基于病理组织的三联综合肿瘤分析系统和应用的制作方法

1.本发明涉及基于病理组织的人工智能检测分析领域。具体而言，本发明涉及基于病理组织的肿瘤分析系统和应用，可以用于肿瘤患者的预后评估(例如手术预后评估和/或复发风险评估等)和/或治疗方案的选择(例如判断是否适合采用特定治疗方案包括手术和/或化疗等)。


背景技术：

2.疾病的预后涉及对疾病发展情况的预测。一般而言，可以考虑患者的临床表现、检验结果、影像学、病因、病理、病情规律，对疾病的疗效、转归、恢复、复发或进展程度进行评估。疾病预后与患者的治疗时机、疾病的发生程度、医学水平、合并的疾病、体质、年龄、对疾病的认知能力、是否继续治疗等多种因素相关。对于不同疾病和不同患者而言，影响预后的主要因素可能不同，因此需要针对具体疾病和具体选择研究影响疾病如肿瘤的风险因子以及确定适当的治疗方案。
3.以结直肠癌为例，据报道，结直肠癌在2016年美国发病率和死亡率分别居癌症谱的第4位和第2位；2015年我国结直肠癌发病率和死亡率均居第5位，但死亡与新发病例比值(50.8％)明显高于美国(36.6％)(姚宏伟,吴鸿伟,刘荫华，中华外科杂志，2017,55(1):24-27)。
4.美国癌症联合委员会(ajcc)第八版tnm分期系统将结直肠癌分为0期，i期，ii期(包括iia、iib、iic期)，iii期(包括iiia、iiib、iiic期)，iv期(包括iva、ivb、ivc期)(详见ajcc第八版结直肠癌分期系统定义和说明)。
5.据报道，ii期结直肠癌患者的术后辅助化疗获益率不超过5％，国内外指南建议ii期患者根据术后复发风险来决定辅助治疗的决策。目前认为的ii期患者高危因素包括:t4(iib、iic期)、组织学分化差(3/4级，不包括msi-h者)、脉管浸润、神经浸润、肠梗阻、肿瘤部位穿孔、切缘阳性或情况不明、切缘安全距离不足、送检淋巴结不足12枚。低危因素指msi-h(微卫星高度不稳定性)或dmmr(错配修复蛋白缺失)。
6.中国临床肿瘤学会(csco)结直肠癌诊疗指南2019.v1
7.3.1.1.3术后辅助化疗
[0008][0009]
目前临床普遍认为，现有的风险评估因素或是缺乏可靠的循证数据，判断方法偏主观，或是获益人群很少(msi-h在ii期结直肠癌的检出比例仅为10％-15％)。因此临床上仍在探索适用于更多ii期结直肠癌患者，能更客观的评估预后风险及化疗获益的方法。
[0010]
有研究显示，12gene-rs通过评估结直肠癌复发风险相关的7个基因以及5个管家基因的表达进行风险评分(recurrence score)，高风险组与低风险组之间的风险比为1.47(95％ci,1.01-2.14；p<0.046)。j clin oncol 29:4611-4619。
[0011]
据文献报道，coloprog通过结合dna倍性分析和肿瘤间质比分析，进行ii期结直肠癌患者的预后评估，采用coloprog可将患者分为高、中、低三种复发风险，高风险与低风险组之间的风险比hr＝2.9(95％1.73
–
5.03),p<0.001。annals of oncology 0:1
–
8,2018。但该方法对临床治疗的指导意义仍有待提高，低风险组5年总生存率(os)为79％，中风险组5年os为72％，高风险组5年os为63％；高，中，低危三组的癌症特异性生存(css)分别为：90％，83％，73％。各分组之间的差值还有待提高。
[0012]
因此，需要对肿瘤如结直肠癌等进行深入研究以提供个体化的更为准确的预后评估和选择最佳的治疗方案。


技术实现要素：

[0013]
发明人通过对肿瘤如结直肠癌的各种风险因子进行深入研究，已经发现可以通过少数关键因子的组合提供更为准确的预后判断和更精确的治疗方案的选择，从而完成了本发明。在一些实施方案中，本发明尤其适合采用计算机系统直接提供预后判断和/或治疗方案的选择，包括例如判断患者是否手术以及术后是否适合联合化疗等。
[0014]
