华山参提取物在制备预防和治疗近视药物中的应用的制作方法

本发明涉及华山参提取物在制备预防和/或治疗近视药物中的应用及相关用途，属于生物医药的
技术领域：
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背景技术：
：我国儿童、青少年等的近视患病率不断攀升，并向高发、低龄化方向发展，患病人数高居世界首位，近视的防治属世界性难题。目前治疗近视包括手术干预、药物治疗、光学矫正等，手术治疗为介入性治疗，适合中低度近视，且具有一定损伤性；药物治疗包括散瞳剂、缩瞳剂、血管扩张解痉剂等，主要用于防治假性近视，潜在毒副反应较大，对儿童青少年存在较大的风险；配戴眼镜是最常用的手段，对生活中的运动、阅读等活动均造成不便。国内外研究发现，m胆碱受体抗胆碱药，可以使眼睛的睫状肌完全的处于放松状态，从而使睫状肌失去它原来的调节作用，从而缓解近视进展虽有较多基础研究，但至今尚未广泛应用于临床。睫状肌的紧张状态得到有效的缓和时，一直处于紧张调节状态下的肌肉也能够得到完全放松，这样就能有效缓解并改善眼睛的近视状况，但是阿托品并不能完全治愈近视，它只能控制近视进一步发展，所以临床上应用时必须要长期用药，少于一年则不具有确切的疗效，长期使用阿托品会对眼睛产生一定的伤害。中医药治疗近视虽有优势和特色，中药汤剂能够充分适应中医辨证施治的需要，并具有疗效快、易吸收、作用强等优点，也存在受原药材质量、炮制工艺、煎煮条件等影响较大，久置易发霉变质、不便携带，服用容积大，尤其是儿童难以服用等不足。目前市场上尚无治疗近视的中成药，将有效方剂、中药单体等研发成创新眼用中药制剂，不仅可提高用药依从性，还具有广泛的市场前景。祖国医学认为，正常生理机能活动与气血的盛衰通畅有密切关系，过多过久地近距离用眼，眼局部就产生中医所谓的“气血郁滞”现象，“过用目力，肝气失和，筋脉挛急，髓海失充，目失所养”导致睫状肌痉挛而发生近视。使用非选择性m受体阻滞剂阿托品可以有效延缓青少年近视进展，但是其眼局部及全身副作用限制了广泛临床应用，不适症状主要包括视近困难、畏光、弦光和眼睑过敏等。由于对长期使用阿托品的顾虑，学者开始关注选择性ml受体阻滞剂哌仑西平，使用哌仑西平的常见并发症为瞳孔散大、眼脸红斑和眼部刺痛，滴用哌仑西平后瞳孔对光反应仍存在。因此，积极研究和探索其他良好安全性药物，具有非常重要的意义。华山参为茄科植物漏斗泡囊草(physochlainainfundibularis)的根，华山参味甘、微苦，性温；具有温肺祛痰，平喘止咳，安神镇惊的功效；还具有抗胆碱作用，可松弛支气管平滑肌，缓解支气管平滑肌痉挛。华山参直接作用于平滑肌，使呈紧张状态的平滑肌缓解，尤以平喘作用最为显著，有对抗组织胺及扩张支气管作用。现有技术中对华山参的主要研究集中于滋补、止咳平喘。迄今尚未见华山参对近视改善作用相关的研究。技术实现要素：为了解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种华山参提取物在制备预防和/或治疗近视药物中的应用，本发明首次提出华山参提取物具有预防和/或治疗近视的新用途，并进一步通过系列试验得出华山参提取物对近视相关细胞、基因和蛋白的影响或作用，华山参提取物对眼睫状肌痉挛具有调节作用；且根据华山参提取物中的有效成分，提供了一种组合物及眼用制剂，所述组合物及眼用制剂能有效地预防和治疗近视。本发明所采用的技术方案如下：根据本申请的第一个方面，提供了一种华山参提取物在制备预防和/或治疗近视药物中的应用。本发明创新性地发现华山参提取物具有预防和/或治疗近视的新用途，华山参提取物中含有生物碱、香豆精、多酣类、留醇、氨基酸及油等。生物碱部分主要为阿托品类生物碱及其衍生物，其中托品烷类生物碱有阿托品、莨菪碱、山莨菪碱、东莨菪碱等，水溶性生物碱有五种，以胆碱为主。