一种含外泌体的软骨修复材料的制备方法与流程

本发明属于组织工程学领域，涉及软骨修复材料技术，尤其是一种含外泌体的软骨修复材料的制备方法。

背景技术：

关节软骨表面光滑，具有弹性，能最大限度地吸收、缓冲应力作用，能减少相邻两骨的摩擦，缓冲运动时产生的震动。而关节软骨损伤难以自愈，目前的治疗手段主要有软骨移植和金属材料或者高分子材料的关节假体置换，而两种方法在临床应用上都各自存在来源有限和置换术后松动等问题。

近年来，随着细胞生物学和生物材料科学的发展，组织工程学应运而生，它是利用生命科学和工程的原理和方法，以人工合成材料为载体整合被分离细胞，形成新的有功能组织。骨修复材料的发展是骨组织工程的一个重要方面，随着各种新型材料的出现，丰富了大家对骨损伤修复的认识和方法，研发真正的生物活性人工骨最直接的途径就是模仿天然骨的结构，合成一种与骨有相似纳米结构、组成成分和生物学反应的材料。

其中软骨工程包括：(1)种子细胞(2)支架材料(3)合适的培养环境，细胞因子的作用。自体软骨细胞分离培养简单，同源性好，但其来源非常有限，不能满足治疗的需求，而且体外多次培养容易产生表型转换，表达ⅰ型胶原为主，丧失分泌软骨基质的功能，极大限制了其作为种子细胞的应用前景。

通过对成骨机理和骨基元微观结构的深入研究，人们已经认识到自然软骨微观结构是由纳米羟基磷灰石晶须和ⅰ型、ⅱ型胶原纤维通过特定的排列和化学键的连接组成基本单元。目前的软骨修复材料基本采用ⅱ型胶原作为有机基质，通过原位析晶方法构建三维立体结构，从而获得软骨修复材料，或者是采用添加生长因子的方式构建软骨材料。

构建的软骨材料不仅在成分上与自然软骨相似，同时构造的三维构型可以满足生长增殖迁移的三维场所，提供细胞足够的生长空间，但是现有的胶原构建的骨材料仅仅是可以促进成骨细胞增殖，对血管没有修复作用，而添加的生长因子也存在易失活，不易保存的问题。

人类mirna-140定位于人的第16号染色体的短臂上，其靶目标主要有胰岛素样生长因子结合蛋白-5(igfbp-5)和去整合素金属蛋白酶-5(adamt-5)等。mirna140在软骨细胞中特异高表达。近年来的研究发现，mirna-140在参与软骨细胞分化与骨关节炎(oa)的发病机制中扮演重要角色。oa是软骨退变所致疾病的典型代表。在oa病人的软骨细胞中，mir140表达显著下调，mmp13和igfbp-5表达显著增高。在软骨细胞中转染mirna140可对抗这些改变。

外泌体是细胞之间的信号传递因子，它广泛存在并分布于各种体液中，携带多种蛋白质、mrna、mirna和脂质类物质等。生物体的外泌体形成了一种全新的细胞-细胞间信息传递网络，可参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程。利用外泌体递送mirna140治疗软骨缺损具备坚实的理论支撑。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种含外泌体的软骨修复材料的制备方法，旨在制备一种双组分胶原与羟基磷灰石为基元的仿生软骨支架材料，将外泌体有效的包埋其中，保持其原有活性，形成一种具有活性的功能性软骨修复材料，不仅能对成骨细胞增殖起到作用，而且可以修复血管损伤，增强仿生骨材料的功能性。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种含外泌体的软骨修复材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)外泌体的制备：

步骤一：利用基因工程手段构建mirna140过表达的质粒；

步骤二：借用慢病毒载体，包装后转染293t；

步骤三：侵染骨髓充间质干细胞；

步骤四：培养hbmmsc-140，从培养基中分离过表达mirna-140的外泌体exso-140，添加含葡萄糖酸钠和无机盐的保存液，-80℃保存；

(2)支架材料的制备：称取ⅰ型胶原和ⅱ型胶原，按照0.01-30:70-99.9(w/w)比例分散在醋酸溶液中，搅拌混合至体系均匀，并加入nah2po4继续搅拌若干小时后，用氨水调ph至10.0，缓慢加入ca(no3)2继续反应12h，反应结束后过滤，并将沉淀反复水洗后，放置于容器中；

