，并且在可自由获得的数据库中提供，诸如，例如美国国家生物技术信息中心(NCBI)核苷酸(ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)和蛋白(ncbi.nlm.nih.gov/protein)数据库。编码GS多肽的核酸，诸如具有以SEQIDNO.3列出的序列的核酸，可以被克隆到适于所选表达系统的表达载体中。在一些情况下，核酸是针对在特定系统中的表达被密码子优化的。例如，编码GS多肽的核酸可以针对在大肠杆菌(E.coli)中的表达被密码子优化。示例性的用于在大肠杆菌中表达的编码GS的密码子优化的核酸以SEQIDNO5列出，其编码包含经由GGGGS接头附接的His标签的GS多肽(如以SEQIDNO.4所列出的)。通常，编码GS的核酸被克隆到表达载体中，可操作地连接至促进异源核酸分子表达的调节序列。许多适于GS的表达的表达载体是可获得的，并且为本领域技术人员已知的。表达载体的选择受宿主表达系统的选择影响。这种选择完全在本领域技术人员的技能水平范围之内。通常，表达载体可以包括转录启动子和任选的增强子、翻译信号、以及转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体通常具有允许转化细胞的选择和维持的选择性标记。在一些情况下，复制起点可被用于扩增细胞中载体的拷贝数。GS多肽也可以被表达为蛋白融合物。例如，融合物可以被产生以向多肽增加额外功能。融合蛋白的实例包括但不限于，含GS和用于纯化的亲和标签(例如his标签例如his6、MYC、FLAG、HA或GST标签)、前导序列(诸如pelB前导序列)、用于指导蛋白分泌的序列、或用于稳定和/或溶解GS的蛋白(例如麦芽糖结合蛋白(MBP))或用于增加体内半衰期的蛋白(例如白蛋白或Fc结构域或其片段)的融合物。原核生物，特别是大肠杆菌，提供了用于产生大量GS的系统。大肠杆菌的转化是本领域技术人员熟知的简单且快速的技术。用于大肠杆菌的表达载体可以包含诱导型启动子，其对于诱导高水平的蛋白表达和对于表达对宿主细胞显示一定毒性的蛋白是有用的。诱导型启动子的实例包括lac启动子、trp启动子、杂合tac启动子、T7和SP6RNA启动子和温度调节的λPL启动子。在其他实例中，真核表达系统被用于产生GS，诸如杆状病毒表达系统。通常，表达载体使用启动子诸如用于高水平表达的杆状病毒的多角体蛋白启动子。常用的杆状病毒系统包括杆状病毒诸如苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)核型多角体病毒(AcNPV)和家蚕(Bombyxmori)核型多角体病毒(BmNPV)以及昆虫细胞系诸如源自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)的Sf9、一星粘虫(Pseudaletiaunipuncta)(A7S)和君主斑蝶(Danausplexippus)(DpNl)。为了高水平表达，GS的核苷酸序列紧接地在病毒多角体蛋白起始密码子的下游融合。酵母诸如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、解脂亚罗酵母(Yarrowialipolytica)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)也可以用作GS的表达宿主。酵母可以用附加型复制载体进行转化或通过以同源重组的稳定染色体整合进行转化。通常，诱导型启动子，诸如包括GAL1、GAL7和GAL5，被用于调节基因表达。酵母表达载体通常包括选择性标志物，诸如LEU2、TRP1、HIS3和URA3，用于选择和维持转化的DNA。哺乳动物表达系统也可被用来表达GS。表达构建体可以通过病毒感染(诸如腺病毒)或通过直接DNA转移(诸如脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖)和通过物理方法(诸如电穿孔和显微注射)被转移到哺乳动物细胞中。用于哺乳动物细胞的表达载体通常包括mRNA加帽位点、TATA盒、翻译起始序列(Kozak共有序列)和多聚腺苷酸化元件。这种载体通常包括用于高水平表达的转录启动子-增强子，例如SV40启动子-增强子、人类巨细胞病毒(CMV)启动子，以及劳氏肉瘤病毒(Roussarcomavirus,RSV)的长末端重复序列。可用于哺乳动物表达的示例性细胞系包括但不限于，小鼠、大鼠、人、猴、和鸡和仓鼠的细胞，诸如BHK、293-F、CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NSO(非分泌型)和其他骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异杂交瘤(heterohybridoma)细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、293T、2B8和HKB细胞。表达后，GS可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行纯化，所述方法包括但不限于，SDS-PAGE、尺寸分级和尺寸排阻层析、硫酸铵沉淀、螯合层析、离子交换层析和亲和层析。亲和纯化技术可以用于提高制备物的功效和纯度。例如，结合GS的抗体和其他分子可以在亲和纯化中使用。如上文讨论的，表达构建体可被工程化以添加亲和标签诸如his、myc、FLAG或HA标签或GST部分至GS，然后其可分别用Ni树脂、myc抗体、HA抗体、FLAG抗体或谷胱甘肽树脂进行亲和纯化。合适地，可以使用9xhis标签。更合适地，使用6xhis标签。纯度可以通过本领域已知的任何方法进行评估，包括凝胶电泳和染色以及分光光度技术，诸如SDS-PAGE和尺寸排阻层析(SEC)。对于根据本发明的用途，亲和标签(例如，his标签等)可以被去除，但这不是必需的，并且GS多肽可以与所附接的标签一起使用。根据本领域熟知的原理，标签或其他融合配偶体可以经由接头附接至GS，接头可以是任何合适的接头。这样的接头通常且方便地可以是短(例如2-10、2-8或2-6mer)肽。作为实例，可以述及接头GGSG、GGGS或GGGGS，但是可以由任何合适的氨基酸组成。同样根据本领域熟知的和文献中描述的原理和技术，氨基酸接头使得能够通过重组方式制备融合蛋白，但是基于非氨基酸的接头也可以被使用。接头可以是可裂解的(即酶促裂解的)或不可裂解的。GS多肽可以被制备为裸多肽链，或制备为修饰的多肽，其通过偶联或缀合至另外的部分或化学基团或物质被修饰。示例性的修饰包括但不限于，聚乙二醇化、白蛋白化或其他已知修饰。例如，在一些情况下，使用本领域熟知的标准方法对用于在所述方法中使用的GS多肽进行聚乙二醇化。这可以用于例如提高GS蛋白在循环中的半衰期。因此，在本发明的一种优选实施方案中，GS蛋白可以作为与聚合物诸如聚乙二醇(PEG)或多糖或寡糖的缀合物被提供。与PEG的缀合物是特别优选的。如上所述，这种缀合物的制备是本领域熟知的并且描述于文献中。因此，各种尺寸的PEG可被用于制备缀合物，例如从100道尔顿至100kD，但更经常地从5kD至100kD，例如12kD或15kD至60kD或80kD，诸如15kD至50kD、15kD至40kD或15kD至30kD的范围。此外，PEG可以以各种方式附接或连接至GS蛋白，并且多于一个PEG可以被附接至每个单独的蛋白。可以将PEG直接地或间接地连接，例如对于上述融合蛋白通过所述的接头，或者通过任何可以提供接头功能的分子或化学基团。因此，PEG可以被连接在N末端或C末端中的一个或两者，或者被连接在GS分子内部，例如在GS蛋白分子中的一个或更多个赖氨酸残基的氨基基团，或者在蛋白分子中的任何其他化学部分或残基。用于将聚合物诸如PEG偶联或缀合至蛋白的方法是本领域熟知的，并且描述于文献中(参见例如Roberts等人2012,AdvancedDrugDeliveryReviews,64(增刊)116-127，和Veronese2001,Biomaterials22,405-417)。下文实施例中提供的数据示出，通过将PEG连接至N末端制备的PEG缀合物特别有效，例如在来自施用各种缀合物的动物的肝裂解物的活性测定中。因此，包含将PEG连接至GS蛋白N末端的PEG缀合物代表本发明的一种优选实施方案。GS蛋白可以以单体和/或多聚体形式被聚乙二醇化。因此，为了方便，包含单体形式GS和各种多聚体形式GS两者的制备物可以经历聚乙二醇化。GS可以被配制成药物组合物，用于向受试者施用。通过混合选定量的GS与一种或更多种生理学上或药学上可接受的载体或赋形剂，可以将GS以任何常规方式配制。因此，本发明的另外的方面提供了一种药物组合物，该药物组合物包含GS和一种或更多种药学上可接受的载体或赋形剂，其中该组合物用于通过降低肝中的脂肪沉积来治疗脂肪性肝病。如本文描述的，GS可以以核酸分子或蛋白提供。载体或赋形剂的选择在用药从业者的技能范围内，并可取决于许多参数，诸如施用的模式。在一些实例中，GS蛋白以流体提供。在其他情况下，GS蛋白以干燥的形式提供，诸如脱水或冷冻干燥形式。这种干燥的形式可以通过添加合适的溶液，诸如水、缓冲液、盐水或其他合适的溶液在施用前再水合。在GS以核酸提供的情况下，它可以以任何合适的组合物提供，并且可以是用于直接施用至肝的注射剂。本文提供的GS可以被配制为用于直接施用，或可以被配制为用于稀释或其他调整。因此，GS可以以单(或单位)剂量形式或多个剂量形式被配制。单剂量形式的实例包括安瓿和注射器。多个剂量形式的实例包括包含多个单位剂量的小瓶和瓶。制剂中GS的浓度对于递送一定量的GS是有效的，所述一定量的GS在施用后，对降低或消除肝中的脂肪沉积是有效的，使得肝至少在肝细胞内不存在脂肪或基本上不存在脂肪的方面看起来是正常或健康的。GS的浓度和量将取决于若干因素，包括受试者中底物的水平和施用模式，并且可以凭经验确定。本文提供的组合物中GS的示例性浓度包括但不限于以下或约以下的浓度：0.1mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、200mg/mL、300mg/mL、400mg/mL、500mg/mL、1000mg/mL、2000mg/mL、3000mg/mL、4000mg/mL或5000mg/mLGS或更多。