华山参提取物提取用于预防和/或治疗近视，具有治疗效果好，且安全性高的优势。所述华山参提取物包含所述华山参提取物包含0.01～200mg/g的山莨菪碱、0.01～200mg/g的东莨菪碱、0.01～200mg/g的阿托品和0.01～200mg/g的莨菪内酯；优选的，所述华山参提取物包含0.1～50mg/g的山莨菪碱、0.1～50mg/g的东莨菪碱、0.1～50mg/g的阿托品和0.1～50mg/g的莨菪内酯；更优选的，所述华山参提取物包含0.5～30mg/g的山莨菪碱、0.5～30mg/g的东莨菪碱、0.5～30mg/g的阿托品和0.5～30mg/g的莨菪内酯。当华山参提取物中山莨菪碱、东莨菪碱和莨菪内酯的含量过低时，华山参提取物对近视的预防和改善效果不显著；当华山参提取物中阿托品的含量过高时，华山参提取物有较明显的刺激性。所述华山参提取物通过将华山参经溶剂提取后获得。其中，所述华山参来自陕西秦岭中部到东部、河南西部和南部、山西南部的茄科植物漏斗泡囊草(华山参)的干燥根。春季采挖，除去须根，洗净。其中，河南产地的华山参表面棕褐色，有黄白色横长皮孔样突起，上部有环纹，茎痕及疣状突起，断面黄白色，皮部狭窄，木部宽广，可见细密的放射状纹理。在本发明的具体实施例中选择来自河南产地的华山参，将所述华山参按照常规方法磨碎后得到华山参粉使用。优选的，所述溶剂选自水、乙醇、石油醚、正己烷、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯中的至少一种；优选的，所述溶剂为乙醇；更优选的，所述溶剂为体积分数70％的乙醇。优选的，所述华山参与有机溶剂的比例为1g：1～50ml。优选的，所述提取选自加热回流提取、超声波提取、渗漉法提取和煎煮提取中的至少一种。本发明华山参的制备方法还包括将华山参经有机溶剂提取后，浓缩、纯化的步骤。其中，所述纯化采用大孔树脂吸附，以去除杂质。根据本申请的另一个方面，提供了一种华山参提取物在调控巩膜成纤维细胞和/或视网膜色素细胞生长中的应用。巩膜成纤维细胞和视网膜色素细胞参与了近视的发生和发展，本发明通过调控巩膜成纤维细胞和视网膜色素细胞的生长来改善近视，达到预防和治疗的目的。优选的，所选调控巩膜成纤维细胞和/或视网膜色素细胞生长为抑制巩膜成纤维细胞和/或视网膜色素细胞生长。抑制抑制巩膜成纤维细胞和视网膜色素细胞的生长可有效地抑制近视的发生发展。根据本申请的另一个方面，提供了一种华山参提取物在调控基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶抑制剂2和/或转化生长因子β2表达中的应用。在近视发生时，基质金属蛋白酶2和转化生长因子β2的表达上调，活性增加；基质金属蛋白酶抑制剂2的表达下调，活性下降。本发明通过调控基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶抑制剂2和转化生长因子β2的表达可有效地延缓近视的发生和发展。优选的，所述调控基质金属蛋白酶2和/或转化生长因子β2基因的表达为下调基质金属蛋白酶2和/或转化生长因子β2基因的表达。所述调控基质金属蛋白酶抑制剂2基因的表达为上调基质金属蛋白酶抑制剂2基因的表达。优选的，所述调控基质金属蛋白酶2和/或转化生长因子β2蛋白的表达为抑制基质金属蛋白酶2和/或转化生长因子β2蛋白的表达；所述调控基质金属蛋白酶抑制剂2蛋白的表达为促进基质金属蛋白酶抑制剂2蛋白的表达。