(3)复合材料的制备：将处理后的支架材料置于外泌体exso-140的保存液中，负压吸引脱气1-4h，冰水浴中继续吸收2h，使支架能够充分吸收外泌体，再将浸泡后的支架材料置于容器中，-80℃超低温冰箱中预冷冻4-24h，-50℃冷冻干燥机中冷冻干燥24-48h，获得含有外泌体的活性软骨修复材料；

(4)成型：将(3)中干燥的活性骨架修复材料置于液氮研磨机中，研磨成粉。

而且，所述外泌体的制备步骤一以慢病毒表达载体为基础，整合mirna-140基因，得到mirna-140过表达慢病毒载体。

而且，所述的载体包括pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-140、

pcdh-ef1-luc2-t2a-tdtomato-140及pcdf1-mcs2-ef1-copgfp-140之一。

而且，所述外泌体的制备步骤二使用慢病毒包装质粒，转染293t细胞，富集高滴度的病毒液。

而且，所述的质粒包括pspax2和pmd2.g。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明采用两种不同类型胶原作为有机基质，建立基质与细胞的连接，在形成软骨修复支架的同时保持外泌体的活性，能够促进成骨细胞增殖，对血管起到软化、修复的作用，提供一种仿生度极高的细胞生长微环境，更好的引导组织形成，是一种具有活性的多功能软骨修复材料。

2、本发明将胶原与羟基磷灰石为基元的仿生软骨材料作为支架，将外泌体包埋其中，不仅能保持外泌体的活性，而且形成的三维多孔结构给细胞提供了更多的增殖空间，其中，羟基磷灰石在反应过程中通过原位合成和仿生矿化生成的产物，羟基磷灰石在合成和矿化的过程中，胶原蛋白直接在羟基磷灰石中长入，形成两种材料的有机结合体，共同作为支架材料与外泌体结合。

3、本发明制备的软骨修复材料通过加工定型工艺，能够实现适用于不同程度或者不同部位的软骨修复，且软骨修复材料原料容易获得，制备工艺简单可控，能够实现产业化。

4、综上，本发明针对软骨修复，提供了一种具有活性物质的复合仿生材料，技术方案为有机基质模板—原位合成—仿生矿化—外泌体包埋；其次由于本发明所涉及的成分均为不同类型的胶原和从人体细胞培养液中分离提取的外泌体，能够保持低免疫原性和良好的生物相容性；而且本发明涉及的软骨修复材料，能够根据不同程度或者不同部位的修复，提供不同剂型。

附图说明

图1为本发明培养的软骨细胞中igfbp-5含量测试结果图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1

(1)外泌体的制备步骤：

步骤一：利用基因工程手段构建mirna140过表达的质粒。

以pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp慢病毒表达载体为基础，整合mirna-140基因，得到mirna-140过表达慢病毒载体pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-140。

步骤二：包装获得慢病毒，转染293t。

使用慢病毒包装质粒pspax2和pmd2.g对pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-140进行包装，转染293t细胞，富集高滴度的病毒液。

步骤三：侵染骨髓充间质干细胞。

用包装好的病毒侵染骨髓间充质干细胞，得到过表达mirna-140的骨髓间充质干细胞hbmmscs-140。

步骤四：培养hbmmsc-140，从培养基中分离过表达mirna-140的外泌体exso-140，添加含葡萄糖酸钠和无机盐的保存液，-80℃保存。

(2)支架材料：称取ⅰ型胶原和ⅱ型胶原，按照15:85(w/w)比例分散在醋酸溶液中，搅拌混合至体系均匀，并加入一定量的nah2po4继续搅拌若干小时后，用氨水调ph至10.0，缓慢加入ca(no3)2继续反应12h，反应结束后过滤，并将沉淀反复水洗后，放置于容器中。

(3)复合材料：将处理后的支架材料置于外泌体exso-140的保存液中，负压吸引脱气1h，冰水浴中继续吸收2h，使支架能够充分吸收外泌体，再将浸泡后的支架材料置于容器中，-80℃超低温冰箱中预冷冻4h，-50℃冷冻干燥机中冷冻干燥24h，获得含有外泌体的活性软骨修复材料。

