一种美洲大蠊粪便中肠道菌群代谢产物提取物及其制备方法和应用与流程

本发明属于中药技术领域，特别是涉及一种美洲大蠊粪便中肠道菌群代谢产物提取物及其制备方法和应用。

背景技术：

心力衰竭是由于心肌梗死、心肌病、血流动力学负荷过重、炎症等原因引起的心肌损伤，常表现为代偿性心动过速。心率作为一项重要的生命体征，是评估心脏功能状态最直接、有效的指标之一。尽管心率加快可在一定程度上改善心衰患者的血流动力学状态，减轻心衰症状，然而心率加快使心室舒张末期容积减少，导致每搏输出量下降，心排血量下降，心排血量下降又可引起交感神经系统兴奋，心率加快，由此形成恶性循环，从而造成心肌结构和功能的变化，最后导致心室泵血或充盈功能低下。因此，尽管医学不断发展，心衰的治疗水平不断提高，但临床研究证实心衰仍然是高发病率、致残率、致死率的疾病。

传统的强心药物包括钙增敏剂、磷酸二酯酶抑制剂和洋地黄类药物等，其主要通过增强心肌收缩力、提高心输出量治疗心力衰竭。然而长期、过度应用以上强心药物可能扩大心肌的能量供需矛盾，引起钙超载等副作用，增加心律失常发生率。通过对高血压、冠心病、慢性心力衰竭等疾病的多个大型临床研究发现，静息心率增快是心血管疾病死亡的主要独立危险因子。强心药引起的心律失常增加了心力衰竭病人骤死率。

技术实现要素：

针对现有技术中的强心药物可增加心律失常发生率的问题，本发明提供一种美洲大蠊粪便中肠道菌群代谢产物提取物的制备方法。

以及，本发明还提供一种美洲大蠊粪便中肠道菌群代谢产物提取物。

以及，本发明还提供一种美洲大蠊粪便中肠道菌群代谢产物提取物作为强心药物的应用。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种美洲大蠊粪便中肠道菌群代谢产物提取物的制备方法，将美洲大蠊粪便用68～72％(v/v)乙醇水溶液超声提取，过滤，所得滤液经过减压浓缩得浸膏，浸膏用水混悬，通过大孔吸附树脂吸附后先以水洗脱、再用93～97％(v/v)乙醇水溶液洗脱，收集所述93～97％(v/v)乙醇水溶液的洗脱液，减压浓缩即得。

美洲大蠊(periplanetaamericanal.)入药始载于《神农本草经》。其粪便一般被作为废弃物处理，或应用于肥料中。目前尚未报道其在医药中的用途。本发明通过langendorff离体心脏灌流实验发现并证实，上述制备方法得到的美洲大蠊粪便中肠道菌群代谢产物提取物具有正性肌力作用，能够增强正常心肌收缩力，且未出现明显升高心率或损伤心脏的情况，可用于制备治疗心功能不全(心力衰竭)疾病的药物，用于解决现有强心药物增加心律失常发生率的问题。同时，所得提取物还能够提升美洲大蠊粪便的再利用价值以及美洲大蠊的药用价值。

将滤液浓缩、制成浸膏的操作能够基本去除滤液中的乙醇，在使用大孔吸附树脂处理样品时减少有效成分的损失。混悬液的浓度、体积可根据大孔吸附树脂洗脱的常规操作方法、大孔吸附树脂柱的填料用量等进行常规调整。

水溶性成分基本不具有强心作用，先以水洗脱能够减少成品中无效的水溶性成分，从而使有效成分得以更大程度的富集。洗脱前可通过常规试验手段对所得滤液进行浓缩，以获得更好的吸附效果。