根据本申请的另一个方面，提供了一种预防和/或治疗近视的组合物，所述组合物包含以下质量份的组分：山莨菪碱0.01～200份、东莨菪碱0.01～200份、阿托品0.01～200份和莨菪内酯0.01～200份；优选的，所述组合物包含以下质量份的组分：山莨菪碱0.1～50份、东莨菪碱0.1～50份、阿托品0.1～50份和莨菪内酯0.1～50份；更优选的，所述组合物包含以下质量份的组分：0.5～30mg/g的山莨菪碱、0.5～30mg/g的东莨菪碱、0.5～30mg/g的阿托品和0.5～30mg/g的莨菪内酯。根据本申请的另一个方面，提供了含有一种所述的组合物的眼用制剂，所述眼用制剂中还包含水和辅料；所述组合物、辅料和水的质量比为0.01～10：0.1～10：10～100。优选的，所述眼用制剂选自滴眼液、眼用凝胶和眼用乳膏中的至少一种；更优选的，所述眼用制剂为自滴眼液。当所述眼用制剂为眼用乳膏时，所述辅料可选自卡波姆、壳聚糖、透明质酸、泊洛沙姆、丙二醇、羧甲基纤维素的至少一种；当所述眼用制剂为眼用凝胶时，所述辅料可选自透明质酸、泊洛沙姆和丙二醇中的至少一种。根据本申请的再一个方面，提供了所述的组合物或所述的眼用制剂在制备预防和/或治疗近视药物中的应用。本发明的有益效果为：(1)本发明首次提出了华山参提取物在预防和治疗近视中的新用途，华山参提取物包含山莨菪碱、东莨菪碱、莨菪内酯和阿托品，并通过试验得到山莨菪碱、东莨菪碱、莨菪内酯可以部分取代阿托品的药效，来达到预防和治疗近视的目的，且有效避免了单纯使用阿托品带来的严重副作用以致不能在临床上应用的缺陷。本发明华山参提取物对近视的治疗效果显著，且安全性高，有望在临床上推广应用。(2)本发明通过试验证明了华山参提取物通过调控巩膜成纤维细胞、视网膜色素细胞的生长，及影响基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶抑制剂2和/或转化生长因子β2的表达来预防和改善近视，在机理上为预防和治疗近视提供了新的策略。(3)本发明提出了一种预防和治疗近视的组合物，该组合物中含有华山参提取物的有效成分，可以有效延缓近视进展；本发明提出的华山参提取物和组合物为预防和治疗近视提供了一个新的路径。附图说明图1为本发明混合对照品的hplc色谱图；图2为本发明华山参提取物样品的hplc色谱图；图3为本发明华山参提取物对巩膜成纤维细胞细胞增殖的影响；图4为本发明华山参提取物对视网膜色素细胞细胞增殖的影响图5为本发明华山参提取物对基质金属蛋白酶抑制剂2表达的影响；图6为本发明华山参提取物对转化生长因子β2表达的影响；图7为本发明华山参提取物对基质金属蛋白酶2表达的影响；图8为本发明华山参提取物对巩膜细胞蛋白表达的westernblot图；图9为使用华山参提取物干预前后兔眼对光反射情况，其中a为干预前，b为干预后；图10为本发明华山参提取物对细胞活力的影响。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，以下实施例仅为方便本领域技术人员理解本发明技术方案，实现或使用本发明所做的说明，并不以此限定本发明的保护范围。本发明中，如未指定，所采用原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。实施例中的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。实施例1采用超声提取的方法制备华山参提取物华山参提取物的制备方法包括以下步骤：(1)提取将华山参磨碎后制得华山参粉，称取2g华山参粉放入锥形瓶中，根据料液比1:25(g/ml)加入70％乙醇作为提取剂，在温度30℃，进行超声波(350w，50hz)处理30min；趁热减压抽滤，将滤液合并，得到提取液。(2)浓缩将提取液减压浓缩至无醇味，待用。