为了配制GS组合物，在一种实施方案中，将重量分数的GS以期望的浓度溶解、悬浮、分散或以其他方式混合在选定的媒介物中。所得混合物是溶液、悬浮液、乳液和其他这样的混合物，并且可以被配制为非水性或水性混合物，包括但不限于，溶液、悬浮液、糊剂、凝胶、气雾剂、喷雾剂或任何其他合适用于全身施用的制剂。通常，GS组合物根据监管机构的批准被制备，或者根据公认的用于动物和人类的药典以其他方式制备。GS组合物可以包括载体，诸如稀释剂、赋形剂或媒介物。这样的药物载体可以是无菌液体，诸如水和油。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可被用作液体载体，特别是用于可注射溶液。组合物可以包含活性成分以及以下：稀释剂，诸如乳糖、蔗糖、磷酸氢钙或羧甲基纤维素；润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石；以及粘合剂，诸如淀粉、天然树胶(诸如阿拉伯胶)、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚维酮、交联聚维酮和本领域技术人员已知的其他此类粘合剂。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙二醇、水和乙醇。如果需要，GS组合物还可以包含少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸钠、环糊精衍生物、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯和其他此类剂。合适的药物载体的实例由E.W.Martin在“Remington'sPharmaceuticalSciences”中描述。脂质体悬浮液(包括组织靶向的脂质体)，也可以适合作为药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法进行制备。脂质体递送也可以包括缓释制剂，包括药物基质，诸如胶原凝胶和用纤连蛋白修饰的脂质体。除了在药物组合物中，还可以将GS以其他方式配制或施用，例如在营养组合物诸如膳食补充剂中，例如肠胃外营养组合物(例如单独的或与其他补充成分一起)。合适地，营养补充剂可以以一定的剂量方案提供，使得足够的GS到达消化道，以便对氨具有解毒作用。GS可以以多肽(例如纯化的酶)或以表达性宿主细胞或生物体的一部分被包括在这些食品中。因此，例如微生物(例如酵母或细菌或真菌)宿主细胞或植物(包括植物细胞)可以被工程化以表达GS并且可以如此施用，例如完整细胞或提取物或其他加工的产品(其中酶活性可以被保留)，或者可以掺入营养组合物中。因此，例如，适于人类或非人类动物服用的细菌或酵母细胞可以被工程化以表达GS(即通过引入包含编码GS的核苷酸序列的核酸分子)。可选地，植物可以以类似的方式被工程化，并且可以提供合适的植物部分等(例如种子、叶、块茎等)用于施用。本领域已知哪些微生物(例如酵母、细菌、藻类或真菌)适于人类或其他动物服用，并且许多这类生物现在被使用，例如用于益生制剂中。可以使用任何这样的益生生物体或制剂，例如基于乳酸菌，诸如双歧杆菌属的种(Bifidobacteriumsp.)或乳杆菌属的种(Lactobacillussp.)(例如嗜酸乳杆菌(L.acidophilus))等。因此，根据本发明，这样的生物体或制备物可以被配制用于并直接施用至胃肠(GI)道中，例如通过注射或输注或者灌肠或直肠施用等。被施用至受试者的GS的精确的量或剂量取决于GS的活性、施用途径、被治疗的疾病或状况、施用的剂量的次数以及其他考虑因素，诸如受试者的体重、年龄和一般状态。特定的剂量和施用方案可以根据经验确定或从例如动物模型中的研究进行推断。GS的示例性治疗有效剂量包括但不限于，从每天0.1mg/kg体重或从每天约0.1mg/kg体重至每天10000mg/kg体重或至每天约10000mg/kg体重，包括从每天1mg/kg体重或从每天约1mg/kg体重至每天1000mg/kg体重或至每天约1000mg/kg体重，或从每天10mg/kg体重或从每天约10mg/kg体重至每天100mg/kg体重或至每天约100mg/kg体重。因此，例如受试者可以每天被施用0.1mg/kg体重、0.2mg/kg体重、0.3mg/kg体重、0.4mg/kg体重、0.5mg/kg体重、1mg/kg体重、5mg/kg体重、10mg/kg体重、20mg/kg体重、30mg/kg体重、40mg/kg体重、50mg/kg体重、60μg/kg体重、70μg/kg体重、80μg/kg体重、90μg/kg体重、100mg/kg体重、200mg/kg体重、400mg/kg体重、600mg/kg体重、800mg/kg体重、1000mg/kg体重、2000mg/kg体重、4000mg/kg体重、6000mg/kg体重、8000mg/kg体重、10000mg/kg体重或20000mg/kg体重或更多的GS。本发明的一个特征是GS为全身施用。因此，GS可以通过向身体全身性递送GS的任何方法和途径被施用。在某些实施方案中，可以将GS肠胃外施用。本领域技术人员将容易理解并能够选择合适的施用或递送模式，包括但不限于，静脉内、肌肉内、皮内、经皮、皮下或腹膜内施用，以及通过其任何两种或更多种的任何组合，以适于每种施用途径的方式进行配制。在一些情况下，如本文描述的GS或GS组合物或产品可以皮下施用。在其他情况下，如本文描述的GS或GS组合物或产品可以静脉内施用。例如，GS组合物可以通过注射或输注静脉内施用，诸如通过静脉推注。全身施用可以是口服。口服施用意指经口服递送。因此，非口服意指GS不是通过经由口摄入施用。可以包括递送GS蛋白至肠道或更通常地胃肠(GI)道的其他施用方式(例如经直肠地、通过灌肠或直接施用至GI道内)。在另外的实施方案中，本发明不包括施用至肌肉，特别是施用至骨骼肌。因此，在这样的实施方案中，施用不是针对肌肉的，即，是非针对肌肉(non-muscledirected)的疗法。GS也可以与其他治疗剂或活性剂，尤其是可以治疗(例如改善)脂肪性肝病的第二种或另外的治疗剂联合或组合施用。第二种剂或另外的剂通常是降氨剂诸如氮清除剂(或氨清除剂)或替代氨基酸或尿素循环中间体或其类似物。因此，这类剂可以包括氨基酸，例如精氨酸、谷氨酸、瓜氨酸和/或鸟氨酸，和/或N-乙酰谷氨酸和/或类似物分子氨基甲酰谷氨酸()。更合适地，第二或另外的剂是降氨剂，更合适地是氮清除剂。这样的实施方案产生了本发明的某些方面。术语“降氨剂”是指去除氨(例如从被治疗的受试者的血液中)和/或降低或抑制氨产生的化合物。降氨剂也可以称为氨清除剂。降氨剂可以是降低血液氨浓度的剂。降氨剂可以是增加受试者中氨的排泄或降低其产生的剂或化合物。氨的排泄可以通过提供与氨结合并被排出的化合物而增加。降氨剂可以是小分子。降氨剂可以选自由以下组成的组：氮清除剂、离子交换树脂(例如Relypsa)、氨吸收剂(诸如基于脂质体的氨吸收剂，例如Versantis)、去除氨的工程化微生物组(例如Synlogic)、利福昔明和乳果糖。如本文使用的术语“氮清除剂”是指通过去除氨来降低受试者中氮和/或氨的水平的化合物或剂。合适地，氮清除剂降低血液氨浓度。术语氨清除剂和氮清除剂是本领域技术人员理解的。在合适的实施方案中，氮清除剂通过被代谢为苯乙酰谷氨酰胺降低受试者中氮和/或氨的量(合适地血液浓度)，苯乙酰谷氨酰胺可以随后在尿液中排出。在合适的实施方案中，氮清除剂可以选自由以下组成的组：苯乙酸的药学上可接受的盐(本文也称为苯乙酸盐(phenylacetate))、苯丁酸的药学上可接受的盐(本文也称为苯丁酸盐(phenylbutyrate))、苯丁酸甘油酯(glycerolphenylbutyrate)、苯甲酸的药学上可接受的盐、其药学上可接受的前药和氨结合树脂。其他氮清除剂将是本领域技术人员熟知的。如本文使用的，术语“药学上可接受的盐”包括，例如，足够碱性的苯乙酸的酸加成盐，例如与以下的酸加成盐：例如无机酸或有机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸、柠檬酸、甲烷磺酸或马来酸。此外，足够酸性的苯乙酸的合适的药学上可接受的盐是碱金属盐，例如钠盐或钾盐，碱土金属盐，例如钙盐或镁盐，铵盐或与提供药学上可接受的阳离子的有机碱的盐，例如与甲胺、二甲胺、三甲胺、哌啶、吗啉或三-(2-羟乙基)胺的盐。在合适的实施方案中，苯乙酸的药学上可接受的盐可选自由苯乙酸钠、苯乙酸钾、苯乙酸鸟氨酸组成的组。在合适的实施方案中，苯丁酸的药学上可接受的盐可以选自由苯丁酸钠和苯丁酸钾组成的组。在合适的实施方案中，苯甲酸的药学上可接受的盐可以选自由苯甲酸钠和苯甲酸钾组成的组。应当理解，降氨剂可以以溶剂化和非溶剂化形式(诸如，例如水合形式)存在。应当理解，在本发明的上下文中，包括所有这些溶剂化和非溶剂化的形式。如本文使用的术语“前药”是指通过化学部分或生物部分使其活性低于降氨剂(诸如氮清除剂)的剂，但其在体内代谢为降氨剂或经历水解以形成降氨剂。特别地，优选诸如苯乙酸盐或苯丁酸盐化合物的剂，其发挥作用以从循环中除去谷氨酰胺(谷氨酰胺是通过GS的作用形成)。第二种或另外的剂，诸如降氨剂，可以与GS蛋白单独施用、顺序施用或同时施用，包括在相同的制剂或组合物中，或在单独的组合物或制剂中。第二种或另外的剂可以通过相同的施用途径或通过不同的施用途径被施用，包括口服。因此，在一种示例性实施方案中，第二种或另外的剂，诸如降氨剂，可以口服施用，或者通过其他全身性方式施用，并且GS可以通过非口服全身性方式施用。降氨剂，诸如氮清除剂(包括苯乙酸钠、苯乙酸鸟氨酸、苯丁酸钠或苯甲酸钠)，可以通过静脉内输注施用例如用于急性处理，和/或口服施用例如用于长期维持。静脉内(i.v.)输注可以是外周的，但中心i.v.输注是优选的。类似地，氨基酸诸如精氨酸可以口服或i.v.施用，例如通过中心i.v.输注。可以提供这样的试剂盒用于在治疗或预防脂肪性肝病中使用。该试剂盒的组分可以作为单独的药物组合物提供，该药物组合物包含所讨论的剂和一种或更多种药学上可接受的载体或赋形剂一起。