优选地，所述超声提取为提取2～3次，每次0.5～1.5h。

优选地，所述超声提取为提取2次，每次1h。

优选地，用70％(v/v)乙醇水溶液超声提取。

优选地，用95％(v/v)乙醇水溶液洗脱。

优选地，以水洗脱时所述水的用量为所述美洲大蠊粪便质量的2倍以上。足量的水洗脱能够尽可能除去水溶性成分。

优选地，所述水用量为所述美洲大蠊粪便质量2～3倍。

优选地，该制备方法还包括将所述93～97％(v/v)乙醇水溶液洗脱液浓缩干燥，使所得产品更便于储存、使用以及进一步加工成制剂。

以及，本发明实施例还提供了所述一种美洲大蠊粪便中肠道菌群代谢产物提取物，由上述的美洲大蠊粪便中肠道菌群代谢产物提取物的制备方法制成。

以及，本发明实施例还提供上述美洲大蠊粪便中肠道菌群代谢产物提取物在制备强心药物中的应用。

上述美洲大蠊粪便中肠道菌群代谢产物提取物具有强心作用，且未发现其具有明显的升高心率或损伤心脏的作用，因此可用于制备治疗心功能不全(心力衰竭)疾病的药物。

优选地，所述药物为注射剂或口服制剂。

附图说明

图1为本发明效果例中pafb组sd大鼠离体心脏模型给药前后的左心室压力变化

图2为本发明效果例中pafb组sd大鼠离体心脏模型给药前后的左心室等容期压力变化速率

图3为本发明效果例中pafb组sd大鼠离体心脏模型给药前后左心室收缩压(lvsp)变化值(n＝7)

图4为本发明效果例中pafb组sd大鼠离体心脏模型给药前后心率(hr)变化值(n＝7)

图5为本发明效果例中pafb组sd大鼠离体心脏模型给药前后左心室等容期压力上升的最大速率(n＝7)

图6为本发明效果例中pafb组sd大鼠离体心脏模型给药前后左心室等容期压力下降的最大速率(n＝7)

图7为本发明效果例中各组sd大鼠离体心脏模型lvsp相对于给药前的变化率(n＝7)

图8为本发明效果例中各组sd大鼠离体心脏模型hr相对于给药前的变化率(n＝7)

图9为本发明效果例中各组sd大鼠离体心脏模型左心室等容期压力上升的最大速率相对于给药前的变化率(n＝7)

图10为本发明效果例中各组sd大鼠离体心脏模型左心室等容期压力下降的最大速率相对于给药前的变化率(n＝7)

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下实施例中的美洲大蠊粪便样品取自云南腾药制药股份有限公司石头山美洲大蠊gap养殖基地，其美洲大蠊的饲养条件严格按照gap标准执行，饲料主要成分为豆类成分。

实施例1

本发明实施例提供了一种美洲大蠊粪便中肠道菌群代谢产物提取物，其制备方法为：

将1kg美洲大蠊粪便样品用70％(v/v)的乙醇水溶液超声提取两次，每次1h，每次乙醇水溶液的用量为8l，提取后过滤，将所得滤液合并后回收溶剂，得美洲大蠊粪便醇提物浸膏，再加水混悬成750ml混悬液，上于500gd101大孔吸附树脂柱吸附后，用2l水洗脱，然后以95％(v/v)乙醇水溶液洗脱，收集95％(v/v)乙醇水溶液的洗脱液。

将所得洗脱液减压浓缩后，再减压干燥，得美洲大蠊粪便提取物粉末。

实施例2

本发明实施例提供了一种美洲大蠊粪便中肠道菌群代谢产物提取物，其制备方法为：

将1kg美洲大蠊粪便样品用68％(v/v)的乙醇水溶液超声提取两次，每次1.5h，每次乙醇水溶液的用量为9l，提取后过滤，将所得滤液合并后回收溶剂，得美洲大蠊粪便醇提物浸膏，再加水混悬成800ml混悬液，上于500gd101大孔吸附树脂柱吸附后，用2l水洗脱，然后以93％(v/v)乙醇水溶液洗脱，收集93％(v/v)乙醇水溶液的洗脱液，减压浓缩即得。