在一些实施方案中，本发明涉及下述一个或多个方面：
[0015]
1、一种计算机系统，包括处理器和存储计算机可执行代码的存储设备，其中当在所述处理器处执行时，所述计算机可执行代码配置为：
[0016]
基于来自患者肿瘤组织样品的dna倍性数据、染色质结构分型数据和肿瘤间质比数据提供针对所述患者的预后评估结果和/或治疗方案的选择，
[0017]
其中二倍体计0分，非二倍体计1分，染色质同质计0分，染色质异质计1分，低间质比计0分，高间质比计1分，其中：
[0018]
1)将总分为0判定为低风险，总分为1判定为中风险，总分为2以上判定为高风险；和/或
[0019]
2)其中将总分为0的患者判定为适合术后单纯观察的患者，总分为2以上的患者判定为适合联合化疗的患者。
[0020]
2、项目1所述的计算机系统，其中：
[0021]
1)来自患者肿瘤组织样品的dna倍性数据包括将肿瘤组织中dna倍性判定为二倍体或非二倍体，其可以通过基于病理切片通过例如显微镜观察判定，单细胞吸光度或荧光计数判定，流式细胞计数法判定，或通过计算机图像分析判定，优选例如通过基于自动图像识别的dna倍性进行判定，和/或
[0022]
2)来自患者肿瘤组织样品的染色质结构分型数据包括将肿瘤组织中染色质模式判定为染色质同质或染色质异质，其可以基于病理切片通过例如显微镜观察判定或通过计算机图像分析判定，优选例如通过基于自动图像识别的染色质结构分型进行判定。
[0023]
3、项目1或2所述的计算机系统，其中来自患者肿瘤组织样品的肿瘤间质比数据包括将肿瘤组织中的间质成分所占比例判定为低间质比或高间质比，其可以基于病理切片通过例如显微镜观察判定或通过计算机图像分析判定，优选例如通过基于自动图像识别的间质比进行判定。
[0024]
4、项目1-3任一项所述的计算机系统，其中所述肿瘤为实体瘤，包括例如结直肠癌。
[0025]
5、项目4所述的计算机系统，其中所述肿瘤为结直肠癌，包括例如术后结直肠癌，例如tnm分期中任一期结直肠癌，包括例如0期，i期，ii期(包括iia、iib、iic期)，优选为ii期结直肠癌。
[0026]
6、项目1-5任一项所述的计算机系统，其中：
[0027]
1)通过计算机图像分析例如dna倍性将肿瘤组织中dna倍性判定为二倍体或非二倍体，例如根据dna倍性分析软件计算的细胞核累积光密度值判定为二倍体或非二倍体；和/或
[0028]
2)通过计算机图像分析例如染色质结构分型分析软件将肿瘤组织中染色质模式判定为染色质同质或染色质异质，例如按照适当阈值，例如染色质结构分型分析软件计算为0.044的阈值判定为染色质同质(cho，≥0.044)或染色质异质(che，＜0.044)。
[0029]
7、项目1-6任一项所述的计算机系统，其中通过计算机图像分析例如间质比分析软件将肿瘤组织中的间质成分所占比例判定为低间质比或高间质比，例如按照适当阈值，例如50％的阈值，分为低间质比组(≤50％)和高间质比组(＞50％)。
[0030]
9、一种计算机可读介质，其上存储有指令，在所述指令由处理器执行时，使所述处理器执行项目1-7任一项中定义的计算机可执行代码。
[0031]
10、用于测定来自患者肿瘤组织样品的dna倍性数据、染色质结构分型数据和肿瘤间质比数据的试剂在制备提供针对所述患者的预后评估结果和/或治疗方案的选择的试剂盒中的用途，其中所述肿瘤为实体瘤，包括例如结直肠癌。
[0032]
在一些实施方案中，本发明可以通过例如图5示例的硬件装置500实施。硬件装置
