一种可诱导骨再生的生物膜及其制备方法与流程

本发明涉及人体组织再生医学材料制备，尤其涉及一种可诱导骨再生的生物膜及其制备新方法，属于医用生物材料领域。

背景技术：

膜引导骨组织再生技术是一个新的生物学概念，最初产生于牙周病治疗中，其理论基础是：骨创伤修复过程中，不同组织细胞向创口内生长迁移的速度不同，通过放置膜形成一个机械性屏障，阻止其它组织细胞的长入，从而为骨细胞的生长提供一个引导空间，增强骨组织再生能力，加快骨组织新陈代谢，有效避免骨缺损的纤维愈合，促进骨愈合，从而达到理想的组织再生与修复的目的。

引导骨组织再生技术中起关键作用的是引导膜，目前膜材料一般可分为两大类，非降解性材料与可降解性材料，其中，非降解性材料因其不能被组织吸收，需要二次手术取出，在临床上基本不使用。可降解膜材料应用较多的是胶原类材料，具有组织相容性好，不需二次手术取出的优点，能够起到很好的隔离屏障作用。但是，纯胶原类材料其结构和材料组成，很难起到诱导骨组织再生的作用。

通过脱细胞技术获得的ecm（细胞外基质）生物支架已被广泛应用与人体组织重建，如心脏膜瓣、皮肤、肌腱和硬脑膜等，其三维结构与体内细胞生长的天然环境接近，不仅可以起着支架材料的作用，而且包含多种生长因子，在组织修复和重建中有重要促进作用。然而，异种或异体细胞抗原由于被宿主认为是外来体，会引发宿主的炎性反应和免疫介导的排斥反应，因此在应用前必须彻底去除，然而免疫原性物质去除过程中，不可避免地会破坏引导膜的三维结构，导致膜引导组织再生功能大打折扣。

目前制备细胞外基质的脱细胞方法有很多，主要包括物理法、化学法和生物处理法，但是每种脱细胞方法均会改变ecm成分，引起不同程度超微结构的损害，这些改变会影响人体对植入基质材料的反应。因此研究通过温和的脱细胞方法得到细胞外基质，最大限度的保留组织ecm的成分和天然结构，是非常有必要的。

申请号为201310041671.8的专利公开了一种组织再生引导膜及其制备方法，制备方法包括：前处理步骤，收集哺乳动物腹膜，流动水洗涤及脱毛、初步脱脂后备用；去抗原处理步骤，依次采用酶处理工艺、碱处理工艺、酸处理工艺和高渗处理工艺对备用的腹膜进一步脱脂，去除免疫原性；胶原纤维收缩处理步骤，对去抗原处理后的腹膜依次进行脱水、去除非亲水性物质和水洗处理，使腹膜的胶原纤维收缩；干燥步骤，将收缩处理后的腹膜平铺于培养皿表面，使腹膜的致密层接触培养皿，迅速转移至-60到-80℃冰箱中预冻1-8小时，再放入冻干机中冻干24-36小时后得到可引导组织再生的胶原膜。本发明的引导膜具有致密层和疏松层，还具有良好的生物相容性、亲水性和骨诱导能力，体内降解时间长。但是该方法处理繁琐，对组织材料的结构破坏较大。申请号为201510256512.9的专利公开了一种引导组织再生膜的制备方法及其应用，发明的方法包括如下步骤：（1）使用表面活性剂溶液浸泡处理离体动物的皮肤；（2）使用碱溶液浸泡处理步骤（1）的产物；（3）使用过氧化物溶液浸泡处理步骤（2）的产物；（4）使用辐照保护试剂溶液处理步骤（3）的产物；（5）使用缓冲液浸泡处理步骤（4）的产物；（6）将步骤（5）产物依次进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到所述引导组织再生膜。此种方法对生物组织的结构破坏较大，且可能存在免疫原物质去除不彻底的风险。

理想的引导骨再生的生物膜应不仅起到屏障作用，还应该能够模拟人体组织所处的生理环境，为组织再生提供细胞生长支架，诱导组织细胞再生分化，促进损伤骨组织的再生修复。

技术实现要素：

本发明针对现有骨引导再生膜材料制备的局限性，提供了一种可诱导骨再生的生物膜及其制备方法，通过取材哺乳动物的腹膜组织，使用二价金属螯合剂和不同渗透压的酸碱处理，有效消除了制得的生物膜的免疫原性，降低了临床使用的免疫排斥风险，同时，免疫原物质去除过程中的处理，充分考虑了对生物组织三维结构的保持，更重要的事，经过本专利提供的方法处理后，可得到具有光面/毛面的双面结构的可诱导骨再生的生物膜，其光面结构能够发挥膜的屏障作用，阻止其他组织细胞向骨创口内生长，为骨再生提供良好的环境，其毛面结构可以为骨细胞增殖提供支架结构，促进骨细胞快速增殖，从而实现缺损的高效、快速愈合。

本发明制备一种可诱导骨再生的生物膜的策略为：取哺乳动物新鲜的腹膜组织，反复冻融，以使细胞破碎，去除部分免疫原物质，使用碳酸氢钠粉末去除腹膜脂肪面上的脂肪和多余的浆膜，可得到均匀的毛面结构。依次反复使用二价金属离子螯合剂、高渗碱溶液、低渗碱溶液、高渗酸溶液进行免疫原物质去除处理，去除腹膜组织中的脂质、细胞结构及各类dna和rna成分，中和清洗后，辐照灭菌，得到可应用于临床的一种可诱导骨再生的生物膜。