实施例2采用加热回流提取的方法制备华山参提取物华山参提取物的制备方法包括以下步骤：(1)提取将华山参磨碎后制得华山参粉，称取200g华山参粉，放入2l的圆底烧瓶内，加入70％乙醇溶液至完全可以浸泡样品即可，恒温温度(100℃)水浴提取3h，所得提取液用纱布过滤，收集滤液；再次重复上述操作一次；最后将滤液合并，得到提取液。(2)浓缩将提取液减压浓缩至无醇味，待用。实施例3采用煎煮法制备华山参提取物华山参提取物的制备方法包括以下步骤：(1)提取将华山参磨碎后制得华山参粉，称取200g华山参，加水提取2次，每次2h，收集滤液，减压浓缩至相对密度为1.25～1.35(60℃)的清膏，加入乙醇沉淀，调整乙醇量为70％，静置，取上清液。(2)浓缩将上清液减压浓缩至无醇味，待用。实施例4采用渗漉法制备华山参提取物华山参提取物的制备方法包括以下步骤：(1)提取将华山参磨碎后制得华山参粉，称取200g华山参粉，加人70％乙醇溶剂均匀湿润，密闭放置一定时间后置圆锥形的渗漉器，加入70％乙醇溶剂，尽量排除饮片间隙中的空气，溶剂应高出药面，浸渍过夜后进行渗漉，收集85％饮片量的初漉液另器保存，续漉液经低温浓缩后与初漉液合并，得到提取液。(2)浓缩将提取液减压浓缩至无醇味，待用。实验例1采用高效液相色普法(hplc)检测不同提取方法制备的华山参提取物的主要成分，检测结果如表1所示。色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％甲酸溶液梯度洗脱，0min：90％-0.1％甲酸溶液；7min：90％-0.1％甲酸溶液；15min：80％-0.1％甲酸溶液；17min90％-0.1％甲酸溶液；20min90％-0.1％甲酸溶液；检测波长为210nm。理论板数按芍药苷峰计算应不低于6000。混合对照品溶液的制备：精密称取对照品山莨菪碱、东莨菪碱、阿托品、莨菪内酯适量加甲醇溶解，制成每1ml含山莨菪碱34.95μg、东莨菪碱34.425μg、阿托品39.55μg、莨菪内酯34.45μg的混合溶液。供试品溶液的制备：精密称取华山参提取物0.2g，置25ml容量瓶中，加入甲醇溶液，密塞，超声处理30min(超声频率40kh，功率150w)，放置至室温，用甲醇补足失去质量，经0.45μm过滤膜过滤，即得。分别精密吸取对照品和供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪测定，其中对照品的hplc色谱图如图1所示，实施例4中渗漉法制备的华山参提取物样品的hplc色谱图如图2所示，得到华山参提取物中主要成分含量，如表1所示。表1华山参提取物的主要成分含量(mg/g)山莨菪碱东莨菪碱阿托品莨菪内酯实施例129.6617.8826.136.40实施例239.1037.3747.8214.04实施例38.564.884.601.82实施例473.5552.9497.1921.07由表1的结果可知，不同制备方法得到的华山参提取物中主要成分有山莨菪碱、东莨菪碱、阿托品和莨菪内酯，且不同的制备方法中，各个有效成分的含量不同；其中，渗漉提取方法的提取效果最好。下列实施例中使用实施例4渗漉法得到的华山参提取物来做研究。实施例5一种华山参滴眼液的制备方法：称取上述实施例4得到的华山参提取物5g，加入800ml灭菌注射用水，搅拌下使完全溶解，加灭菌注射用水至1000ml，0.22μm滤膜正压滤过，灌装，使用棕色瓶包装，5ml或8ml/瓶，得到浓度为0.5％的华山参滴眼液。实施例6一种华山参滴眼液的制备方法：称取上述实施例4得到的华山参提取物10g，加入800ml灭菌注射用水，搅拌下使完全溶解，加灭菌注射用水至1000ml，0.22μm滤膜正压滤过，灌装，使用棕色瓶包装，5ml或8ml/瓶，得到浓度为1％的华山参滴眼液。