本发明的组合物可以被施用一次或多于一次。如果组合物被施用多于一次，它们可以按规律的间隔或按需要被施用，例如由临床医生确定。规律的间隔可以包括，例如，大约每天、每周、每两周、每月或任何其他间隔。选择治疗方案完全在技术人员的技能水平之内。例如，方案可以基于动物模型中的研究来确定。在其他实例中，如果血液中的氨水平高于预定水平，可以向受试者施用重复剂量的组合物。GS蛋白的用途，或与GS蛋白组合的降氨剂的用途，根据本发明对于治疗基因治疗不适合(suitable)或不适当(appropriate)的受试者是有利的，例如儿童或基因治疗难治的受试者。这种难治的受试者可以包括例如先前已暴露于用于递送基因疗法的病毒载体、或已对用于递送基因疗法的病毒载体具有免疫反应的那些受试者。有利地，蛋白作为治疗剂的用途允许将更高剂量的活性蛋白递送至受试者，并且允许根据受试者和根据需求调整剂量。此外，与基因疗法相比，蛋白疗法允许更快的响应，并因此更适合应急使用。如上所述，本发明的一个方面涉及包含降氨剂的药物组合物，该药物组合物用于与GS蛋白组合使用用于在治疗或预防脂肪性肝病中使用。降氨剂可以被配制为用于向受试者施用的药物组合物。通过将选定量的氮清除剂与一种或更多种生理学上或药学上可接受的载体或赋形剂混合，可以将降氨剂以任何常规方式配制。合适地，组合物可以用于非口服全身施用、或口服施用。应当理解，药物组合物也可以包含GS蛋白。在这样的实施方案中，组合物将被配制用于非口服全身施用。载体或赋形剂的选择在用药从业者的技能范围内，并可取决于许多参数，诸如施用的模式。在某些例子中，降氨剂被作为流体提供。在其他情况下，降氨剂被以干燥的形式提供。可以将这种干燥的形式通过添加合适的溶液，诸如水、缓冲液、盐水或其他合适的溶液在施用前再水合。降氨剂可以被配制用于直接施用，或可以配制用于稀释或其他调整。因此，降氨剂可以以单(或单位)剂量形式或多个剂量形式被配制。单剂量形式的实例包括安瓿和注射器。多个剂量形式的实例包括包含多个单位剂量的小瓶和瓶。制剂中降氨剂的浓度对于递送一定量的降氨剂是有效的，该量在施用后，对于从循环中去除氮和/或铵，或者降低或抑制氨的产生是有效的。浓度和量将取决于几个因素，包括受试者中底物的水平和施用模式，并且可以凭经验确定。本文提供的组合物中降氨剂的示例性浓度包括但不限于以下或约以下的浓度：0.1mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、200mg/mL、300mg/mL、400mg/mL、500mg/mL、1000mg/mL、2000mg/mL、3000mg/mL、4000mg/mL或5000mg/mL的降氨剂或更多。为了配制降氨剂组合物，在一种实施方案中，将重量分数的降氨剂以期望的浓度溶解、悬浮、分散或以其他方式混合在选定的媒介物中。所得混合物是溶液、悬浮液、乳液和其他这样的混合物，并且可以被配制为非水性或水性混合物，包括但不限于，溶液、悬浮液、糊剂、凝胶、气雾剂、喷雾剂或任何其他合适用于全身施用的制剂。通常，降氨剂根据监管机构的批准被制备，或者根据公认用于动物和人类的药典以其他方式制备。该组合物可以包括载体，诸如稀释剂、赋形剂或媒介物。这种药物载体可以是无菌液体，诸如水和油。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可被用作液体载体，特别是用于可注射溶液。组合物可以包含活性成分以及以下：稀释剂，诸如乳糖、蔗糖、磷酸氢钙或羧甲基纤维素；润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石；以及粘合剂，诸如淀粉、天然树胶(诸如阿拉伯胶)、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚维酮、交联聚维酮和本领域技术人员已知的其他此类粘合剂。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙二醇、水和乙醇。如果需要，苯乙酸或其药学上可接受的盐组合物也可以包含少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸钠、环糊精衍生物、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯和其他此类剂。合适药物载体的其他实例将对本领域技术人员是已知的。降氨剂可以通过向身体递送化合物的任何方法和途径被施用。在某些实施方案中，降氨剂可以被肠胃外施用。本领域技术人员将容易理解并能够选择合适的施用或递送模式，包括但不限于，口服、静脉内、肌肉内、皮内、经皮、皮下或腹膜内施用，以及通过其任何两种或更多种的任何组合施用，配制以适合每种施用途径的方式进行。如同在药物组合物中，还可以将降氨剂以其他方式配制或施用，例如在营养组合物如膳食补充剂中，例如肠胃外营养组合物(例如单独或与其他补充成分一起)。合适地，这种组合物可以用于口服或非口服施用。如上所述，降氨剂用于与GS组合施用。应当理解，降氨剂可以与GS单独施用、顺序施用或同时施用，包括在相同的制剂或组合物中，或在单独的组合物或制剂中。因此，在一个示例性实施方案中，降氨剂可以口服施用，或者通过其他全身性方式施用，并且GS可以通过非口服全身性方式施用。降氨剂的示例性治疗有效剂量包括但不限于，从约每天1mg/kg体重至或至约每天2000mg/kg体重，包括从或从约每天10mg/kg体重至或至约1000mg/kg体重，或从或从约每天100mg/kg至或至约500mg/kg体重。因此，例如，受试者可以每天被施用1mg/kg体重、2mg/kg体重、3mg/kg体重、4mg/kg体重、5mg/kg体重、10mg/kg体重、20mg/kg体重、30mg/kg体重、40mg/kg体重、50mg/kg体重、60mg/kg体重、70mg/kg体重、80mg/kg体重、90mg/kg体重、100mg/kg体重、150mg/kg体重、200mg/kg体重、250mg/kg体重、300mg/kg体重、350mg/kg体重、400mg/kg体重、450mg/kg体重、500mg/kg体重、550mg/kg体重、600mg/kg体重、650mg/kg体重、700mg/kg体重、750mg/kg体重、800mg/kg体重、850mg/kg体重、900mg/kg体重、950mg/kg体重、1000mg/kg体重或2000mg/kg体重或更多的降氨剂。降氨剂的其他示例性治疗有效剂量，包括但不限于，从约1g/天至约50g/天。因此，例如，受试者可以每天被施用1克、2克、3克、4克、5克、10克、20克、30克、40克或50克或更多的降氨剂。应当理解，有效剂量可以根据降氨剂而变化。如果需要，GS组合物和/或包含降氨剂的组合物或包含非降氨剂的另外的剂的组合物可以在包装、在试剂盒或分配装置中提供，诸如带有针头的注射器或小瓶和带有针头的注射器，其可以包含一种或更多种单位剂量形式。试剂盒或分配装置可以附有施用说明。在GS组合物和包含降氨剂的组合物是单独的实施方案中，试剂盒可以包含GS组合物和包含降氨剂的组合物。合适地，在这样的实施方案中，试剂盒可以包含GS组合物和氮清除剂。合适地，在这样的实施方案中，试剂盒可以包含GS组合物，和包含苯乙酸，例如苯乙酸钠的组合物。组合物可以包装为包含包装材料、组合物和标签的制品，该标签指示组合物用于向受试者施用用于脂肪性肝病或与脂肪性肝病相关的疾病或状况的治疗。合适的全身施用方法将是本领域技术人员已知的。作为实例，全身施用可以通过肠胃外施用途径实现，诸如静脉内或皮下途径。应当理解，“全身施用”允许将表达载体的产物(诸如谷氨酰胺合成酶或其生物片段)在患者中的多个部位内表达。在本发明的上下文中，全身施用不包括肌肉内施用。应当理解(除非上下文另有要求)，参考用于在治疗脂肪性肝病中使用的GS、用于与降氨剂组合使用的GS蛋白、用于与GS组合使用的降氨剂，它们的用途、治疗方法、组合物、试剂盒和产品描述的，将通常可适用于本发明的其余方面。现在，参考以下的非限制性实施例和附图将进一步描述本发明，在附图中：图1示出了如实施例1中制备的人类GS蛋白的20kDaN末端醛PEG缀合物在Superose12柱上的尺寸排阻层析(SEC)的结果。该图示出了多聚体被洗脱在级分8和级分9中，而单体被洗脱在级分10中；图2示出了各种GS候选物的体外GS活性的比较：PEG缀合的变体(GS1、GS2、GS3、GS4)与非缀合的GS(wtGS)和阴性对照。谷氨酰胺合成酶活性以根据Acosta等人，2009,WorldJ.Gastroenterol.,15(23),2893-2899的测定的OD570nm显示。GS1–(N末端醛单体)；GS2–Nof-20TM；GS3–Nof-30TM，GS4–N末端醛多聚体；图3示出了雄性野生型(wt)CD1小鼠在各种缀合物给药前和给药后血浆PEGELISA的结果，(A)基线、(B)给药后24小时和(C)给药后72小时。(1–N末端醛缀合的GS单体；2–Nof-20TMGS缀合的多聚体；3–Nof-30TM缀合的GS多聚体；4–N末端醛缀合的PEG多聚体)；图4示出了，如实施例3中描述的，在以2.5mg/kg给药的wtCD1小鼠中，给药后3天，肝裂解物中的GS活性(OD535nm)结果。图5A示出了肝GS活性测定结果。图5B示出了血浆GS活性测定结果。在用GS蛋白、以及GS蛋白与氮清除剂治疗的胆管结扎(BDL)大鼠中，测定肝和血浆两者的GS活性。图6示出了给药和未给药的OTC小鼠的(用苏木精和伊红)染色的肝活检。与未给药的小鼠相比，重组人类GS蛋白给药的小鼠显示出正常的肝结构。图7示出了如实施例6中描述的对照和GS给药的小鼠中的氨水平。图8示出了根据数字FPA分析，如实施例6中描述的对照、GS(AM535)给药的MCD小鼠的肝切片中脂肪的百分比(％)。图9以图的形式示出了根据实施例7的HFHC大鼠CPA(胶原比例面积)的结果。图10示出了根据实施例7，GS酶(AM-535)每两周一次、给药7周后对纤维化(具有天狼星红染色)的影响；展示出与正常的非HFHC饮食动物相同的CPA水平。