进一步的，本发明制备可诱导骨再生的生物膜采用如下技术方案：

一方面，本发明提供一种可诱导骨再生的生物膜的制备方法，包括：

1）取新鲜的哺乳动物腹膜组织，置于-20℃条件下，反复冻融3-5次后取出，将腹膜展平置于冰袋上，脂肪面向上，在脂肪面侧均匀洒上碳酸氢钠粉末，搓洗，去除脂肪和多余的浆膜，流水冲洗12h；

2）将经步骤1）处理过的膜放入edta溶液中，15℃-25℃条件下，振摇15h后转入naoh溶液中，室温振摇2h；

3）将经步骤2）处理过的膜转入edta溶液中，15℃-25℃条件下，振摇2h后，转入naoh溶液中，室温振摇2h；

4）将经过步骤3）处理过的膜转入naoh溶液中振摇，期间更换naoh溶液3次，每次振摇30min；

5）重复步骤2）-步骤4）3-5次；

6）将经步骤5）处理过的膜放入hcl-nacl溶液中处理3-5次，每次2h，使用1%碳酸氢钠溶液中和，至ph值中性；

7）将经步骤6）处理过的腹膜用纯化水或注射用水洗涤至洗液电导率降低到60us/cm以下，冻干；

8）将经步骤7）处理过的腹膜进行钴-60灭菌处理。

可选的，所述步骤1）中哺乳动物包括猪、牛、狗、羊、兔和鼠，优选小牛。

可选的，所述步骤2）和步骤3）中edta溶液的浓度为0.1mol/l-0.5mol/l，优选0.5mol/l的edta溶液，所述naoh溶液的浓度为2%-5%naoh溶液，优选2%的naoh溶液。

可选的，所述步骤4）中naoh溶液的浓度为0.1%-0.5%naoh溶液，优选0.5%naoh溶液。

可选的，所述步骤6）中hcl-nacl溶液的配制方法为：在0.5%hcl溶液中，按照1%的浓度加入nacl。

另一方面，本发明提供一种可诱导骨再生的生物膜，采用如上所述的制备方法制备获得。

可选的，所述的可诱导骨再生的生物膜具有光面/毛面双面结构。

本发明的有益效果如下：

1.本发明提供的制备方法获得的可诱导骨再生的生物膜具有均匀的光面/毛面双面结构，其光面结构能够发挥膜的屏障作用，阻止其他组织细胞向骨创口内生长，为骨再生提供良好的环境，其毛面结构可以为骨细胞增殖提供支架结构，促进骨细胞快速增殖，从而实现缺损的高效、快速愈合；

2.本发明提供的一种可诱导骨再生的生物膜的制备方法简单有效，使用的试剂环境友好，废弃试剂通过简单的酸碱中和即可处理，简便易行，制备过程不使用表面活性剂，避免了表面活性剂去除的困难；

3.本发明提供的一种可诱导骨再生的生物膜的制备方法对细胞外基质的成分和三维结构破坏小，最大限度的保留了细胞外基质的有效成分的生物活性，对组织的修复能力强；

4.本发明提供的一种可诱导骨再生的生物膜的制备方法可彻底去除组织中的免疫原性物质，如脂质、细胞成分、杂蛋白及各类dna和rna成分等。

附图说明

图1一种可诱导骨再生的生物膜光面；图2一种可诱导骨再生的生物膜毛面。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。需要说明的是，以下所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1

取新鲜的小牛腹膜组织，置于-20℃条件下，反复冻融3次后取出，将腹膜展平置于冰袋上，脂肪面向上，按照每平方厘米加0.5克的比例，在脂肪面侧洒上碳酸氢钠粉末，搓洗，去除脂肪和多余的浆膜，流水冲洗12h，上述为前处理步骤。将膜转入0.5mol/l的edta溶液中，25℃条件下，振摇15h后转入3%的naoh溶液中，室温振摇2h，将膜转入0.5mol/l的edta溶液中，25℃条件下，振摇2h后，转入3%的naoh溶液中，室温振摇2h，将膜转入0.1%的naoh溶液中振摇，期间更换naoh溶液3次，每次振摇30min。重复上述前处理步骤后的处理3次。将上述处理后的膜放入0.5%hcl-1%nacl溶液中处理3次，每次2h，使用1%碳酸氢钠溶液中和，至ph值中性，纯化水清洗至洗液电导率降低到60us/cm，辐照灭菌备用。

实施例2

取新鲜的猪腹膜组织，置于-20℃条件下，反复冻融3次后取出，将腹膜展平置于冰袋上，脂肪面向上，按照每平方厘米加0.5克的比例，在脂肪面侧洒上碳酸氢钠粉末，搓洗，去除脂肪和多余的浆膜，流水冲洗12h，上述为前处理步骤。将膜转入0.5mol/l的edta溶液中，25℃条件下，振摇15h后转入2%的naoh溶液中，室温振摇2h，将膜转入0.5mol/l的edta溶液中，25℃条件下，振摇2h后，转入2%的naoh溶液中，室温振摇2h，将膜转入0.5%的naoh溶液中振摇，期间更换naoh溶液3次，每次振摇30min。重复上述前处理步骤后的处理3次。将上述处理后的膜放入0.5%hcl-1%nacl溶液中处理3次，每次2h，使用1%碳酸氢钠溶液中和，至ph值中性，纯化水清洗至洗液电导率降低到60us/cm，辐照灭菌备用。