肿瘤浸润淋巴细胞在改善乳腺癌中的应用的制作方法

本发明属于免疫细胞疗法技术领域，具体的说是涉及一种肿瘤浸润淋巴细胞在改善乳腺癌中的应用。

背景技术：

女性乳腺是由皮肤、纤维组织、乳腺腺体和脂肪组成的，乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。乳腺癌中99％发生在女性，男性仅占1％。乳腺并不是维持人体生命活动的重要器官，原位乳腺癌并不致命；但由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性，细胞之间连接松散，容易脱落。癌细胞一旦脱落，游离的癌细胞可以随血液或淋巴液播散全身，形成转移，危及生命。目前乳腺癌已成为威胁女性身心健康的常见肿瘤。全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。美国8名妇女一生中就会有1人患乳腺癌，中国不是乳腺癌的高发国家，但不宜乐观，近年我国乳腺癌发病率的增长速度却高出高发国家1～2个百分点。据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年公布的2009年乳腺癌发病数据显示：全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第1位，女性乳腺癌发病率全国合计为42.55/10万，城市为51.91/10万，农村为23.12/10万。

乳腺癌已成为当前社会的重大公共卫生问题，乳腺癌的病因尚未完全清楚，研究发现乳腺癌的发病存在一定的规律性，具有乳腺癌高危因素的女性容易患乳腺癌。所谓高危因素是指与乳腺癌发病有关的各种危险因素，而大多数乳腺癌患者都具有的危险因素就称为乳腺癌的高危因素。据中国肿瘤登记年报显示：女性乳腺癌年龄别发病率0～24岁年龄段处较低水平，25岁后逐渐上升，50～54岁达到高峰，55岁以后逐渐下降。乳腺癌家族史是乳腺癌发生的危险因素，所谓家族史是指一级亲属即母亲、女儿或姐妹中有乳腺癌患者。近年发现乳腺腺体致密也成为乳腺癌的危险因素。乳腺癌的危险因素还有月经初潮早、绝经迟、未婚、未育、晚育、未哺乳、患乳腺良性疾病未及时诊治、经医院活检证实患有乳腺非典型增生、胸部接受过高剂量放射线的照射、长期服用外源性雌激素、绝经后肥胖、长期过量饮酒以及携带与乳腺癌相关的突变基因。具有以上若干项高危因素的女性并不一定患乳腺癌，只能说其患乳腺癌的风险比正常人高，中国妇女乳腺癌的发病率还是低的。

肿瘤免疫治疗，是这几年比较热门，甚至是最热门的癌症治疗手段。说起肿瘤免疫治疗，大家可能立马想到pd-1或pd-l1抗体，k药、o药、国产pd-1抗体，不少晚期癌症患者可以获益。淋巴细胞（lymphocyte）是白细胞的一种，是体积最小的白细胞，其由淋巴器官产生，主要存在于淋巴管中循环的淋巴液中，是机体免疫应答功能的重要细胞成分，是淋巴系统几乎全部免疫功能的主要执行者，是对抗外界感染和监控体内细胞变异的一线士兵。淋巴细胞是一类具有免疫识别功能的细胞系，按其发生迁移、表面分子和功能的不同，可分为t淋巴细胞（t细胞）、b淋巴细胞（b细胞）和自然杀伤细胞(nk细胞)。t细胞和b细胞都是抗原特异性淋巴细胞，它们的最初来源是相同的，都来自造血组织。

t细胞因成书于凶险而得名，属于重要的免疫细胞，t细胞的主要功能是介导细胞免疫，调节机体的免疫应答。t细胞来源于造血干细胞，在胸腺中发育和分化，成熟后迁移至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，外周血中t细胞占淋巴细胞总数的65％～70％。胸腺依赖淋巴细胞简称t细胞，是骨髓来源的淋巴干细胞在胸腺内分化而成的，胸腺发育成熟的t细胞转移到外周淋巴器官或淋巴组织，在没有接触特异性抗原分子刺激前，保持相对静息状态，称初始t细胞。一旦接受相应抗原的刺激，它们便转化为代谢活跃、直径为15～20μm的大淋巴细胞，并增殖分化。大部分分化为效应性t细胞，获得了迁移、产生细胞因子和其他效应的功能，小部分形成记忆性t细胞。效应性t细胞寿命较短，具有杀伤靶细胞的功能。记忆性t细胞寿命可长达数年，甚至终身，当机体再次遇到相同抗原刺激时，能迅速转化增殖，形成大量效应性t细胞，启动更大强度的免疫应答，并使机体较长时期保持对该抗原的免疫力。由于效应性t细胞可直接杀灭靶细胞，故t细胞参与的免疫称为细胞免疫。

