多杂环-吡唑啉类衍生物在制备抗非小细胞肺癌药物中的应用的制作方法

本发明涉及多杂环-吡唑啉类衍生物在制备抗肺癌药物中的应用，尤其涉及荧光化合物2-(5-(苯并[d][1,3]二氧杂-5-基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-1-基)-4-(吡啶-4-基)噻唑(简略记为bpt)在制备抑制a549癌细胞生长的抗非小细胞肺癌药物中的应用。

背景技术：

肿瘤是众所周知的严重危害人类健康的疾病之一，发病率和死亡率逐年上升。预计在2030年，全世界将有2140万新诊断肿瘤病例，而肿瘤死亡人数将达1320万。肺癌因其发现晚，高致死率，在癌症治疗中成为一个全球性难题。大气污染等环境因素和吸烟等不良生活习惯，也加剧了肺癌的发展。在肺癌病例当中非小细胞肺癌约占85％的比重，约75％的患者在发现时已处于中晚期，5年存活率极低。化学药物治疗在肺癌的各种治疗方法中占有重要的地位。小分子化合物可以作为肿瘤抑制因子，成为一种有前景的新治疗策略。

然而临床上肺癌化疗所面临的一个非常大的挑战就是药物选择性差，即在肿瘤治疗的同时对正常组织造成毒副作用导致治疗失败，而且选择性差的药物很容易引起肿瘤细胞的耐药。因此，迫切需要研发更多具有抑制肺癌细胞生长的化合物或制剂。经检索，有关荧光化合物2-(5-(苯并[d][1,3]二氧杂-5-基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-1-基)-4-(吡啶-4-基)噻唑在制备抑制a549癌细胞生长的抗肺癌药物中的应用尚未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种化合物2-(5-(苯并[d][1,3]二氧杂-5-基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-1-基)-4-(吡啶-4-基)噻唑(简略记为bpt)在制备抑制a549癌细胞生长的抗非小细胞肺癌药物中的应用。

本发明所述的化合物2-(5-(苯并[d][1,3]二氧杂-5-基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-1-基)-4-(吡啶-4-基)噻唑在制备抗非小细胞肺癌药物中的应用，其中所述2-(5-(苯并[d][1,3]二氧杂-5-基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-1-基)-4-(吡啶-4-基)噻唑简略记为bpt，其结构式如式(i)所示：

上述的应用中：所述2-(5-(苯并[d][1,3]二氧杂-5-基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-1-基)-4-(吡啶-4-基)噻唑能够有效抑制a549细胞生长的剂量为1～5μm。

上述化合物2-(5-(苯并[d][1,3]二氧杂-5-基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-1-基)-4-(吡啶-4-基)噻唑抑制a549癌生长的细胞生物学实验及结果如下：

1.化合物bpt对a549细胞存活率的影响。

实验组：分别将浓度为0.1μm，1μm，5μm，10μm的bpt处理a549细胞24h和48h。阴性对照：dmso(0.02％，v/v)，阳性对照：临床抗癌药物五氟尿嘧啶(5-fu)。

结果表明：在用1μm，5μm，10μm的bpt处理a549细胞24h和48h后能够显著抑制a549细胞的存活，见图1。具体作用结果见下表：

2.化合物bpt对a549细胞形态的影响。

实验组：分别用浓度为0.1μm，1μm，5μm，10μm的bpt处理a549细胞12h，24h和48h后拍摄细胞形态变化。对照组：dmso(0.02％，v/v)。

结果表明：在上述时间条件下，用5μm，10μm的bpt处理能够减少a549细胞的数量，见图2。

3.化合物bpt对a549细胞的抑制作用优于临床药物5-fu。

实验组：分别计算化合物bpt以及5-fu处理a549细胞48h的半抑制浓度(ic50)。发现bpt的ic50值为2.6μm，优于临床药物5-fu(9.4μm)。

上述的实验数据统计学处理：

实验数据以平均值±标准误差表示，经t检验：*p<0.05表示有显著性差异；**p<0.01表示有极显著性差异。

由上述实验及其结果，可以得出如下结论：

bpt能够显著抑制a549细胞生长，并且抑制作用优于临床药物5-fu。

本发明提供的bpt所显示的抑制a549癌细胞生长的结果，预示bpt有望作为一种有效的抑制肿瘤生长工具，为开发抗非小细胞肺癌治疗药物奠定基础。

附图说明

图1：bpt抑制a549细胞存活。

其中：a:bpt处理a549细胞24h后，检测a549细胞存活率。

b:bpt处理a549细胞48h后，检测a549细胞存活率。

图2：bpt促进a549形态改变并减少细胞数量。

不同浓度bpt处理a549细胞12h，24h和48h后，显微镜拍照观察a549细胞形态和数量变化。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中，所使用的材料、细胞、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