实施例1GS蛋白和GS蛋白-PEG缀合物的产生和纯化人类谷氨酰胺合成酶(GS)的产生：pET30a+载体，包含人类GS基因(SEQIDNO.5，包含编码His标签的5‘序列和位于GS的N末端的接头GGGGS，并针对细菌中的表达进行了密码子优化)，用于大肠杆菌表达系统。质粒构建后，用宽范围的诱导(IPTG)和表达温度进行对GS的表达的评估。如通过SDS-PAGE检测的，人类GS在构建体中可溶地表达。使用裂解缓冲液(50mMTrispH8.0、10％甘油、0.1％TritonX-100、100ug/ml溶菌酶、1mMPMSF、3单位DNA酶、2mMMgCl2)从细胞提取可溶性蛋白。离心后提取可溶性蛋白。表达研究后，发现了对于BL21(DE3)细胞的最佳条件，用0.1mMIPTG在25℃培养和诱导16小时。尝试过的其他条件包括使用各种IPTG诱导(从0.01M至0.1MIPTG)，各种培养温度(范围为16℃-37℃)，以及4-16小时的诱导培养时间。表达的GS的纯化：表达的蛋白的第一步纯化包括用Ni-NTA珠进行His标签纯化，用20mM咪唑洗涤，并用300mM咪唑洗脱。蛋白PEG缀合：在还原条件下(其中使用20mM氰基硼氢化钠)将GS蛋白缀合至20kDa的N末端醛peg持续16小时(Reddy博士的20kDaN末端醛PEG)。最终纯化：将缀合的蛋白使用SEC层析进一步纯化。使用Superose6或Superose12柱(参见图1)。在级分8±9中发现多聚体。Superose12中的级分10包含(稀释的)多聚体。在Superose6中，在级分8+9中发现多聚体，并且在级分12/13中发现单体。制备了pH7.4的含海藻糖和蔗糖的PBS中的GS的最终制剂。实施例2GS制备物的活性使用Acosta等人，2009(同上)的测定测试了根据实施例1制备的各种GS制备物和PEG缀合物的GS活性，Acosta等人，2009(同上)的测定是从Ehrenfeld等人，1963,J.Biol.Chem.238(11),3711-3716中描述的原始测定修改而来的。将100ug纯化的蛋白样品添加至以下反应缓冲液中：150μL储备溶液(100mmol/L咪唑-HCl缓冲液[pH7.1]、40mmol/LMgCl2、50mmol/Lβ-巯基乙醇、20mmol/LATP、100mmol/L谷氨酸和200mmol/L羟胺，调整至pH7.2)。将管在37℃孵育15min。通过添加0.6mL[2×浓度]氯化铁试剂(0.37mol/LFeCl3、0.67mol/LHCl和0.20mol/L三氯乙酸)停止反应。将样品在冰上放置5分钟。通过以10,000g离心去除沉淀的蛋白，并且相对于试剂空白在535-570nm处读取上清液的吸光度。结果在图2中示出。Trin1–(20kD尺寸的N末端醛单体PEG，获得自Reddy博士)；Trin2–Nof-20缀合的GS蛋白，用从NOFcorporation获得的单官能团线性20kDPEG(NHS活性酯)与GS蛋白缀合；Trin3–Nof-30，用单官能团线性30kDPEG(NHS活性酯，获得自NOFcorporation)与GS蛋白缀合；Trin4–N末端Ald,GS多聚体。Trin4(N末端Ald多聚体)显示出最佳的活性，与wtGS(非缀合的)相比具有非常相似的活性谱，然而其他缀合物的活性是相似的。实施例3GS蛋白给药至小鼠—GS蛋白-PEG缀合物对血浆水平的作用用如实施例1中描述制备的各种GS蛋白和PEG缀合物(Trin1–N末端醛缀合的GS单体；Trin2–Nof-20GS缀合的多聚体；Trin3–Nof-30缀合的GS多聚体；Trin4–N末端醛缀合的PEG多聚体)皮下(s.c)给药，向雄性野生型(wt)CD1小鼠进行2.5mg/kg的给药。ELISA根据制造商概述的方案进行(AbcamPEGELISA试剂盒，ab133065)。如图3所示，血浆ELISA的结果示出，如预期的，在所有时间点，未缀合的wtGS的水平非常低或者检测不到。24小时后，发现几种候选物在血浆中处于高水平；然而，给药后72小时之后，Trin-GS4(N末端醛缀合的PEGGS多聚体)显示出最高的存在。N＝每组中2只动物。因此，此实验显示，GS蛋白的全身施用可以成功用于获得GSPEG缀合物的高循环水平，并且特别是可能是治疗有效或有治疗活性的水平。实施例4GS蛋白给药至小鼠—肝裂解物的GS活性水平活性测定如实施例2中描述的进行，除了在适当情况下将500μg肝裂解物(来自从实施例3实验处死的小鼠)添加至每个反应以外。结果在图4中示出。给药后3天肝裂解物中的GS活性结果表明，最佳候选物是N末端醛缀合的PEGGS多聚体，与媒介物(盐水给药)对照相比，N末端醛缀合的PEGGS多聚体是显示出高于基线的显著活性的唯一候选物。N＝每组中2只动物。实施例5使用尿素循环障碍Otcspf-ash小鼠模型(OTC缺乏)示出GS和GS+SP的作用。所使用的小鼠的详情可见于https://www.jax.org/strain/001811(B6EiC3Sna/A-Otcspf-ash/J)。它们用正常食物喂养。鼠龄从约10周至23周不等，各组匹配良好。所有动物都是雄性半合子的(因为OTC是X连锁的，它只存在于雄性的X染色体上，因此小鼠是敲除的)。使用包含N末端GGGS接头和GGGGS接头的非聚乙二醇化的人类GS。这在图6中称为AM535。将所有组(媒介物、GS和GS+SP；其中GS＝谷氨酰胺合成酶，GS+SP＝谷氨酰胺合成酶+苯乙酸钠)进行如下处理：实验从周二进行直至下一个周三(8天)。将SPi.p.给药350mg/kg，每天两次；在前4天，将GS在所有处理组中给药(i.p.@40mg/kg，每天一次)，然后休息2天[周末]，并且另外3天用GS@40mg/kgi.p.给药。在第8天将小鼠处死，并抽取血液，离心以分离血浆，并将该血浆用于氨定量(参见下文的方法)。基因分型使用文献中描述的标准方法进行。材料和方法所有实验均根据1986年动物(科学程序)法案(Animals(ScientificProcedures)Act)进行，该法案根据欧洲指令2010/63/EU进行了修订。根据实验动物护理和使用指南(GuidefortheCareandUseofLaboratoryAnimals)(美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)出版物86-23；1985年修订)中概述的标准，所有动物都得到人道护理。这些实验中使用的所有动物是雄性Sprague-Dawley大鼠(在实验开始时，体重250g)，获得自CharlesRiverLaboratories(Kent,UK)并被分成5组：胆管结扎动物+氨+盐水血清(BDL+HA+SS，n＝6)、胆管结扎动物+氨+苯乙酸钠(BDL+HA+SP，n＝6)、胆管结扎动物+氨+苯乙酸钠+谷氨酰胺合成酶(BDL+HA+SP+GS,n＝5)、胆管结扎动物+氨+谷氨酰胺合成酶(BDL+HA+GS,n＝6)、假手术动物+谷氨酰胺合成酶(SHAM+GS,n＝5)。包含SP和GS的处理可称为“COMBO”。胆管结扎手术在全身麻醉下(100％氧气中5％异氟醚用于诱导，空气中2％异氟醚用于维持)，大鼠接受胆管三重结扎(小开腹手术的方法)以诱导慢性肝损伤，并在手术后28天进行研究。在麻醉下进行中线腹部切口。在BDL组中，将胆总管分离，用3-0丝三重结扎，并在结扎之间切开。假手术组进行了相同的手术，没有结扎之间的切开。在BDL之后，所有动物继续增重，并且与假对照相当。两组中的总死亡率小于10％并且发生在手术的36小时内。非肝硬化高氨血症状况23只大鼠被施用高氨血症(HA)饮食。在约100g的母液(stock)中使用的氨基酸配方是：15g亮氨酸、7.7g苯丙氨酸、7g谷氨酸、10g丙氨酸、4.4g脯氨酸、5.8g苏氨酸、11g天冬氨酸、5g丝氨酸、4.8g甘氨酸、3.3g精氨酸、9.6g赖氨酸、8.4g组氨酸、3g酪氨酸、1.5g色氨酸和10.6g缬氨酸。25g的此混合物(与标准啮齿动物食物粉以1:5混合)每天新鲜制备并且大鼠自由获取该混合物持续5天。该配方近似于啮齿动物血红蛋白的氨基酸组成[1]，模拟已知会导致全身高氨血症的胃肠道出血的作用[2]。苯乙酸钠条件向11只大鼠施用苯乙酸钠(SP)饮食。每天0.3g/kg，持续5天，与食物粉混合，并每天新鲜制备。谷氨酰胺合成酶条件用GS每两天(第1天和第3天)腹膜内注射16只大鼠。注射的总体积为3mli.p.，其允许18-22mg/kg的GS。结果GS蛋白给药至大鼠—肝和血液中GS活性水平活性测定按照上文材料和方法部分所述进行。结果在图5A和图5B中示出。在第5天测量的大鼠肝中的结果显示SHAM+GS组中GS活性最佳。此外，从图5A可以观察到，GS和GS+SP处理增加了已经历BDL的大鼠肝中的GS活性。当在血液中测量时，结果显示GS活性在BDL+GS组中最佳。此外，从图5B可以观察到血液中的GS活性随着时间的推移(甚至给药后24h和48h)是一致的。OTC小鼠肝的苏木精和伊红(H&E)染色染色方法包括应用由铝离子和氧化苏木精形成的复合物矾紫(hemalum)。这使细胞的细胞核染色为蓝色。细胞核染色后用伊红Y的水性溶液或醇溶液进行复染，伊红Y使嗜酸性的其他结构染色为不同深浅(shades)的红色、粉红色和橙色。矾紫对细胞核的染色不需要DNA的存在，并且可能是由于染料-金属复合物与富含精氨酸的碱性核蛋白诸如组蛋白的结合。伊红是一种荧光红色染料，由溴对荧光素的作用产生。伊红可以用来染色细胞质，用于在显微镜下检查。容易被伊红染色的结构称为嗜酸性的。在H&E(苏木精和伊红)染色中，伊红最常用作苏木精的复染色。伊红将红细胞染成深红色。伊红是一种酸性染料，并且出现在细胞的碱性部分，即细胞质中。因此，用H&E染色的肝样本通常显示蓝色细胞核，细胞质和细胞外基质呈不同深浅的粉红色。我们使用40×光学显微镜，在H&E染色后拍照，并相应地比较给药组与未给药组。在该方案中，组织取自动物实验，保存在石蜡中，在切片机上切片(约4-9μm切片)，并放置在载玻片上，准备进行染色和/或IHC分析。溶液/缓冲液●>98％二甲苯(Fisher超纯SLRFisherChemicalX/0200/17)●>98％丙醇(SigmaAldrich，目录号I9516)●H2O(蒸馏)●苏木精溶液(SigmaAldrich，目录号MHS1)●伊红Y溶液(SigmaAldrich，目录号E4009)对于本实验，将小鼠(OTC半合子雄性)在8天内以40mg/kg的剂量腹膜内给药重组人类GS蛋白(如前描述)，并且在处死后收获肝。