一种具有生物抑菌性的黄芩提取物自微乳剂的制作方法

本发明属于兽药技术领域，涉及一种基于黄芩提取物活性物质成分的、具有生物抑菌性能的自微乳剂。

背景技术：

抗生素的长期使用，导致了广泛耐药性病菌的出现。开发安全性高、抗菌活性高、不易产生耐药性的新型抗菌剂，已经成为当前畜禽养殖过程中亟待解决的问题。

中草药因毒副作用小、无残留、不易产生耐药性、兼具药用和营养功效，已经在畜禽养殖中得到应用。

黄芩(scutellariabaicalensisgeorgi)，来源于唇形科植物黄芩的干燥根，具有抗菌、保肝、抗病毒、抗氧化、消除自由基、抗过敏和保护神经元等功效。黄芩是一种已被证实具有良好抗菌作用的中药材，其提取物黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素具有抑菌抗菌和增强畜禽免疫力的作用。大量研究表明，黄芩素和汉黄芩素是黄芩中真正起药效作用的物质，黄芩苷和汉黄芩苷也需要经肠道菌群水解成苷元黄芩素和汉黄芩素才可以发挥作用。

然而，黄芩素和汉黄芩素为疏水性强的脂溶性化合物，多元醇、水等常见药用溶剂无法有效溶解黄芩素和汉黄芩素，进而无法达到良好的抑菌抑菌效果，更无法添加到畜禽饮用水中促进畜禽健康生长。而直接使用黄芩素和汉黄芩素又存在易氧化失活，在水中溶解度差、不能有效分散等问题，进而影响了其药效。

技术实现要素：

本发明的目的是克服上述现有技术存在的不足，提供一种易于与水形成热力学稳定微乳液体系的、具有生物抑菌性的黄芩提取物自微乳剂。

本发明所述的黄芩提取物自微乳剂是以黄芩co2超临界提取物为活性物质，与非离子表面活性剂、短链脂肪醇、改性植物油混合形成的一种具有生物抑菌性的自微乳剂。

具体地，本发明所述自微乳剂是由非离子表面活性剂、改性植物油、短链脂肪醇和黄芩co2超临界提取物以下述质量百分含量混合组成的：非离子表面活性剂10～40%，改性植物油20～55%，短链脂肪醇20～50%，黄芩co2超临界提取物2～6%。

本发明通过所述非离子表面活性剂、短链脂肪醇、改性植物油、黄芩co2超临界提取物的合理组合，形成了一种具有生物抑菌性能的自微乳剂。将该自微乳剂用水稀释后，黄芩co2超临界提取物将以小于100nm的分散状态存在于稀释液中。且用水稀释时，该自微乳剂可以与水形成热力学稳定的微乳液体系，稀释液外观澄清透明，不分层，无沉淀。

其中，所述的黄芩co2超临界提取物是采用常规的co2超临界提取方法对黄芩药材进行提取后得到的物质，其主要成分为黄芩素和汉黄芩素。

具体地，本发明所述自微乳剂中的非离子表面活性剂是由司盘-80与吐温-60和/或吐温-20组成的混合物。

更具体地，所述的改性植物油为聚氧乙烯蓖麻油，并在其中添加有月桂酸异丙酯和/或肉豆蔻酸异丙酯。

进一步地，所述的短链脂肪醇为异丙醇、丙三醇、乙二醇中的一种或几种。

本发明所述具有生物抑菌性的自微乳剂可以按照以下方法制备得到：将非离子表面活性剂、改性植物油、短链脂肪醇和黄芩co2超临界提取物按照所述质量百分含量投入搅拌釜中，搅拌混合至透明均匀状态，制备得到自微乳剂。