实施例7一种华山参滴眼液的制备方法：称取上述实施例4得到的华山参提取物20g，加入800ml灭菌注射用水，搅拌下使完全溶解，加灭菌注射用水至1000ml，0.22μm滤膜正压滤过，灌装，使用棕色瓶包装，5ml或8ml/瓶，得到浓度为2％的华山参滴眼液。实施例8一种华山参滴眼液的制备方法：称取上述实施例4得到的华山参提取物40g，加入800ml灭菌注射用水，搅拌下使完全溶解，加灭菌注射用水至1000ml，0.22μm滤膜正压滤过，灌装，使用棕色瓶包装，5ml或8ml/瓶，得到浓度为4％的华山参滴眼液。实施例9华山参提取物在调控巩膜成纤维细胞和视网膜色素细胞生长中的应用具体操作如下：细胞增殖测定：分别取5-7代巩膜成纤维细胞或视网膜色素细胞，制成细胞悬液，以5×103/孔的浓度将细胞悬液接种于96孔板中，每孔细胞悬液体积均为100μl，每组细胞6孔重复，待所有细胞悬液接种完毕将96孔板放置于恒温培养箱中，培养24h，将实施例4制得的华山参提取物中加入含5％胎牛血清的1640培养基，制得华山参提取物的浓度分别为0.2496ng/ml、1.248ng/ml、6.24ng/ml、31.2ng/ml、156ng/ml、1.56μg/ml、15.6μg/ml、0.156mg/ml、1.56mg/ml，实验组分别加入含有不同华山参提取物(0.2496ng/ml、1.248ng/ml、6.24ng/ml、31.2ng/ml、156ng/ml、1.56μg/ml、15.6μg/ml、0.156mg/ml、1.56mg/ml)的培养液100μl，空白对照组加入等体积培养液(含5％胎牛血清的1640培养基)，再次将96孔板放置于37℃、5％co2恒温培养箱进行细胞培养，48h后将每孔中加入cck8溶液10μl，继续孵育细胞2h和4h后使用酶标仪检测波长450nm处吸光度值，计算巩膜成纤维细胞的细胞增殖率和视网膜色素细胞增殖率，结果如图3和图4所示。由图3的结果所示，较低浓度的华山参提取物对巩膜成纤维细胞的增殖没有明显的影响，较高浓度的华山参提取物的浓度越大，对巩膜成纤维细胞的增殖作用存在显著的影响。由此可知，华山参提取物可有效抑制巩膜成纤维细胞的生长。由图4的结果所示，不同浓度的华山参提取物均可影响视网膜色素细胞的增殖，且随着浓度的增加，对视网膜色素细胞的增殖作用影响越大。由此可知，华山参提取物可有效抑制视网膜色素细胞的生长。细胞周期测定：采用流式细胞术对各浓度细胞生长因子刺激24小时后的巩膜成纤维细胞生长周期进行测定，具体方法如下：取5-7代巩膜成纤维细胞，制成细胞悬液，以5×103/孔的浓度将细胞悬液接种于6孔板，置于恒温培养箱中，培养24。随机分为对照组和干预组，对照组给予3ml培养液(含5％胎牛血清的1640培养基)，干预组分别给予3ml的浓度为0.2425mg/ml、0.7275mg/ml、0.156mg/ml、1.56mg/ml、2.91mg/ml的华山参提取物浓度刺激，24小时后的细胞，倾掉培养液，0.25％胰酶消化3分钟，每孔加入培养液100μl,用培养液吹打，待细胞全部悬浮后，于平板转子离心机上，1500转/分，离心15分钟，弃掉上清。pbs洗潘2次，每次加入300μlpbs吹匀，使细胞完全悬浮，1500转/分，离心15分钟，重复一次。将细胞收集于5ml注射器内，用力打入5ml预冷的70％乙醇中，封口膜封口，4℃固定过夜。次日，将细胞于1500转/分，离心15分钟，收集固定好的细胞，pbs洗漆2次。用300μlpbs重悬细胞，并转至ep管中轻轻吹打。加rnase-a至终浓度约为50％ml，37℃水浴30分钟。加入pi染液约50μl至终浓度约为65％ml，在冰浴中避光染色30分钟。用300目尼龙网过滤，上机检测，检测的结果如表2所示。