为了本研究的目的，将小鼠肝分成两组：1.重组人类GS(AM-535)，2.对照/媒介物。检查两组小鼠肝的基本病理学，包括H&E染色。在所有6种酶相关的尿素循环障碍中，均已注意到脂肪变性/脂肪肝样疾病[Bigot等人2017‘Liverinvolvementinureacycledisorders:areviewoftheliterature]。已经显示尿素循环在NAFLD(非酒精性脂肪性肝病)中是失调的[Chiara等人2018‘Ureacycledysregulationinnon-alcoholicfattyliverdisease]。将石蜡组织块(固定的和石蜡化的)在Lamb冷却块(型号TC-10)上在-10℃保持冷却。将样品用切片机切片。肝切片以4μm厚度切片；肾以4μm切片；脑组织以8μm切片。切片后，将组织放置入热水浴(加热至55摄氏度)中持续几秒钟，并且然后放置在载玻片上(经由用载玻片浸入水中，将组织放置在载玻片上)。1.将组织脱石蜡：将组织在二甲苯中‘浸泡(dunk)’45sec2.去除二甲苯并固定：在丙醇中浸泡45sec3.苏木精染色：每50-100mm2施加1滴苏木精染料，并且等待45sec(通常每张载玻片需要约5滴)4.苏木精冲洗：用温水(30℃)(推荐蒸馏H2O)剧烈冲洗苏木精残余物约45sec5.伊红染色：施加2-3滴伊红染料，并且等待30sec6.伊红冲洗：用冷水(蒸馏H2O)再次冲洗15sec7.最终清洗：在丙醇中浸泡45sec，并且然后在二甲苯中浸泡45sec结果细胞核应为蓝色，细胞质为粉红色至红色。重组人类GS处理的小鼠(参见图6)显示出正常的肝结构和细胞完整性，具有非常少的纤维化和总体相当健康的肝。相比之下，对照(未给药)组中的小鼠显示出明显地不太健康的肝，表明出现脂肪变性和脂肪肝样疾病。肝细胞脂肪变性可以通过存在单个大脂肪滴以及细胞核向细胞外周移位(大泡性脂肪变性)或小脂滴而无细胞核移位(微泡性脂肪变性)来鉴定。前者是典型的NAFLD，并且后者与NASH中的炎症相关。这些结果显示，该OTC小鼠模型可能包括NAFLD和NASH两者，并且可以观察到给药动物的肝健康的明确且非常显著的改善(参见图6)。这些结果表明，GS疗法是用于治疗和逆转肝脂肪变性(包括脂肪肝、NASH(非酒精性脂肪性肝炎)和相关肝病紊乱)的潜在工具。在短期给药(8天)中，AM-535给药(重组GS酶)(OTC半合子)小鼠的纤维化样表型与对照小鼠显著不同，表明在该短期时间段内出现对脂肪肝型进展的逆转和抑制。这是首次非常强有力的指示，即GS疗法可以用于治疗和逆转脂肪变性及相关疾病(包括NAFLD、NASH和纤维化)。实施例6小鼠MCD研究最广泛使用的诱导NAFLD/NASH的饮食是甲硫氨酸-胆碱缺乏(MCD)饮食。标准的MCD饮食还具有高含量的蔗糖(能量的40％)，并且适度富含脂肪(10％-20％)。这是高度可重复的模型[5]。使用聚乙二醇化的人类重组GS，具有N末端GGGS-HHHHHH-GGGGS接头/标签序列。进行研究，以调查这种GS(在图7中称为AM535)在该模型中是否有效，并且是否能够潜在地降低脂肪，并且是否能够成为NAFLD/NASH适应症的潜在候选物。方法小鼠模型背景、表型：小鼠：C57/黑色性别：雌性体重：25g-30g鼠龄：>7周MCD饮食剂量：每天5g/每只小鼠+在适当的情况下药物干预MCD饮食组成：甲硫氨酸/胆碱缺乏饮食组成(量g/kg饮食)：蔗糖455.3gm玉米淀粉200.0gm玉米油100.0gmAlphacelNon-NutritiveBulk30.0gmAIN76矿物混合物35.0gmAIN76矿物混合物组成(gm/kg)：磷酸氢钙500.00gm氯化钠74.00gm柠檬酸钾一水合物220.00gm硫酸钾52.00gm氧化镁24.00gm碳酸锰(43％-48％Mn)3.50gm柠檬酸铁(16％-17％Fe)6.00gm碳酸锌(70％ZnO)1.60gm碳酸铜(53％-55％Cu)0.30gm碘酸钾0.01gm亚硒酸钠0.01gm硫酸铬钾0.55gm蔗糖细粉118.00gm–磷酸氢钙3.0gm、L-丙氨酸3.5gm、L-精氨酸盐酸盐12.1gm、L-天冬酰胺一水合物6.0gm、L-天冬氨酸3.5gm、L-胱氨酸3.5gm、L-谷氨酸40.0gm、甘氨酸23.3gm、L-组氨酸盐酸盐4.5gm、L-异亮氨酸8.2gm、L-亮氨酸11.1gm、L-赖氨酸盐酸盐18.0gm、L-苯丙氨酸7.5gm、L-脯氨酸3.5gm、L-丝氨酸3.5gm、L-苏氨酸8.2gm、L-色氨酸1.8gm、L-酪氨酸5.0gm、L-缬氨酸8.2gm、DL-α-生育酚乙酸酯(250u/gm)0.484gm、维生素A棕榈酸酯(250,000u/gm)0.0792gm、维生素D3(400,000u/gm)0.0055gm、乙氧喹0.02gm，维生素混合物–生物素0.0004gm、D-泛酸钙0.0661gm、叶酸0.002gm、肌醇0.1101gm、甲萘醌0.0496gm、烟酸0.0991gm、对氨基苯甲酸0.1101gm、盐酸吡哆醇0.0220gm、核黄素0.022gm、盐酸硫胺素0.022gm、维生素B12(0.1％trit.)0.0297gm、抗坏血酸1.0166gm、玉米淀粉3.4503gm研究方法/概述：在开始饮食前，使MCD小鼠在动物设施中适应(madecomfortable)并饲养至少一周。该研究进行了2.5-4周，具体要求待定。治疗干预根据说明书进行。在处死点采集血氨，同时采集组织并进行组织学检查。这项MCD研究进行了18天，以25mg/kgi.p.给予每周2个剂量的如上文定义的GS。总计，小鼠接受6个剂量的如上文定义的GS。收获器官和血液进行分析。研究组：-2×媒介物对照(注射盐水)-3×GS给药的。处死后分析：氨根据制造商的说明通过AmmoniaFuji检测器使用10ul(新鲜)小鼠血液测量。简言之，将10ul施加至筒，插入Fuji机器。机器(包含溴酚蓝)加热全血样品。当样品被加热时，NH3气体从全血中释放，并且与溴酚蓝混合。然后通过Fuji检测器在OD600nm处读取样品，以给出对氨的估算(以微摩尔/L/uM计)，这在筒插入后2min在控制台上提供给操作员。[https://www.fujifilm.com/products/medical/fdc/pdf/index/NH3-W_9903230-A4.pdf]。如实施例5中描述的，肝经由H&E染色进行分析，并根据[6,7]中概述的方法进行数字脂肪计数(mFPA)。结果氨水平相比于对照小鼠处死后立即测量氨水平，并且从每只小鼠采集10微升全血，并且在Fuji氨检测器上进行分析。在MCD媒介物对照小鼠中，氨显著升高(处于约100μM，被认为是致病性的)，GS给药的动物显示出非常高的氨水平降低(参见图7)，降至非常低的基线(非致病性的)氨水平(平均约40μM)。这种降低显示是高度显著的。H&E染色和脂肪计数：根据以上实施例5中描述的方案进行H&E染色。随后对肝切片进行数字分析，以对给药组与对照组的脂肪进行计数。从独立的mFPA脂肪计数(参见图8)可以观察到，当与媒介物对照动物相比时，给药动物的脂肪显著较低。因此，可以得出结论，在这种MCD模型中，GS显著降低肝中的脂肪。概述发现GS非常显著地降低了氨水平—从致病性氨水平(约100μM)至低的非致病性氨水平(约40μM)。这是GS显示非常显著地降低氨水平的第三个模型。因此，GS可能是进一步致力于高氨血症相关状况(包括尿素循环障碍、肝性脑病和有机酸血症)的优秀候选物。根据H&E染色和随后的脂肪计数，我们还显示重组GS显著降低脂肪水平。与媒介物对照相比，MCD和OTC小鼠模型两者都显示出降低的脂肪水平。实施例7高脂肪高胆固醇大鼠原理/背景高脂肪高胆固醇(HFHC)大鼠是进行性NAFLD(非酒精性脂肪性肝病)、脂肪性肝炎、纤维化和最终肝硬化的模型[9-11]。目的为了确定在16周模型的最后7周，AM-535每周i.p.给药两次(约10mg/kg)是否可以改变该模型的进程并改善疾病进展和结果。研究概述/方法8周龄雄性SpragueDawley大鼠从CharlesRiver，UK获得。在研究开始前，饲养它们并使其适应至少一周。对雄性SD大鼠220–250g喂食高脂肪高胆固醇(100g)饮食或正常食物(100g)饮食持续16周，并且从第9-16周(包括端点)开始随机接受每周两次腹膜内GS(聚乙二醇化人类重组GS，具有N末端GGGS-HHHHHH-GGGGS接头/标签序列，也称为AM-535)或媒介物。处死后，经由心脏穿刺获得血液，并且收获器官用于分析和病理学。组：■正常食物饮食(+媒介物)n＝4■HFHC饮食(+媒介物[盐水])n＝4■HFHC饮食(+GS)n＝4用于处理研究的动物总数n＝12高脂肪高胆固醇饮食组成将肝组织保存在石蜡中，在切片机上切片(约8μm切片)，并且放置在载玻片上，准备染色。进行天狼星红染色以检测胶原：该技术基于染料磺酸基团与胶原纤维碱性基团的紧密结合。简言之，染色方案如下：1.将肝石蜡切片脱蜡并且水合；2在天狼星红溶液(‘Direct80‘，目录号2610-10-8)中染色1小时；3.将切片剧烈振荡或用潮湿的滤纸非常温和地吸干；4.将切片在三次更换的100％乙醇中脱水；5.最后，将切片在二甲苯中清洗，用DPX封固介质封固并成像。结果表1.血氨和体重。注意，氨在任何组中均未升高。处理组相比于媒介物组的肝重量:体重比率平均值也稍低(0.047相比于0.051)，尽管这没有统计学意义。血氨结果显示，所有组在氨方面均未升高(包括媒介物HFHC大鼠)，并且当与媒介物相比时，在GS(AM-535)处理的HFHC大鼠中注意到肝重量:体重比率略有降低。肝病理胶原比例面积(CPA)结果图9示出，GS每两周一次、给药7周后，CPA(胶原蛋白比例面积)显著降低，并且能够展示出与正常饮食动物相同的CPA水平。分析显示，CPA(胶原比例面积)在HFHCAM-535给药动物中显著降低(天狼星红染色的肝切片)。胶原比例面积(CPA)测量通过测量胶原沉积量占总活检面积的比例来量化(人类患者或动物的)肝活检或切片中的纤维组织[11,12]。