将本发明制备的具有生物抑菌性的自微乳剂用水稀释，搅拌均匀后即可使用。本发明自微乳剂用水稀释后的分散相液滴粒径小于100nm。

本发明所述的自微乳剂可以作为畜禽消杀抑菌剂使用。用于抑菌时，按质量比加水50～100倍稀释后使用。

本发明所述的具有生物抑菌性的自微乳剂还可以作为畜禽生长促进剂使用，用以促进畜禽的生长和提高免疫力。作为畜禽生长促进剂使用时，按质量比加水100～500倍稀释后使用。

本发明采用自微乳技术制备黄芩提取物自微乳剂，使黄芩co2超临界提取物在用水稀释后，可以以小于100nm的状态分散在水中，形成外观均匀透明的热力学稳定体系，不分层，无沉淀，解决了黄芩co2超临界提取物难以直接使用的问题，并显著提高了药效。

针对大肠杆菌进行的抑菌评价试验显示，本发明自微乳剂的最低抑菌浓度仅为传统黄芩水提取物(主要成分黄芩苷和汉黄芩苷)浓度的1/53。而对金黄葡萄球菌的抑菌评价试验也显示，本发明自微乳剂的最低抑菌浓度仅为传统黄芩水提取物浓度的1/16。

42日龄肉仔鸡生长实验和免疫器官指数实验评价表明，相比于空白组，本发明自微乳剂可以使42日龄肉仔鸡平均体重提高10%以上，胸腺、脾脏和法氏囊指数分别提高约5%、30%、11%以上，显著提高了动物的全身免疫水平。

附图说明

图1是黄芩提取物自微乳剂对大肠杆菌生长曲线的影响。

图2是黄芩水提物对大肠杆菌生长曲线的影响。

图3是黄芩提取物自微乳剂对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响。

图4是黄芩水提物对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不是限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员在不脱离本发明原理和宗旨的情况下，针对这些实施例进行的各种变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例1。

在50g聚氧乙烯蓖麻油中加入10g司盘-80，4g吐温-20，搅拌混合均匀，再加入30g异丙醇，搅拌混合均匀，加入6g黄芩co2超临界提取物，搅拌混合至外观澄清透明，制备得到具有生物抑菌性的自微乳剂。

实施例2。

在30g聚氧乙烯蓖麻油中加入10g月桂酸异丙酯，15g肉豆蔻酸异丙酯，搅拌混合均匀，再加入6g司盘-80，2g吐温-20，2g吐温-60，搅拌混合均匀，再加入20g异丙醇，10g丙三醇，搅拌混合均匀，加入5g黄芩co2超临界提取物，搅拌混合至外观澄清透明，制备得到具有生物抑菌性的自微乳剂。

实施例3。

在14g聚氧乙烯蓖麻油中加入14g月桂酸异丙酯，搅拌混合均匀，再加入6g司盘-80，14g吐温-60，搅拌混合均匀，再加入20g异丙醇，20g丙三醇，10g乙二醇，搅拌混合均匀，加入2g黄芩co2超临界提取物，搅拌混合至外观澄清透明，制备得到具有生物抑菌性的自微乳剂。

实施例4。

在15g聚氧乙烯蓖麻油中加入22g肉豆蔻酸异丙酯，搅拌混合均匀，再加入15g司盘-80，15g吐温-20，10g吐温-60，搅拌混合均匀，再加入20g丙三醇，搅拌混合均匀，加入3g黄芩co2超临界提取物，搅拌混合至外观澄清透明，制备得到具有生物抑菌性的自微乳剂。

实施例5。

在10g聚氧乙烯蓖麻油中加入10g肉豆蔻酸异丙酯，搅拌混合均匀，再加入14g司盘-80，12g吐温-20，12g吐温-60，搅拌混合均匀，再加入20g丙三醇，20g乙二醇，搅拌混合均匀，加入3g黄芩co2超临界提取物，搅拌混合至外观澄清透明，制备得到具有生物抑菌性的自微乳剂。

实施例6。

在10g聚氧乙烯蓖麻油中加入10g肉豆蔻酸异丙酯，搅拌混合均匀，再加入14g司盘-80，12g吐温-20，12g吐温-60，搅拌混合均匀，再加入40g乙二醇，搅拌混合均匀，加入3g黄芩co2超临界提取物，搅拌混合至外观澄清透明，制备得到具有生物抑菌性的自微乳剂。