表2细胞周期检测结果g1期(％)s期(％)g2、m期(％)对照组33.55±2.3739.67±2.8624.90±1.180.2425mg/ml32.77±2.4140.13±3.0127.10±1.290.7275mg/ml31.27±2.3441.81±2.7926.92±1.260.156mg/ml29.12±2.1445.16±3.1125.72±1.231.56mg/ml23.16±1.9748.03±3.2528.81±1.422.91mg/ml17.12±1.6851.23±4.1231.64±1.53由表2的结果可知，华山参提取物可减少巩膜成纤维细胞g1期分裂，促进巩膜成纤维细胞s期分裂。由此可知，华山参提取物可影响影响巩膜成纤维细胞g2期生长。dapi染色：在染色前的细胞密度约是105/孔，移去完全培养基，用pbs清洗一次；用10％的甲醛溶液或者4％的多聚甲醛pbs在室温固定20分钟；用pbs在室温漂洗三次，每次10分钟；用含0.5％triton-x-100的pbs在室温通透化处理15分钟；用pbs在室温漂洗三次，每次10分钟；在室温用含10％ngs的pbs封闭1小时，或者在4摄氏度封闭过夜；在37摄氏度用特异性一抗孵育半小时，或者在室温下孵育一小时以上或者4摄氏度孵育过夜；用含0.1％tween-20的pbs在室温漂洗三次，每次10分钟；用铝箔包裹后在37摄氏度用二抗孵育半小时以上，或者在室温下孵育一小时以上；去除二抗，加入dapi染色液室温作用15分钟以上；用pbs在室温漂洗三次，每次10分钟，在荧光显微镜下观察，用合适波段激发，照相保存实验结果。结果显示巩膜成纤维细胞核形完整，染色质均匀。由此可见华山参提取物对巩膜成纤维细胞细胞核没有影响。实施例10华山参提取物在调控基质金属蛋白酶2(mmp-2)、基质金属蛋白酶抑制剂2(timp-2)和/或转化生长因子β2(tgf-β2)表达中的应用取5-7代巩膜成纤维细胞，制成细胞悬液，以5×103/孔的浓度将细胞悬液接种于96孔板中，每孔细胞悬液体积均为100μl，每组细胞6孔重复，待所有细胞悬液接种完毕将96孔板放置于恒温培养箱中，培养24h，实验分组分别加入含有不同浓度华山参提取物(浓度由高到低为5.82mg/ml、2.91mg/ml、1.56mg/ml、0.7275mg/ml、0.2425mg/ml)的培养液100μl，空白对照组加入等体积培养液(含5％胎牛血清的1640培养基)，再次将96孔板放置于37℃、5％co2恒温培养箱进行细胞培养。rt-pcr：用600μl裂解液rltplus将巩膜成纤维细胞细胞从培养板上吹打下来，并将裂解物转入1.5ml离心管中，用手剧烈振荡20s，充分裂解。然后将裂解物全部加到dna清除柱上。12,000rpm离心60s，保留滤过液。用微量移液器较精确估计滤过液体积，然后加入等体积590μl的70％乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。立刻将混合物加入吸附柱ra中，12,000rpm离心30s，弃废液。加入700μl去蛋白液rw1，室温放置1min，12,000rpm离心30s，弃废液。加入500μl漂洗液rw，12,000rpm离心30s，弃废液。加入500μl漂洗液rw，重复一遍。将吸附柱ra放回空收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。取出吸附柱ra，放入rnasefree离心管中，根据预期rna产量在吸附膜的中间部位加30μlrnasefreeh2o，室温放置1min，12,000rpm离心1min。琼脂糖凝胶电泳：取2μl提取好的总rna，1.0％琼脂糖凝胶电泳，200v，10min。反转录(ag0304-b)所用试剂如表3所示。表3反转录试剂和用量real-timepcr(ah0104-b)采用sybrgreeni实时荧光pcr体系，所用试剂如表4所示。pcr程序设定如表5所示，引物相关信息如表6所示。表4pcr体系试剂和用量表5pcr程序数据分析：将原始数据、扩增曲线和熔解曲线等信息从定量软件中导出进行分析，得到样本基因相对表达图谱，如图5～7所示。表6引物序列由图5～7的结果所示，本发明不同浓度的华山参提取物均可上调基质金属蛋白酶抑制剂2基因的表达，下调基质金属蛋白酶2和转化生长因子β2基因的表达。westernblot：利用培养基，将细胞用细胞刮刮下，收集细胞，3000g，15min，弃培养基，留细胞沉淀；pbs清洗1遍；每孔细胞中加入100μl的ripa裂解液(其中有3孔细胞沉淀很少，2孔近乎没有沉淀，各加50μlripa裂解液)，吹打细胞，使其充分接触裂解液，置于冰上30min，期间振荡裂解2-3次；12000rpm，15min，4℃离心，收集上清，-20℃保存。在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的sds-page蛋白上样缓冲液。例如5×或2×的sds-page蛋白上样缓冲液。使用5×的sds-page蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。100℃或沸水浴加热5～10min，以充分变性蛋白。封闭液(8％脱脂奶粉)的配制：用电子天平称取8g的脱脂奶粉于烧杯中，再吸取100ml洗膜液(tbst1×)于烧杯中，搅拌至奶粉完全溶解为止；将印有蛋白质的pvdf膜置于封闭液中，室温下置于摇床上摇动封闭1.5h；(3)封闭结束后倒掉脱脂奶粉，在摇床上用tbst(1×)清洗pvdf膜，每5min洗一次，洗3～5次。一抗按照说明书的稀释比例用8％脱脂奶粉或一抗稀释液稀释一抗。将pvdf膜进行剪切，将剪切得到的含目的蛋白片段的pvdf膜置于盒中，加入稀释好的抗体后过夜孵育；孵育结束后弃掉一抗，在摇床上用tbst(1×)清洗pvdf膜，每5min洗一次，洗3～5次。二抗用8％脱脂奶粉或二抗稀释液稀释5000倍使用。向清洗干净的装有pvdf膜的盒中加入含二抗的8％脱脂奶粉，室温慢摇孵育1h；孵育结束后弃掉二抗，在摇床上用tbst(1×)清洗pvdf膜，每5min洗一次，洗3～5次。将膜置于发光板上，用滤纸吸去膜上的tbst，加入适量的发光液，完全覆盖住pvdf膜。用化学发光成像仪曝光，结果如图8所示和表7所示。表7tgf-β/gapdhtimp-2/gapdhmmp-2/gapdh对照组0.82±0.050.63±0.071.02±0.04华山参提取物(5.82mg/ml)0.19±0.021.25±0.090.51±0.03华山参提取物(2.91mg/ml)0.26±0.061.06±0.080.67±0.04华山参提取物(1.56mg/ml)0.44±0.070.97±0.070.76±0.05华山参提取物(0.7275mg/ml)0.56±0.050.88±0.050.83±0.07华山参提取物(0.2425mg/ml)0.72±0.110.81±0.030.86±0.09由图8和表7的结果可知，本发明不同浓度的华山参提取物均可促进基质金属蛋白酶抑制剂2蛋白的表达，降低基质金属蛋白酶2和转化生长因子β2蛋白的表达，且呈一定的剂量依赖性。实施例11华山参提取物对屈光度的影响将家兔头部固定，提起下眼睑，把结膜囊拉成环状，家兔左眼作为受试眼，给予不同浓度的华山参提取物滴眼液(4％、2％、1％和0.5％)，3只/组，1d/次，连续给药14d，分别于7d和14d进行观察，在暗室用带状光检影镜进行检影(工作距离保持0.5m)，屈光度为垂直及水平两条主要子午线检测值的平均数检测的od(右眼视力)和os(左眼视力)结果如表8所示。