500包括处理器506。处理器506可以是单一处理单元或者是多个处理单元，用于执行本文描述的流程。装置500还可以包括接收信号的输入单元502、以及提供信号的输出单元504。输入单元502和输出单元504可以布置为单一或分离的单元。装置500可以包括至少一个可读存储介质508，例如eeprom、闪存、和/或硬盘驱动器。可读存储介质508包括计算机程序510，该计算机程序510包括代码/计算机可读指令，其在由装置500中的处理器506执行时使得硬件装置500可以执行例如本文描述的流程及其变形。计算机程序510可配置为具有例如计算机程序模块510a，模块510b，模块510c架构的计算机程序代码，用于执行本文描述的步骤。处理器可以是单个cpu，也可以包括两个或更多个处理单元。计算机程序可以由连接到处理器的计算机程序产品来承载。计算机程序产品可以包括其上存储有计算机程序的计算机可读介质。例如，计算机程序产品可以是闪存、随机存取存储器(ram)、只读存储器(rom)、eeprom。上述计算机程序模块可以用ue内的存储器的形式被分布到不同计算机程序产品中。这些计算机程序指令可以提供给通用计算机、专用计算机或其他可编程数据处理装置的处理器，从而这些指令在由该处理器执行时可以创建用于实现这些功能/操作的装置。另外，本文描述的方案可以采取存储有指令的计算机可读介质上的计算机程序产品的形式，该计算机程序产品可供指令执行系统使用或者结合指令执行系统使用。
[0033]
在一些实施方案中，本发明提供针对患者的预后评估结果和/或治疗方案的选择的方法和相关产品如试剂盒(kit)，其中可以包括例如用于测定来自患者肿瘤组织样品的数据的试剂。在本文中，用于测定来自患者肿瘤组织样品的数据的试剂在广泛意义上使用，其中可以包括例如用于预处理来自患者肿瘤组织样品的试剂。在一些实施方案中，来自患者肿瘤组织样品的数据可以包括例如dna倍性数据、染色质结构分型数据和肿瘤间质比数据。在一些实施方案中，本发明提供组合物或试剂盒，所述组合物或试剂盒可以用于提供针对患者的预后评估结果和/或治疗方案的选择，其中可以包括例如用于预处理来自患者肿瘤组织样品的试剂，以预处理所述样品从而测定dna倍性数据、染色质结构分型数据和肿瘤间质比数据。在一些实施方案中，本发明提供用于预处理来自患者肿瘤组织样品试剂在制备提供针对所述患者的预后评估结果和/或治疗方案的选择的产品如试剂盒中的用途，其中所述试剂用于预处理来自患者肿瘤组织样品，以测定所述样品的dna倍性数据、染色质结构分型数据和肿瘤间质比数据。在一些实施方案中，本文提及的肿瘤可以为实体瘤，包括例如结直肠癌。在一些实施方案中，染色质结构分型，dna倍性和间质比分析方法没有特别限制，可以采用本领域已知的任何方法进行。在一些实施方案中，本发明的试剂盒可以包括适合测定来自患者肿瘤组织样品的染色质结构分型数据、dna倍性数据和/或肿瘤间质比数据的试剂、软件和/或装置，例如适合进行组织切片的试剂和装置，例如适合进行染色(例如he染色)的试剂和装置，例如可购自梅傲科技(广州)有限公司、由软件开发者英国庐肆集团有限公司提供技术支持的染色质结构分型，dna倍性和间质比分析软件，例如适合进行流式细胞仪和其他液基肿瘤细胞的倍性分析的试剂、软件和/或装置，例如适合通过表观遗传学方法检测染色质结构分型的试剂、软件和/或装置。在一些实施方案中，本发明的试剂可以包括例如染色液、缓冲液、洗涤液等。在一些实施方案中，本发明试剂盒中的所述试剂可以分别置于分开的容器中，或将相同试剂置于同一容器中。
[0034]
在一些实施方案中，本发明的风险评估结合染色质结构分型分析，dna倍性分析以及间质比分析对ii期结直肠癌患者进行复发风险评估，能够更好的预测患者的复发风险。
[0035]
染色质结构分型分析：可以将患者按照0.044的阈值分为染色质同质(cho，≥0.044)和染色质异质(che，＜0.044)两组。染色质同质组患者预后较好，低风险；染色质异质组患者预后较差，高风险。
[0036]
dna倍性分析：可将患者分为二倍体和非二倍体两组。二倍体患者预后较好，低风险；非二倍体患者预后较差，高风险。
[0037]
间质比分析：可将患者按照50％的阈值分为低间质比组(≤50％)和高间质比组(＞50％)。低间质比患者预后较好，低风险；高间质比患者预后较差，高风险。
[0038]
采用染色质结构分型，dna倍性，间质比三者结合进行ii期结直肠癌预后评估的技术方法和预测预后的3个指标示例性组合算法如下：
[0039]