实施例7。

在20g聚氧乙烯蓖麻油中加入26g月桂酸异丙酯，搅拌混合均匀，再加入10g司盘-80，12g吐温-20，搅拌混合均匀，再加入20g异丙醇，10g乙二醇，搅拌混合均匀，加入2g黄芩co2超临界提取物，搅拌混合至外观澄清透明，制备得到具有生物抑菌性的自微乳剂。

应用例1。

将以上实施例1～7制备的黄芩提取物自微乳剂分别用水稀释50倍和500倍，使用malvern公司的nanozs动态光散射仪，采用动态光散射法测定稀释液的平均粒径，检测结果具体如表1所示。

从表1可以看出，各实施例自微乳剂在用水稀释后，粒径均在100nm以下，在微乳剂的粒径范围之内(10～100nm)，说明稀释后微乳剂仍呈均匀分散，且外观近似于透明或微透明液。

应用例2。

采用滤纸片法测定实施例1～7制备的黄芩提取物自微乳剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径，考察黄芩提取物自微乳剂的抑菌活性。

固体培养基制备：称取蛋白胨1.0g，牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g，琼脂粉2.0g左右，加水加热溶解，定容至100ml，以10%naoh溶液调节ph值至=7.2～7.4，过滤，分装至三角瓶内，放置于121℃、120pa高压蒸汽锅中，灭菌20min后备用。

液体培养基制备：除不加琼脂粉，其他制作方法同固体培养基。

菌种活化：在无菌操作台上，将菌种接种到斜面培养基上，放置至培养箱中，37℃斜面培养18～24h。

菌悬液制备：选取菌种活化培养好的典型菌落，接种至灭菌过的液体培养基中，放置于37℃培养箱中培养24h，以无菌生理盐水稀释至10⁶cfu/ml备用。

无菌环境下，将灭菌好的固体培养基倒入干热灭菌好的培养皿中，培养基厚度不超过培养皿的2/3，待培养基凝固后，用移液枪分别吸取200µl大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌悬液至培养基上，做好标记，用涂布棒涂抹均匀。

分别将灭菌的滤纸片放入实施例1～7制备的黄芩提取物自微乳剂中浸泡20min，取出渗有自微乳剂的滤纸片，紧密贴在固体培养基上。并以空白自微乳剂做对照。

将培养基放置到37℃培养箱培养24h，观测抑菌效果，测定抑菌圈直径，每个样品重复3次。测定结果见表2。

从表2可以看出，实施例1～7制备的黄芩提取物自微乳剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有较好的抑菌作用。黄芩co2超临界提取物的浓度越高，抑菌圈直径越大，抑菌力越强。

应用例3。

按照常规方法制备黄芩水提物：取黄芩药材粉末，以水为溶剂，料液比1:10，回流提取3h，过滤，将滤液减压浓缩，干燥，得到棕色黄芩水提物。

分别使用上述黄芩水提物和实施例1的黄芩提取物自微乳剂进行最低抑菌浓度性能测定。

以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为供试菌，并配置菌悬液。

配制与供试菌菌种对应的液体培养基，分别取100ml装入3个250ml锥形瓶中，标记为1、2、3号，121℃高压灭菌20min，冷却后，接种入1ml适宜浓度(10⁵cfu/ml)的菌悬液。

向1、2号锥形瓶中分别加入适量黄芩提取物自微乳剂或者加入黄芩水提物溶液，使其终浓度达到1×mic和1/2×mic，以3号正常菌株为对照。

将锥形瓶置于37℃下，150r/min摇床培养24h，期间每隔2h在无菌条件下取样，在600nm波长处测定并记录吸光度od值，重复3次。以时间为横坐标，od平均值为纵坐标，绘制供试菌的生长曲线，具体生长曲线结果见图1～4。