技术实现要素：

本发明为了克服现有技术存在的不足，提供一种肿瘤浸润淋巴细胞在改善乳腺癌中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种肿瘤浸润淋巴细胞在改善乳腺癌中的应用，该应用的具体操作流程为：（1）首先从患者体内切除肿瘤；（2）肿瘤组织在无菌、冷链条件下运输至实验室，并分离获得起始肿瘤浸润淋巴细胞；（3）起始肿瘤浸润淋巴细胞在适宜条件下培养、扩增一万倍并进一步纯化，达到10⁸个初代种子细胞，然后进行冻存；（4）肿瘤浸润淋巴细胞复苏、扩增至5×10⁷个，以慢病毒载体rnai技术敲低pd-1；（5）肿瘤浸润淋巴细胞进一步扩增至一千至一万倍；（6）最后肿瘤浸润淋巴细胞回输至患者，平均每次注射肿瘤浸润淋巴细胞的细胞量为8.2×10¹⁰个。

步骤（2）中获得10⁴～10⁶个起始肿瘤浸润淋巴细胞。

步骤（3）中的冻存条件为每组10支，10⁷个细胞/支，液氮-196℃温度条件下保存。

步骤（5）中肿瘤浸润淋巴细胞进一步扩增至10¹⁰个以上。

美国国家癌症研究所外科部主任罗森伯格（steverosenberg）博士开创了使用肿瘤浸润淋巴细胞的先河。til肿瘤浸润淋巴细胞是来源于浸润在肿瘤组织里的细胞，是已知的能够特异性识别和攻击癌症的免疫细胞。本发明肿瘤浸润淋巴细胞在改善乳腺癌中的应用是把乳腺肿瘤组织中的淋巴细胞分离出来并扩增，再回输给患者，就能够起到改善乳腺癌患者生活质量的目的。

本发明的有益效果是：肿瘤浸润淋巴细胞，是一种浸润在肿瘤组织里面，能够有效识别肿瘤细胞新抗原的t细胞，这种能够识别肿瘤细胞新抗原的t细胞，具有能够高效的杀死肿瘤细胞能力，包括杀死由该病灶转移到的其他部位的肿瘤传代细胞。肿瘤浸润淋巴细胞的优势为：用机械处理和酶消化方法，从肿瘤局部分离出肿瘤浸润淋巴细胞，加入高剂量il-2体外培养及改造，然后将其回输入患者体内，相较于其它免疫疗法，肿瘤浸润淋巴细胞具有识别肿瘤抗原靶点多、副作用少、可治疗实体瘤多，疗效更强等优点。

表1：til肿瘤浸润淋巴细胞疗法相比较其它免疫疗法的优势。

附图说明

图1为肿瘤浸润淋巴细胞在改善乳腺癌中的应用的免疫疗法流程图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明作详细描述。

本发明公开了一种肿瘤浸润淋巴细胞在改善乳腺癌中的应用，该应用的具体操作流程为：（1）首先从患者体内切除肿瘤；（2）肿瘤组织在无菌、冷链条件下运输至实验室，通过一系列技术手段分离获得肿瘤浸润淋巴细胞，约10⁴～10⁶个起始细胞；（3）肿瘤浸润淋巴细胞在适宜条件下培养、扩增约一万倍并进一步纯化，达到10⁸个初代种子细胞，然后进行冻存，冻存条件为每组10支，10⁷细胞/支，液氮-196℃保存；（4）肿瘤浸润淋巴细胞复苏、扩增至5×10⁷个，以慢病毒载体rnai技术敲低pd-1；（5）肿瘤浸润淋巴细胞进一步扩增至10¹⁰个以上，约一千至一万倍；（6）最后肿瘤浸润淋巴细胞回输至患者，平均每次注射肿瘤浸润淋巴细胞的细胞量为8.2×10¹⁰个。

改善案例：1名52岁的脑转移乳腺癌患者，之前接受过乳腺癌切除手术和化疗治疗，平均注射til细胞量8.2×10¹⁰个，22个月后，从医学影像上看，肿瘤消失，患者处于临床无病状态。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。