染色质结构分型：低危计0分，高危计1分
[0040]
dna倍性：低危计0分，高危计1分
[0041]
间质比：低危计0分，高危计1分
[0042]
低风险：总分＝0分
[0043]
中风险：总分＝1分
[0044]
高风险：总分≥2分。
[0045]
本发明的3个指标组合后进行的实体瘤如ii期结直肠癌预后评估效果显著优于现有技术。本发明指标组合的评估效果与其他一些指标的比较参见表a、表b和表c。
[0046]
表a：在已完成的临床研究中，本发明指标组合的预后预测价值与其他预后指标或其他组合的对比
[0047][0048]
表b本发明指标组合的预后评估价值与传统预后标志物的参数对比
[0049][0050]
表c：本发明指标组合的预后评估价值与其他研究通过多个指标结合计算的参数对比
[0051][0052]
其中:
[0053]
12gene-rs(检测bgn，fap，inhba，mki67，myc，mybl2，gadd45b，atp5e。gpx1，pgk1，vadc2，ubb12个基因mrna的表达量及相应的算法计算的结直肠癌复发风险评分)：高危组比低危组hr＝1.47(95％ci 1.01-2.14；p<0.046)(ref：j clin oncol 29:4611-4619，2011)；
[0054]
coloprog：高危组比低危组hr＝2.9(95％ci 95％1.73
–
5.03),p<0.001。(ref：annals of oncology 0:1
–
8,2018)；
[0055]
four-mirna classifier(通过检测hsa-mir-5010-3p,hsa-mir-5100,hsa-mir-656-3p and hsa-mir-671-3p四个mirna的表达量及相应的算法评估结直肠癌患者的复发风险)：高危组比低危组hr＝3.16(95％ci 1.36-7.33，p＝0.007)(ref：scientific report 8:6157，2018)；
[0056]
cms(consensus molecular subtypes，通过msi，cimp，braf突变，scna，kras，间质浸润，tgfβ活性等指标将肠癌患者分为四种类型：cms1.cms2，cms3，cms4)：cms4比cms1 hr＝1.77(95％ci 1.34-2.34，p＜0.001)(ref：nat med.21(11):1350
–
1356，2015)。
[0057]
本发明采用的检测方法如dna倍性和染色质结构分型采用光密度自动化的分析软件完成，间质比采用自动化的病理图像分析技术得到结果。
[0058]
本领域技术人员容易理解，dna倍性数据、染色质结构分型数据和肿瘤间质比数据可以通过本领域已知的各种方法获得，包括例如病理切片的显微镜检等。例如，对于dna倍性，可以通过流式细胞仪做其他液基肿瘤细胞的倍性分析进行；对于染色质结构分型，可以通过其他表观遗传学方法检测。
附图说明
[0059]
图1：染色质结构分型生存分析结果。
[0060]
图2：dna倍性生存分析结果。
[0061]
图3：间质比生存分析结果。
[0062]
图4：染色质结构分型、dna倍性、间质比三个指标结合生存分析结果。
[0063]
图5：可用于实施本发明的示例硬件布置500的框图。
具体实施方式
[0064]
本研究为在北京的医学科学院肿瘤医院进行的回顾性分析，分析连续收集的179例ii期结直肠癌患者的随访数据和其染色质结构分型，dna倍性，间质比的检测数据。同时收集患者与预后相关的指标(包括年龄，性别，肿瘤位置，t分期，病理分型，病理分级，辅助治疗信息，msi(微卫星不稳定)，以及患者的复发信息和生存信息。采用染色质结构分型，dna倍性，间质比三种分析软件(均可购自梅傲科技(广州)有限公司，由软件开发者英国庐肆集团有限公司提供技术支持)分别进行风险评估后，进行3者组合后的k-m生存曲线分析。
[0065]
肿瘤取样
[0066]
由病理医生选取最具代表性的肿瘤石蜡组织，切取50μm厚度的组织切片2片，5μm厚度的组织切片4片，用于进行染色质结构分型，dna倍性，间质比的检测。
[0067]
细胞核涂层制备
[0068]
使用1张5μm切片进行he染色，用于确定圈取肿瘤区域。按照圈取的肿瘤区域将50μm的切片中的肿瘤区域取出。进行梯度乙醇脱蜡处理后，使用0.5mg/ml蛋白酶viii消化后，采用60-μm尼龙网过滤器将细胞悬液进行过滤。弃去上清后，将过滤的细胞进行pbs重悬，吸取100μl悬液进行离心涂片，涂片风干后进行甲醛固定，之后进行福尔根染色。采用数字病理扫描仪扫描染色后的细胞核涂层。
[0069]
染色质结构分型检测分析
[0070]
采用染色质结构分型分析软件(可购自梅傲科技(广州)有限公司，由软件开发者英国庐肆集团有限公司提供技术支持)对细胞核涂层扫描图像进行分析。分析原理如文章所述(lancet oncol 2018；19:356
–
69)。软件对扫描获得的细胞核进行分类后，通过对上皮细胞核的大小，每个像素点灰度值，以及不同的取样窗口进行计算的熵值四个维度(glem-4d)进行分析和计算，得出每个患者的染色质值，按照0.044的阈值分为染色质同质(cho，≥0.044)和染色质异质(che，＜0.044)两组。
[0071]
dna倍性检测分析
[0072]
与染色质结构分型分析第一步相同，采用分析软件(可购自梅傲科技(广州)有限
公司，由软件开发者英国庐肆集团有限公司提供技术支持)先对细胞核进行分类后，计算上皮细胞核的累计光密度值，软件可根据光密度值自动分为二倍体，四倍体，非整倍体，多倍体，在本研究中四倍体，非整倍体，多倍体都归类为非二倍体。
[0073]
间质比检测分析
[0074]
5μm的切片进行h&e常规染色，并使用aperio at2扫描仪进行扫描。在间质比分析软件(可购自梅傲科技(广州)有限公司，由软件开发者英国庐肆集团有限公司提供技术支持)中打开扫描后的图像，由病理医师在软件中圈出肿瘤区域后软件自动计算出该区域的间质所占的比例。按照50％的阈值分为低间质比组(≤50％)和高间质比组(＞50％)。
[0075]
3个指标组合算法如下：
[0076]
染色质结构分型：低危计0分，高危计1分
[0077]
dna倍性：低危计0分，高危计1分
[0078]
间质比：低危计0分，高危计1分
[0079]
低风险：总分＝0分
[0080]
中风险：总分＝1分
[0081]
高风险：总分≥2分
[0082]
实验结果
[0083]
表1临床特征
[0084][0085][0086]
msi-l：微卫星低度不稳定；msi-h：微卫星高度不稳定；mss：微卫星稳定
[0087]
表2对os风险评估进行单因素分析和多因素分析结果：
[0088]
[0089][0090]
结论：单因素分析结果看到，染色质结构分型，dna倍性，间质比三者结合，对ii期结直肠癌患者的dfs分层效果最好，高危组比低危组的hr＝4.554(95％ci 1.879-11.040)，p＝0.0008。
[0091]
结论：单因素分析结果看到，染色质结构分型分析，dna倍性分析，间质比三者结合，对ii期结直肠癌患者的os分层效果最好，高危组比低危组的风险比为hr＝4.554(95％ci 1.879-11.040)，p＝0.0008。
[0092]
较其他方法，如coloprog等，染色质结构分型分析，dna倍性分析，间质比三者结合可以将患者分为高，中，低危三组，三组总生存(os)分别为89.5％，67.9％，60.9％；三组无疾病进展生存(dfs)分别为86.0％，62.3％，53.6％；高，中，低危三组占的比例分别为31.8％，29.6％，38.5％。与coloprog等其他方法相比，染色质结构分型联合dna倍性分析分层效果更好，并且可以将更多的中危患者(约25.4％)分到低危组和高危组，使这部分患者避免因接受单药化疗甚至联合化疗所带来的毒副作用，或者避免因复发风险较高而未接受联合化疗带来的高复发风险。