干预前后兔眼对光反射情况如图9所示。表8由表8和图9的结果可知，不同浓度的华山参提取物(4％、2％、1％和0.5％)均有散瞳作用，1％和0.5％的华山参提取物可影响兔眼的屈光度，干预前后相差2d左右。实施例12华山参提取物的细胞毒性研究人arpe-19细胞用dmem/高糖培养基进行培养。培养基中含有10％的胎牛血清，0.4％的青霉素和链霉素。培养条件为37℃、5％的二氧化碳。使用人arpe-19细胞株，对华山参提取物的细胞毒性进行了检测。处于对数生长期的arpe-19细胞按照8000/孔的密度接种在96孔板中，过夜培养后，加入不同浓度的华山参提取物，继续培养72小时。每个处理浓度进行三个复孔进行培养。培养时间结束后，加入20μl的mtt继续培养4小时，然后各孔弃去溶液，加入150μl的dmso进行溶解，用酶标仪进行光密度检测，计算细胞生存率。实验重复三次，测量结果如图10所示。由图10的结果可知，不同浓度的华山参提取物对细胞没有任何毒性影响，体外ic50实验发现200μg细胞研究(2％)时，未见明显细胞毒性。实施例13华山参提取物的刺激性研究刺激性实验：取新西兰大白兔6只，雌雄各半，采用同体左右侧自身对比法，左眼滴入不同浓度(2％、1％和0.5％)的华山参滴眼液1滴，轻合眼睑10秒，右眼滴入生理盐水1滴作对照，给药后6h、24h、48h、72h至168h观察眼的局部反应情况。给药后6h、24h、48h、72h至168h，角膜、结膜及虹膜未见损害，用药后未引起家兔结膜上皮细胞变性、坏死、脱落、局部溃疡或糜烂，也未引起皮下组织充血、水肿及明显的炎细胞侵润，华山参滴眼液无眼部刺激性。因此，实验证实华山参提取物耐受性良好。实施例14一种预防和/或治疗近视的组合物包含以下质量份的组分：山莨菪碱0.01份、东莨菪碱0.1份、阿托品0.5份、莨菪内酯200份。实施例15一种预防和/或治疗近视的组合物包含以下质量份的组分：山莨菪碱200份、东莨菪碱0.01份、阿托品0.1份、莨菪内酯0.5份。实施例16一种预防和/或治疗近视的组合物包含以下质量份的组分：山莨菪碱0.1份、东莨菪碱200份、阿托品0.01份、莨菪内酯0.1份。实施例17一种预防和/或治疗近视的组合物包含以下质量份的组分：山莨菪碱0.5份、东莨菪碱0.5份、阿托品200份、莨菪内酯0.01份。实施例18一种预防和/或治疗近视的组合物包含以下质量份的组分：山莨菪碱30份、东莨菪碱50份、阿托品30份、莨菪内酯50份。实施例19一种预防和/或治疗近视的组合物包含以下质量份的组分：山莨菪碱50份、东莨菪碱30份、阿托品50份、莨菪内酯30份。对比例1一种组合物包含以下质量份的组分：东莨菪碱80份、阿托品50份、莨菪内酯30份。对比例2一种组合物包含以下质量份的组分：山莨菪碱80份、阿托品50份、莨菪内酯30份。对比例3一种组合物包含以下质量份的组分：山莨菪碱50份、东莨菪碱60份、阿托品50份。实验例2华山参提取物对治疗近视的效果的研究选取2周龄健康英国三色短毛豚鼠，平均体质量110g，适应性饲养3d后，随机分组模型组和实验组，10只/组，从第1周开始，除模型组外，试验组三色短毛豚鼠均右眼戴-6.0d透镜，左眼作为自身对照与模型组均不做任何处理，戴镜2周后分别测量各组的屈光度及眼轴长度，观察近视造模情况。第3周开始，试验组豚鼠右眼给予华山参提取物滴眼液，1次/d，连续干预4周，对侧眼作为自身对照，不做任何处理，期间继续配戴眼镜，4周后测量屈光度和眼轴长度，检测结果如表9所示。表9本发明实施例对近视的治疗效果由表9的结果所示，华山参提取物滴眼液可降低近视豚鼠的屈光度，降低眼轴长度，具有较好的治疗作用。以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。当前第1页12