CPA预测患有脂肪肝和肝硬化的患者的临床结果[13,14]。纤维化是肝中异常大量瘢痕组织的形成。当肝试图修复和替换受损细胞时发生纤维化。因此，纤维化是晚期脂肪性肝病和肝硬化的标志物。概述在这项特别的研究中，对HFHC大鼠喂食高脂肪、高胆固醇饮食16周(或者对未处理的对照动物为正常饮食)。在最后7周，HFHC饮食大鼠以约10mg/kg每周两次给药媒介物(盐水)或GS。处死后，测量临床血液参数。对于大多数血液和体重参数，当将GSHFHC大鼠与媒介物HFHC对照进行比较时，观察到了相似的水平。与CPA被测量为处于相当高的水平的媒介物HFHC动物相比，在经历HFHC饮食的大鼠中，GS能够非常显著地将CPA降低至正常饮食水平。由于在任何组中氨均未升高，因此HFHC模型不是高氨血症模型。此外，尤其是考虑到这种酶疗法的非常低的毒性和高安全性谱，可行的是，给药可以从每周两次的10mg/kg增加。在第10周开始GS给药，并且考虑到在第9周时大鼠将已经患有晚期肝病的事实，这些数据特别有趣，并且表明GS是肝纤维化的潜在治疗。参考文献[1]RiggsA.Theaminoacidcompositionofsomemammalianhemoglobins:mouse，guineapig，andelephant.JBiolChem1963；238:2983-2987.[2]BalataS，OldeDaminkSW，FergusonK，MarshallI，HayesPC，DeutzNE，WilliamsR，WardlawJ，JalanR.Inducedhyperammonemiaaltersneuropsychology，brainMRspectroscopyandmagnetizationtransferincirrhosis.Hepatology2003；37:931-939.[3]Stewart-WallaceAM.Abiochemicalstudyofcerbraltissue，andofchangesincerebraloedema.Brain1939；62:426-38.[4]TraberPG，GangerDR，BleiAT.Brainedemainrabbitswithgalactosamine-inducedfulminanthepatitis.Regionaldifferencesandeffectsonintracranialpressure.Gastroenterology1986；91:1347-56.KiernanJA(2008)HistologicalandHistochemicalMethods:TheoryandPractice.4thed.Bloxham，UK:Scion.LillieRD，PizzolatoP，DonaldsonPT(1976)Nuclearstainswithsolublemetachromemordantlakedyes.Theeffectofchemicalendgroupblockingreactionsandtheartificialintroductionofacidgroupsintotissues.Histochemistry49:23-35.LlewellynBD(2009)Nuclearstainingwithalum-hematoxylin.Biotech.Histochem.84:159-177.[5]Machadoetal；PLoSOne.2015；10(5):e0127991[6，7]Halletal，LiverInt.2014，Oct34(9)1417-1427andHalletal，LiverInt.2013Jul33(6)926-935[8]MarquesetalAdipocyte20165(1)11-21[9]IchimuraetalHepatologyResearchVol45lssue42015458-469[10]JensenetalDiabetologyandMetabolicSyndrome104(2018)[11]BuzettietalAlimentaryPharmacologyandTherapeuticsVol49lssue91214-1222[12]Halletal，Histopathology201362(3)421-430[13]XieetalHeptobiliaryPancreatDisInt201110(5)497-501[14]HuangetalLiverInt2013Sept33(8)1249-1256。序列：SEQIDNO.1[完整人类蛋白]SEQID.NO.2(在体内仅甲硫氨酸被裂解以成为成熟蛋白)：SEQIDNO.3cDNASEQIDNO.4：实施例1中使用的在细菌中产生的GS蛋白SEQIDNO.5cDNA(实施例1中使用的细菌优化的cDNA)。SEQIDNO.6[嗜酸乳杆菌菌株30SCGS]>tr|F0TG87|F0TG87_LACA3谷氨酰胺合成酶OS＝嗜酸乳杆菌(菌株30SC)SEQIDNO.7[玉米(ZeaMays)GS[(玉米(corn)/玉米(Maize)GS)>tr|B4G1P1|B4G1P1_MAIZE谷氨酰胺合成酶序列表<110>托埃瑞斯有限责任公司<120>谷氨酰胺合成酶用于治疗脂肪性肝病的用途<130>P262989WO<150>GB1815892.3<151>2018-09-28<160>13<170>PatentInversion3.5<210>1<211>373<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400>1MetThrThrSerAlaSerSerHisLeuAsnLysGlyIleLysGlnVal151015TyrMetSerLeuProGlnGlyGluLysValGlnAlaMetTyrIleTrp202530IleAspGlyThrGlyGluGlyLeuArgCysLysThrArgThrLeuAsp354045SerGluProLysCysValGluGluLeuProGluTrpAsnPheAspGly505560SerSerThrLeuGlnSerGluGlySerAsnSerAspMetTyrLeuVal65707580ProAlaAlaMetPheArgAspProPheArgLysAspProAsnLysLeu859095ValLeuCysGluValPheLysTyrAsnArgArgProAlaGluThrAsn100105110LeuArgHisThrCysLysArgIleMetAspMetValSerAsnGlnHis115120125ProTrpPheGlyMetGluGlnGluTyrThrLeuMetGlyThrAspGly130135140HisProPheGlyTrpProSerAsnGlyPheProGlyProGlnGlyPro145150155160TyrTyrCysGlyValGlyAlaAspArgAlaTyrGlyArgAspIleVal165170175GluAlaHisTyrArgAlaCysLeuTyrAlaGlyValLysIleAlaGly180185190ThrAsnAlaGluValMetProAlaGlnTrpGluPheGlnIleGlyPro195200205CysGluGlyIleSerMetGlyAspHisLeuTrpValAlaArgPheIle210215220LeuHisArgValCysGluAspPheGlyValIleAlaThrPheAspPro225230235240LysProIleProGlyAsnTrpAsnGlyAlaGlyCysHisThrAsnPhe245250255SerThrLysAlaMetArgGluGluAsnGlyLeuLysTyrIleGluGlu260265270AlaIleGluLysLeuSerLysArgHisGlnTyrHisIleArgAlaTyr275280285AspProLysGlyGlyLeuAspAsnAlaArgArgLeuThrGlyPheHis290295300GluThrSerAsnIleAsnAspPheSerAlaGlyValAlaAsnArgSer305310315320AlaSerIleArgIleProArgThrValGlyGlnGluLysLysGlyTyr325330335PheGluAspArgArgProSerAlaAsnCysAspProPheSerValThr340345350GluAlaLeuIleArgThrCysLeuLeuAsnGluThrGlyAspGluPro355360365PheGlnTyrLysAsn370<210>2<211>372<212>PRT<213>智人(Homosapiens)<400>2ThrThrSerAlaSerSerHisLeuAsnLysGlyIleLysGlnValTyr151015MetSerLeuProGlnGlyGluLysValGlnAlaMetTyrIleTrpIle202530AspGlyThrGlyGluGlyLeuArgCysLysThrArgThrLeuAspSer354045GluProLysCysValGluGluLeuProGluTrpAsnPheAspGlySer505560SerThrLeuGlnSerGluGlySerAsnSerAspMetTyrLeuValPro65707580AlaAlaMetPheArgAspProPheArgLysAspProAsnLysLeuVal859095LeuCysGluValPheLysTyrAsnArgArgProAlaGluThrAsnLeu100105110ArgHisThrCysLysArgIleMetAspMetValSerAsnGlnHisPro115120125TrpPheGlyMetGluGlnGluTyrThrLeuMetGlyThrAspGlyHis130135140ProPheGlyTrpProSerAsnGlyPheProGlyProGlnGlyProTyr145150155160TyrCysGlyValGlyAlaAspArgAlaTyrGlyArgAspIleValGlu165170175AlaHisTyrArgAlaCysLeuTyrAlaGlyValLysIleAlaGlyThr180185190AsnAlaGluValMetProAlaGlnTrpGluPheGlnIleGlyProCys195200205GluGlyIleSerMetGlyAspHisLeuTrpValAlaArgPheIleLeu210215220HisArgValCysGluAspPheGlyValIleAlaThrPheAspProLys225230235240ProIleProGlyAsnTrpAsnGlyAlaGlyCysHisThrAsnPheSer245250255ThrLysAlaMetArgGluGluAsnGlyLeuLysTyrIleGluGluAla260265270IleGluLysLeuSerLysArgHisGlnTyrHisIleArgAlaTyrAsp275280285ProLysGlyGlyLeuAspAsnAlaArgArgLeuThrGlyPheHisGlu290295300ThrSerAsnIleAsnAspPheSerAlaGlyValAlaAsnArgSerAla305310315320SerIleArgIleProArgThrValGlyGlnGluLysLysGlyTyrPhe325330335GluAspArgArgProSerAlaAsnCysAspProPheSerValThrGlu340345350AlaLeuIleArgThrCysLeuLeuAsnGluThrGlyAspGluProPhe355360365GlnTyrLysAsn370<210>3<211>1366<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>SEQIDNO1的cDNA序列<400>3cgagagtgggagaagagcggagcgtgtgagcagtactgcggcctcctctcctctcctaac60ctgctctcgcggcctacctttacccgcccgcctgctcggcgaccagaacaccttccacca120tgaccacctcagcaagttcccacttaaataaaggcatcaagcaggtgtacatgtccctgc180ctcagggtgagaaagtccaggccatgtatatctggatcgatggtactggagaaggactgc240gctgcaagacccggaccctggacagtgagcccaagtgtgtggaagagttgcctgagtgga300atttcgatggctccagtactttacagtctgagggttccaacagtgacatgtatctcgtgc360ctgctgccatgtttcgggaccccttccgtaaggaccctaacaagctggtgttatgtgaag420ttttcaagtacaatcgaaggcctgcagagaccaatttgaggcacacctgtaaacggataa480tggacatggtgagcaaccagcacccctggtttggcatggagcaggagtataccctcatgg540ggacagatgggcacccctttggttggccttccaacggcttcccagggccccagggtccat600attactgtggtgtgggagcagacagagcctatggcagggacatcgtggaggcccattacc660gggcctgcttgtatgctggagtcaagattgcggggactaatgccgaggtcatgcctgccc720agtgggaatttcagattggaccttgtgaaggaatcagcatgggagatcatctctgggtgg780cccgtttcatcttgcatcgtgtgtgtgaagactttggagtgatagcaacctttgatccta840agcccattcctgggaactggaatggtgcaggctgccataccaacttcagcaccaaggcca900tgcgggaggagaatggtctgaagtacatcgaggaggccattgagaaactaagcaagcggc960accagtaccacatccgtgcctatgatcccaagggaggcctggacaatgcccgacgtctaa1020ctggattccatgaaacctccaacatcaacgacttttctggtggtgtagccaatcgtagcg1080ccagcatacgcattccccggactgttggccaggagaagaagggttactttgaagatcgtc1140gcccctctgccaactgcgaccccttttcggtgacagaagccctcatccgcacgtgtcttc1200tcaatgaaaccggcgatgagcccttccagtacaaaaattaagtggactagacctccagct1260gttgagcccctcctagttcttcatcccactccaactcttccccctctcccagttgtcccg1320attgtaactcaaagggtggaatatcaaggtcgttttttttcattcc1366<210>4<211>388<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>实施例1中使用的在细菌中产生的GS蛋白<400>4MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisGlyGlyGlyGlySerMet151015ThrThrSerAlaSerSerHisLeuAsnLysGlyIleLysGlnValTyr202530MetSerLeuProGlnGlyGluLysValGlnAlaMetTyrIleTrpIle354045AspGlyThrGlyGluGlyLeuArgCysLysThrArgThrLeuAspSer505560GluProLysCysValGluGluLeuProGluTrpAsnPheAspGlySer65707580SerThrLeuGlnSerGluGlySerAsnSerAspMetTyrLeuValPro859095AlaAlaMetPheArgAspProPheArgLysAspProAsnLysLeuVal100105110LeuCysGluValPheLysTyrAsnArgArgProAlaGluThrAsnLeu115120125ArgHisThrCysLysArgIleMetAspMetValSerAsnGlnHisPro130135140TrpPheGlyMetGluGlnGluTyrThrLeuMetGlyThrAspGlyHis145150155160ProPheGlyTrpProSerAsnGlyPheProGlyProGlnGlyProTyr165170175TyrCysGlyValGlyAlaAspArgAlaTyrGlyArgAspIleValGlu180185190AlaHisTyrArgAlaCysLeuTyrAlaGlyValLysIleAlaGlyThr195200205AsnAlaGluValMetProAlaGlnTrpGluPheGlnIleGlyProCys210215220GluGlyIleSerMetGlyAspHisLeuTrpValAlaArgPheIleLeu225230235240HisArgValCysGluAspPheGlyValIleAlaThrPheAspProLys245250255ProIleProGlyAsnTrpAsnGlyAlaGlyCysHisThrAsnPheSer260265270ThrLysAlaMetArgGluGluAsnGlyLeuLysTyrIleGluGluAla275280285IleGluLysLeuSerLysArgHisGlnTyrHisIleArgAlaTyrAsp290295300ProLysGlyGlyLeuAspAsnAlaArgArgLeuThrGlyPheHisGlu305310315320ThrSerAsnIleAsnAspPheSerAlaGlyValAlaAsnArgSerAla325330335SerIleArgIleProArgThrValGlyGlnGluLysLysGlyTyrPhe340345350GluAspArgArgProSerAlaAsnCysAspProPheSerValThrGlu355360365AlaLeuIleArgThrCysLeuLeuAsnGluThrGlyAspGluProPhe370375380GlnTyrLysAsn385<210>5<211>1164<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>实施例1中使用的蛋白的细菌优化的cDNA<400>5atgggcagcagccaccaccatcaccaccacggcggcggcggtagcatgaccacctcggca60agcagccacctgaataaaggcatcaaacaggtgtatatgtctctgccgcagggtgaaaaa120gttcaagccatgtacatttggatcgatggcaccggtgaaggcctgcgttgcaaaacccgc180acgctggactcagaaccgaaatgtgtggaagaactgccggaatggaactttgatggtagc240tctacgctgcagtcggaaggcagtaattccgacatgtatctggttccggcggccatgttt300cgtgatccgttccgcaaagacccgaacaaactggtgctgtgcgaagtttttaaatacaac360cgtcgcccggcggaaaccaatctgcgtcatacgtgtaaacgcattatggatatggtcagc420aaccagcacccgtggttcggtatggaacaagaatataccctgatgggtacggatggccat480ccgtttggttggccgagcaatggtttcccgggtccgcagggtccgtattactgcggtgtc540ggcgcagatcgtgcttacggtcgcgacattgtggaagcacactatcgtgcttgtctgtac600gcgggtgttaaaatcgccggcaccaatgcagaagtcatgccggctcagtgggaatttcaa660attggcccgtgcgaaggtatcagcatgggcgatcatctgtgggttgctcgtttcatcctg720caccgcgtctgtgaagattttggtgtgattgcgaccttcgacccgaaaccgatcccgggc780aactggaatggtgctggctgccataccaactttagcacgaaagcgatgcgtgaagaaaat840ggcctgaaatacatcgaagaagcaatcgaaaaactgtctaaacgtcatcagtatcacatt900cgcgcctacgatccgaaaggcggtctggacaacgcacgtcgcctgaccggttttcacgaa960acgagcaacatcaatgatttctctgcgggcgttgccaatcgctcagcctcgattcgtatc1020ccgcgcaccgtcggtcaagagaaaaaaggctattttgaagatcgtcgcccgagtgcaaac1080tgtgacccgttctccgtgacggaagccctgatccgcacctgtctgctgaatgaaaccggc1140gatgaaccgttccaatacaaaaat1164<210>6<211>445<212>PRT<213>嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)<400>6MetSerLysGlnTyrThrThrGluGluIleArgLysGluValAlaAsp151015LysAspValArgPheLeuArgLeuCysPheThrAspIleAsnGlyThr202530GluLysAlaValGluValProThrSerGlnLeuAspLysValLeuThr354045AsnAspIleArgPheAspGlySerSerIleAspGlyPheValArgLeu505560GluGluSerAspMetValLeuTyrProAspPheSerThrTrpSerVal65707580LeuProTrpGlyAspGluHisGlyGlyLysIleGlyArgLeuIleCys859095SerValHisMetThrAspGlyLysProPheAlaGlyAspProArgAsn100105110AsnLeuLysArgValLeuGlyGluMetLysGluAlaGlyPheAspThr115120125PheAspIleGlyPheGluMetGluPheHisLeuPheLysLeuAspGlu130135140AsnGlyAsnTrpThrThrGluValProAspHisAlaSerTyrPheAsp145150155160MetThrSerAspAspGluGlyAlaArgCysArgArgGluIleValGlu165170175ThrLeuGluGluIleGlyPheGluValGluAlaAlaHisHisGluVal180185190GlyAspGlyGlnGlnGluIleAspPheArgPheAspAspAlaLeuThr195200205ThrAlaAspArgCysGlnThrPheLysMetValAlaArgHisIleAla210215220ArgLysHisGlyLeuPheAlaThrPheMetAlaLysProValGluGly225230235240GlnAlaGlyAsnGlyMetHisAsnAsnMetSerLeuPheLysAsnLys245250255HisAsnValPheTyrAspLysAspGlyGluPheHisLeuSerAsnThr260265270AlaLeuTyrPheLeuAsnGlyIleLeuGluHisAlaArgAlaIleThr275280285AlaIleGlyAsnProThrValAsnSerTyrLysArgLeuIleProGly290295300PheGluAlaProValTyrIleAlaTrpAlaAlaLysAsnArgSerPro305310315320LeuValArgIleProSerAlaGlyGluIleAsnThrArgLeuGluMet325330335ArgSerAlaAspProThrAlaAsnProTyrLeuLeuLeuAlaAlaCys340345350LeuThrAlaGlyLeuLysGlyIleLysGluGlnLysMetProMetLys355360365ProValGluGluAsnIlePheGluMetThrGluGluGluArgAlaGlu370375380HisGlyIleLysProLeuProThrThrLeuHisAsnAlaIleLysAla385390395400PheLysGluAspAspLeuIleLysSerAlaLeuGlyGluHisLeuThr405410415HisSerPheIleGluSerLysGluLeuGluTrpSerLysTyrSerGln420425430SerValSerAspTrpGluArgGlnArgTyrMetAsnTrp435440445<210>7<211>356<212>PRT<213>玉米(Zeamays)<400>7MetAlaCysLeuThrAspLeuValAsnLeuAsnLeuSerAspAsnThr151015GluLysIleIleAlaGluTyrIleTrpIleGlyGlySerGlyMetAsp202530LeuArgSerLysAlaArgThrLeuSerGlyProValThrAspProSer354045LysLeuProLysTrpAsnTyrAspGlySerSerThrGlyGlnAlaPro505560GlyGluAspSerGluValIleLeuTyrProGlnAlaIlePheLysAsp65707580ProPheArgArgGlyAsnAsnIleLeuValMetCysAspCysTyrThr859095ProAlaGlyGluProIleProThrAsnLysArgTyrAsnAlaAlaLys100105110IlePheSerSerProGluValAlaAlaGluGluProTrpTyrGlyIle115120125GluGlnGluTyrThrLeuLeuGlnLysAspThrAsnTrpProLeuGly130135140TrpProIleGlyGlyPheProGlyProGlnGlyProTyrTyrCysGly145150155160IleGlyAlaGluLysSerPheGlyArgAspIleValAspAlaHisTyr165170175LysAlaCysLeuTyrAlaGlyIleAsnIleSerGlyIleAsnGlyGlu180185190ValMetProGlyGlnTrpGluPheGlnValGlyProSerValGlyIle195200205SerSerGlyAspGlnValTrpValAlaArgTyrIleLeuGluArgIle210215220ThrGluIleAlaGlyValValValThrPheAspProLysProIlePro225230235240GlyAspTrpAsnGlyAlaGlyAlaHisThrAsnTyrSerThrGluSer245250255MetArgLysGluGlyGlyTyrGluValIleLysAlaAlaIleGluLys260265270LeuLysLeuArgHisArgGluHisIleAlaAlaTyrGlyGluGlyAsn275280285GluArgArgLeuThrGlyArgHisGluThrAlaAspIleAsnThrPhe290295300SerTrpGlyValAlaAsnArgGlyAlaSerValArgValGlyArgGlu305310315320ThrGluGlnAsnGlyLysGlyTyrPheGluAspArgArgProAlaSer325330335AsnMetAspProTyrValValThrSerMetIleAlaGluThrThrIle340345350IleTrpLysPro355<210>8<211>4<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>接头<400>8GlyGlyGlySer1<210>9<211>5<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>接头<400>9GlyGlyGlyGlySer15<210>10<211>6<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>聚(his)标签<400>10HisHisHisHisHisHis15<210>11<211>17<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>GS序列<400>11GlyGlyGlySerHisHisHisHisHisHisGlyGlyGlyGlySerGly151015Ser<210>12<211>15<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>人类重组GS的N末端<400>12GlyGlyGlySerHisHisHisHisHisHisGlyGlyGlyGlySer151015<210>13<211>4<212>PRT<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>接头<400>13GlyGlySerGly1当前第1页12当前第1页12