实施例3

本发明实施例提供了一种美洲大蠊粪便中肠道菌群代谢产物提取物，其制备方法为：

将1kg美洲大蠊粪便样品用72％(v/v)的乙醇水溶液超声提取两次，每次1.5h，每次乙醇水溶液的用量为9l，提取后过滤，将所得滤液合并后回收溶剂，得美洲大蠊粪便醇提物浸膏，再加水混悬成700ml混悬液，上于500gd101大孔吸附树脂柱吸附后，用2l水洗脱，然后以97％(v/v)乙醇水溶液洗脱，收集97％(v/v)乙醇水溶液的洗脱液，减压浓缩即得。

实施例4

本发明实施例提供了一种美洲大蠊粪便中肠道菌群代谢产物提取物在制备强心药物中的应用。

制备方法为：将实施例1所得美洲大蠊粪便提取物与助溶剂等辅料制成口服溶液。

实施例5

本发明实施例提供了一种美洲大蠊粪便中肠道菌群代谢产物提取物在制备强心药物中的应用。

制备方法为：将实施例2所得美洲大蠊粪便提取物浓缩、干燥后灭菌，制成注射用无菌粉末。

实施例6

本发明实施例提供了一种美洲大蠊粪便中肠道菌群代谢产物提取物在制备强心药物中的应用。

制备方法为：将实施例3所得美洲大蠊粪便提取物浓缩、干燥后与助溶剂、抗氧化剂等辅料制成注射液。

效果例

本效果例提供了一种美洲大蠊粪便中肠道菌群代谢产物提取物的药效学实验。

1、仪器、试剂与材料

1.1仪器

ja5003电子天平(上海方瑞仪器有限公司)；ms105du十万分之一电子天平(mettlertoledo，瑞士)；milli-q超纯水装置(millipore，美国)；20、100、200和5000μl移液器(eppendorf，德国)；vortex-genie2涡旋振荡器(scientific美国)；genietouch^tm注射泵(kentscientific，美国)；langendorff离体心脏灌流系统(adinstruments，澳大利亚)；其它常用器具(手术器械、离心管、烧杯、移液枪头、注射剂和量筒等)。

1.2试剂与材料

氯化钠(ar博欧特化工贸易有限公司)；氯化钾(ar博欧特化工贸易有限公司)；碳酸氢钠(ar博欧特化工贸易有限公司)；硫酸镁(ar天津市光复科技发展有限公司)；无水磷酸二氢钾(ar天津百伦斯生物技术有限公司)；结晶氯化钙(ar天津百伦斯生物技术有限公司)；无水葡萄糖(ar天津市大茂化学试剂厂)；水合氯醛(ar天津市大茂化学试剂厂)；dmso(纯度≥99％，sigma-aldrich)；心脉隆注射液(2ml，含心脉隆浸膏100mg，云南腾药制药股份有限公司，批号180122)；95％o2+5％co2混合气(天津市华明气体销售有限公司)。

1.3实验动物

spf级雄性sd大鼠，体重280～300g(中国食品药品检定研究院(大兴)，动物生产许可证号scxk(京)2010–0009)，适应性饲养3天。

2、实验用试液的制备

2.1kreb's-henseleit(k-h)液(mm)

nacl118mm；kcl4.7mm；nahco324mm；kh2po41.2mm；mgso4·7h2o1.2mm；cacl21.8mm；无水葡萄糖11.1mm；持续通入95％o2+5％co2混合气(充气约1h)。

2.2试验分组及试药

将实验动物随机分为三组，各组试药如下：

(1)空白对照组

精密吸取dmso50μl，加入适量预先充气的k-h液，混匀，制得10μl/ml的空白对照试药。

(2)阳性对照组

精密吸取心脉隆注射液200μl，加入适量预先充气的k-h液，混匀，制得2mg/ml的心脉隆注射液阳性对照试药。

(3)美洲大蠊粪便提取物组(pafb组)

精密称取实施例1所得美洲大蠊粪便提取物10mg，加入dmso200μl使溶解，摇匀，得储备液；分别取储备液适量，加dmso至50μl，再加入适量预先充气的k-h液，混匀，制得0.1、0.2和0.5mg/ml的美洲大蠊粪便提取物试药。