(4)成型：将(3)中干燥的活性骨架修复材料置于液氮研磨机中，研磨成粉。

实施例2

(1)外泌体的制备步骤

步骤一：利用基因工程手段构建mirna140过表达的质粒。

以pcdh-ef1-luc2-t2a-tdtomato慢病毒表达载体为基础，整合mirna-140基因，得到mirna-140过表达慢病毒载体pcdh-ef1-luc2-t2a-tdtomato-140。

步骤二：包装获得慢病毒，转染293t。

使用慢病毒包装质粒pspax2和pmd2.g对pcdh-ef1-luc2-t2a-tdtomato-140进行包装，转染293t细胞，富集高滴度的病毒液。

步骤三：侵染骨髓充间质干细胞。

用包装好的病毒侵染骨髓间充质干细胞，得到过表达mirna-140的骨髓间充质干细胞hbmmscs-140。

步骤四：培养hbmmsc-140，从培养基中分离过表达mirna-140的外泌体exso-140，添加含葡萄糖酸钠和无机盐的保存液，-80℃保存。

(2)支架材料：称取ⅰ型胶原和ⅱ型胶原，按照30:70(w/w)比例分散在醋酸溶液中，搅拌混合至体系均匀，并加入一定量的nah2po4继续搅拌若干小时后，用naoh调ph至8.5，缓慢加入ca(no3)2继续反应24h，反应结束后过滤，并将沉淀反复水洗后，放于容器中。

(3)复合材料：将(2)中支架材料置于含有外泌体exso-140的保存液中，负压吸引脱气2h，冰水浴中继续吸收2h，使支架能够充分吸收外泌体，再将浸泡后的支架材料置于模具中，-80℃超低温冰箱中预冷冻4h，-50℃冷冻干燥机中冷冻干燥24h，获得含有外泌体的活性软骨修复材料。

(4)成型：将(3)中干燥的活性骨架修复材料置于液氮研磨机中，研磨成粉。

实施例3

外泌体的制备步骤

步骤一：利用基因工程手段构建mirna140过表达的质粒。

以pcdf1-mcs2-ef1-copgfp慢病毒表达载体为基础，整合mirna-140基因，得到mirna-140过表达慢病毒载体pcdf1-mcs2-ef1-copgfp-140。

步骤二：包装获得慢病毒，转染293t。

使用慢病毒包装质粒pspax2和pmd2.g对pcdf1-mcs2-ef1-copgfp-140进行包装，转染293t细胞，富集高滴度的病毒液。

步骤三：侵染骨髓充间质干细胞。

用包装好的病毒侵染骨髓间充质干细胞，得到过表达mirna-140的骨髓间充质干细胞hbmmscs-140。

步骤四：培养hbmmsc-140，从培养基中分离过表达mirna-140的外泌体exso-140，添加含葡萄糖酸钠和无机盐的保存液，-80℃保存。

(2)支架材料：称取ⅰ型胶原和ⅱ型胶原，按照15:85(w/w)比例分散在醋酸溶液中，搅拌混合至体系均匀，并加入一定量的nah2po4继续搅拌若干小时后，用氨水调ph至10.0，缓慢加入ca(no3)2继续反应12h，反应结束后过滤，并将沉淀反复水洗后，放置于容器中，-80℃超低温冰箱中预冷冻4h，-50℃冷冻干燥机中冷冻干燥48h。

(3)复合材料：将(2)中干燥的支架材料置于含有外泌体exso-140的保存液中，负压吸引脱气1h，冰水浴中继续吸收2h，使支架能够充分吸收外泌体，再将浸泡后的支架材料置于容器中，-80℃超低温冰箱中预冷冻8h，-50℃冷冻干燥机中冷冻干燥24h，获得含有外泌体的活性软骨修复材料。

(4)成型：将(3)中干燥的活性骨架修复材料置于液氮研磨机中，研磨成粉。

本发明终产品特性：经过包埋外泌体的原位合成制成的软骨修复材料，通过提供一种仿生度极高的细胞生长微环境，更好的引导组织形成，体外试验和动物实验表明，材料的生物相容性和组织相容性极佳。

在培养软骨细胞24小时后，加入无外泌体的保存液(空白对照)，或者含exo-140的保存液，分别于24h、48h、72h检测软骨细胞中的igfbp-5含量。如图1，实验数据显示，exo-140能减少igfbp-5的产生。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例和附图，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。