从图1～4可以看出，黄芩提取物自微乳剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有很强的抑制作用，对大肠杆菌的mic值可达0.375mg/ml，对金黄色葡萄球菌的mic值可达0.187mg/ml。而黄芩水提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的mic值仅分别为20mg/ml和3mg/ml。

因此，黄芩提取物自微乳剂对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用和抑菌效果明显强于黄芩水提物。对大肠杆菌的最低抑菌浓度仅为传统黄芩水提取物（主要成分黄芩苷和汉黄芩苷）浓度的1/53；对金黄葡萄球菌的最低抑菌浓度仅为传统黄芩水提取物浓度的1/16。

应用例4。

以白羽肉鸡作为实验对象，考察在肉鸡饲喂水中添加少量实施例1～4制备的黄芩提取物自微乳剂饲喂后的生长实验和全身免疫评价结果。

选择1日龄健康、体重接近的白羽肉鸡350羽，随机分成空白组、4个黄芩提取物自微乳剂实验组(实验1组、实验2组、实验3组、实验4组)，黄芩提取物自微乳剂对照组(对照1组)和黄芩水提物对照组(对照2组)7组，每组50个重复。

空白组正常饲喂不含抗生素基础日粮，并给予自来水饮水。

4个黄芩提取物自微乳剂实验组分别在正常饲喂不含抗生素基础日粮的基础上，以各自的自微乳剂稀释200倍后，进行饮水喂饲。

黄芩提取物自微乳剂对照组按照含黄芩co2超临界提取物0.03%的用量，将实施例1黄芩提取物自微乳剂掺杂在不含抗生素基础日粮中进行饲喂，并给予自来水饮水。

黄芩水提物对照组在正常饲喂不含抗生素基础日粮的基础上，以黄芩水提物含量为0.03%的水进行喂饲。

饲养期42天。饲喂结束后，与空白组对比，评价黄芩提取物自微乳剂不同饲喂方式和黄芩水提物对白羽肉鸡的生长及免疫器官指数的影响情况，具体比较结果见表3。

增重率=(实验组或对照组平均体重-空白组平均体重)/(空白组平均体重)×100%。

胸腺、脾脏和法氏囊指数增加率=(实验组或对照组平均指数-空白组平均指数)/(空白组平均指数)×100%。

表3结果显示，与空白组比较，将本发明自微乳剂添加在饮用水中进行饲喂，可以使42日龄肉仔鸡的平均体重提高10%以上，最大提高接近20%；42日龄肉仔鸡的胸腺、脾脏和法氏囊指数分别提高5%、30%、11%以上，显著提高了动物的全身免疫水平。

而将同样的自微乳剂掺混在基础日粮中直接饲喂，虽然也能提高肉仔鸡的体重和免疫器官指数，但与同样浓度的饮用水添加方式比较，效果明显变差，说明将自微乳剂掺混在基础日粮中的饲喂方式，肉仔鸡对药物的生物利用度不如饮水方式好。

同时，以黄芩水提物添加在饮用水中进行饲喂，肉仔鸡的体重和免疫器官指数与空白组基本相同，说明黄芩水提物的生物利用度较低，且与相同浓度的自微乳剂相比，差异性显著。

畜禽的平均日增重是反映添加剂有效性的重要指标。上述实验结果表明，在肉仔鸡饲喂水中添加少量的黄芩提取物自微乳剂，可以显著提高肉仔鸡的平均日增重，大大提高养鸡的经济效益。

动物免疫器官的发育状况及机能强弱直接决定着禽类全身免疫水平，即免疫器官的质量可用于评价雏鸡的免疫状态。黄芩提取物自微乳剂可以提高肉仔鸡的胸腺、脾脏和法氏囊指数，大大提高动物的全身免疫水平。本发明黄芩提取物自微乳剂呈纳米级分散，有利于药物在体内吸收，再次验证了黄芩提取物自微乳剂中提取的黄芩素相比黄芩苷的生物利用度高很多。