3、langendorff离体心脏灌流

将各组实验动物用水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉，然后仰位固定，开胸，剪开心包，迅速取出心脏置于冰冷4℃k-h液中，轻轻挤压心脏，排出心脏内的剩余血液；将主动脉套管接于langendorff离体心脏灌流系统的灌流装置，分离主动脉，将充满灌流液的套管插入主动脉，心脏在3～4s后即可恢复搏动，随后将心脏结扎固定。在左心耳根处戳一小孔，将预先做好的球囊经左心房通过房室瓣插入左心室。和球囊相连的导管通过三通管连接至压力换能器，压力换能器信号通过桥式放大器(bridgeamp，澳大利亚)输入多导记录系统(powerlab8/35，澳大利亚)，通过计算机运行labchart软件完成信号的实时采集和处理。记录的心功能参数包括左心室收缩压(lvsp)、左心室舒张末压(lvedp)、左心室发展压(lvdp)、左心室等容期压力最大变化速率(±dp/dtmax)和心率(hr)。

离体心脏悬挂后，恒流模式下调节k-h液流量约10ml/min，待心脏趋于稳定后，切换至恒压模式并调节至相应的灌注压持续灌注。离体心脏经约20～30min恢复稳定后，即可进行给药。

提取物组和对照组均以灌流过程中实时测量1分钟的灌流液量的二十分之一计算给药流速(以确保不会引起灌注压变化，同时保证dmso到心脏的浓度小于千分之一)，给药浓度如表1所示，然后用genietouch^tm注射泵匀速给药5分钟，在这个过程中langendorff离体心脏灌流系统保持灌注压稳定。

4、实验结果

pafb组恒压灌流的信号采集图如图1、图2所示，图1为pafb组sd大鼠离体心脏模型给药前后的左心室压力变化，图2为pafb组sd大鼠离体心脏模型给药前后的左心室等容期压力变化速率。

pafb组sd大鼠离体心脏模型给药前后左心室压力和左心室等容期压力变化速率变化明显。

给予离体心脏模型不同试药并完成信号采集，各组给药时长均为5min。选取空白对照组、阳性对照组和pafb组的信号平坦稳定段，测定约20s时长的给药前后各评价指标值，以平均值呈现。所得数据用spssstatistics21.0统计分析软件进行统计分析，结果以平均值±标准差(mean±sd)表示(见表1)。

表1sd大鼠离体心脏给药前后各项指标变化(n＝7)

注：与给药前比较，*p<0.05，**p<0.01。

测定指标结果显示，空白对照组对离体心脏无影响；阳性对照组对离体心脏具有明显的正性肌力作用；而pafb组各剂量也均表现出明显的正性肌力作用，以lvsp和+dp/dtmax效果最为显著，并且呈现了明显的剂量依赖关系。pafb均未对心率有明显影响，与阳性对照组存在明显区别。结果以平均值±标准误(mean±sem)表示，如图3～图6所示。

基于上述统计分析，通过指标值变化率分析各给药组的组间差异，结果以平均值±标准误(mean±sem)表示。以pafb0.5mg/ml组为主要分析对象，结果显示，该组的lvsp和±dp/dtmax变化率与空白对照组存在明显的差异，与pafb0.1和0.2mg/ml组存在一定的差异，而与阳性对照组之间并无明显区别。但对于心率变化率，除阳性对照组外，各组间并无明显差异，如图7～图10所示。图中，与空白对照组比较，^△p<0.05，^△△p<0.01；与阳性对照组比较，^▼p<0.05，^▼▼p<0.01；与pafb组0.1mg/ml比较，^◇p<0.05，^◇◇p<0.01；与pafb组0.2mg/ml比较，^◆p<0.05。

针对上述结果分析，心率的变化是pafb0.5mg/ml组与阳性对照组之间最为明显的差异。美洲大蠊肠道菌群代谢产物就其效果而言，能够显著提高心脏的正性肌力作用，且小剂量尚未发现明显升高心率或损伤心脏的作用，是其作为治疗心力衰竭药物而开发的有力支撑。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。