实施例1：bpt处理a549细胞后srb法存活率检测。

(1)加入不同浓度的化合物bpt处理事先种于96孔板的细胞。(2)化合物处理24h以及48h后弃旧培养液，加入100μl的三氯醋酸，置于4℃固定细胞1h。(3)弃固定液。用双蒸水洗五遍，动作轻柔，室温晾干。(4)每孔加入50μl的srb，室温摇床，10分钟。(5)用1％醋酸洗5遍，室温晾干。(6)每孔加入100μl浓度10mm的缓冲液tris碱，置于摇床10分钟。(7)选择540nm激发光，测od值。

结果表明：1μm，5μm，10μm的bpt处理a549细胞24h以及48h后能够显著抑制a549细胞的存活，见图1。

实施例2：bpt处理a549细胞后，倒置显微镜下检测细胞形态和数量变化。

将a549细胞接种于直径6cm的培养皿中，37℃，co2孵箱内培养12h之后，加入不同浓度bpt处理12h,24h以及48h后置于倒置显微镜下拍摄细胞形态，观察数量。

结果表明：上述条件下，5μm，10μm的bpt能够使细胞形态发生变化，有些细胞呈现出细窄狭长和变圆等变化，明显减少a549细胞的数量。见图2。

实施例3：bpt的制备

在100ml的圆底烧瓶中加入1.20克苯乙酮(0.01摩尔)，1.50克胡椒醛(0.01摩尔)，氢氧化钠水溶液(8毫升，2.5摩尔)以及乙醇(20毫升)，装置回流冷凝器，上部接干燥管。加热回流5小时，反应至原料完全消耗，用tlc检测反应终点。黄色沉淀物经水洗，干燥得到(e)-3-(苯并[d][1,3]二氧杂-5-基)-1-苯基丙-2-烯-1-酮。

在1.512克(0.006摩尔)(e)-3-(苯并[d][1,3]二氧杂-5-基)-1-苯基丙-2-烯-1-酮的乙醇(30毫升)溶液中加入0.546克硫代氨基脲(0.006摩尔)，8毫升氢氧化钠水溶液(2.5摩尔)，加热搅拌回流反应6小时，反应至原料完全消耗，用tlc检测反应终点。静置过夜，析出固体，过滤，减压抽滤得5-(苯并[d][1,3]二氧-5-基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-1-硫代酰胺。

在0.325克(0.001摩尔)5-(苯并[d][1,3]二氧-5-基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-1-硫代酰胺的乙醇(25毫升)溶液中加入0.200克2-溴-1-(吡啶-4-基)乙酮(0.001摩尔)，加热搅拌回流反应8小时，反应至原料完全消耗，用tlc检测反应终点。静置过夜，析出固体，过滤，乙醇洗两遍。然后将固体溶于二氯甲烷，先后用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机相减压蒸干溶剂得到2-(5-(苯并[d][1,3]二氧杂-5-基)-3-苯基-4,5-二氢-1h-吡唑-1-基)-4-(吡啶-4-基)噻唑。

核磁共振数据如下：

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.55(dd,j＝4.7,1.4hz,2h),7.81-7.79(m,2h),7.71(s,1h),7.67(dd,j＝4.7,1.5hz,2h),7.52-7.48(m,3h),6.95-6.89(m,3h),5.98(d,j＝5.8hz,2h),5.63(dd,j＝11.8,6.5hz,1h),4.01(dd,j＝18.0,11.8hz,1h),3.38(dd,j＝18.0,6.5hz,1h).

质谱数据如下：

hrms(ei)：m/z427.1229[m+h]⁺。