1,6-己二醇在治疗血管生成过多造成的疾病方面的应用的制作方法

本发明属于医药技术领域，具体涉及1,6-己二醇在治疗血管生成过多造成的疾病方面的应用。

背景技术：

血管生成（angiogenesis）是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，主要包括：激活期血管基底膜降解；血管内皮细胞的激活、增殖、迁移；重建形成新的血管和血管网，是一个涉及多种细胞多种分子的复杂过程，其中内皮细胞是血管生成过程中的核心因素。通常认为内皮细胞的增值是血管生成出芽的一个共同特征，毛细血管网的形成主要通过内皮细胞的迁移。在分子水平上，血管形成是促血管形成因子和抑制因子协调作用的复杂过程，正常情况下二者处于平衡状态。一些基本状态下可以打破这一平衡，造成血管生成相关性疾病的发生，如自身免疫性疾病、糖尿病视网膜病、老年性黄斑病变、关节炎、银屑病、子宫肌瘤、前列腺肥大等。因此，以血管生成为靶点可以对这些疾病进行治疗，目前，临床上以血管生成为靶点的治疗在一些疾病如眼科疾病、肿瘤等中已经取得了较好疗效。然而，目前临床上广泛使用的药物多作用靶点单一、价格昂贵、存在不同程度的毒副作用，如过敏、心肝肾等重要脏器毒性等。因此，寻找新的有效且廉价的抗血管生成药物，对这些疾病的患者将会带来更多的福音。

液相分离是指液体通过某种机理可以分离成两种不同成份互不混溶的液相的现象。根据目前的研究认为，液相分离参与了细胞内信号通路的转导、细胞内无膜结构的形成。近年来发现，液相分离也参与了基因的转录调控。所以，液相分离可以确保体内某些生物学过程高效有序地进行。液相分离结束后，可以使细胞在一些特定部位形成新的结构，介导一些特定反应的进行，如信号通路传递、胞核物质传递、基因转录等。细胞内的液相分离一般由一些特殊蛋白质来介导，蛋白质间通过弱相互作用来实现这一过程。由一些特定蛋白质介导正常的液相分离可以维持适度的血管生成，液相分离可以有效地维持血管生成。1,6-己二醇为无色结晶固体，是一种重要的化工原料，是多种有机合成的重要原料之一。本发明从1,6-己二醇抑制液相分离方向，探索1,6-己二醇在治疗血管生成过多造成的疾病的应用。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在问题或不足，本发明提供1,6-己二醇在制备用于治疗血管生成过多造成的相关疾病的药物方面的应用、一种治疗血管生成过多造成的相关疾病的药物及1,6-己二醇在治疗血管生成过多造成的相关疾病方面的应用，

为实现上述发明目的，本发明的实施例提供1,6-己二醇在制备用于治疗血管生成过多造成的相关疾病的药物方面的应用。

进一步的，所述血管生成过多造成的相关疾病包括糖尿病视网膜病、老年性黄斑病变、关节炎、银屑病。

进一步的，所述药物中的1,6-己二醇抑制体内外血管生成，抑制内皮细胞成管和迁移，治疗血管生成过多造成的相关疾病。

本发明的实施例还提供一种治疗血管生成过多造成的相关疾病的药物，其特征在于，所述药物中至少含有1,6-己二醇和一种或多种药学上可接受的载体。

进一步的，所述载体包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、促进吸收剂、表面活性剂和增效剂。

本发明的实施例另外还提供1,6-己二醇在治疗血管生成过多造成的相关疾病方面的应用，其特征在于，其特征在于，包括以下过程：

s1、1,6-己二醇溶液、heparin的配置和matrigel的分装

s1-1、1,6-己二醇粉末溶解于无菌水中，储存浓度为1g/ml，至于4℃避光保存；

s1-2、heparin用无菌水溶解，储存浓度为25ku/ml，置于-20℃保存；

s1-3、将matrigel在冰盒上操作分装，1ml/管，置于-80℃冰箱保存；

s2、细胞培养

huvecs细胞在培养基ecm中培养，每3-4天进行一次传代；

s3、成管实验

s3-1、将步骤s2培养的huvecs种入六孔板中，待细胞贴壁后使用无血清的ecm饥饿过夜，再分别用不同浓度1:2000、1:1000、1:500、1:300、1:100、1:50的1,6-己二醇在ecm中处理24个小时；

s3-2、将融化的matrigel铺入96孔板中，放置培养箱孵育30分钟，待其凝固；

s3-3、将6孔板中的细胞消化下来，种入96孔板中，放入培养箱孵育6小时后拍照观察；

s4、损伤-愈合实验

s4-1、huvecs细胞种入6孔板中，加入不同浓度1:500、1:300、1:100的1,6-己二醇处理过夜；

s4-2、细胞长满后，用枪头进行划痕，共划3道；

s4-3、用pbs洗细胞3次，去除漂浮的细胞，继续培养24小时；分别于0、12、24小时取样，拍照；

s4-4、每个样品取6个视野尺寸，并统计数据；

s5、基质胶实验

s5-1、将matrigel置于4℃过夜融化，以30u/ml加入heperin混匀，加入浓度为1：50的1,6-己二醇作为实验组，不加1,6-己二醇的作为对照组，置于冰上；

s5-2、将两组分别注入同一只c57b/l6小鼠左右腹部皮下，左侧注入对照组，右侧注入实验组；

s5-3、正常饲养，于第五天取出基质胶比较血管生成情况；

s6、角膜微口袋实验

s6-1、用matrigel制作含有1，6-己二醇或不含有1，6-己二醇的两种微丸；

s6-2、将c57b/l6小鼠麻醉，置于解剖显微镜下进行显微手术操作，用30°显微刀在小鼠的左眼和右眼角膜缘处开一切口，切口距离角膜缘1毫米，切口长度为1-2毫米；

s6-3、用vongraef刀做一个垂直于切口的口袋；

s6-4、将刀滑入切口处的角膜层下，轻轻插刀，沿切口移动，扩大切口空间，从而形成口袋；

s6-5、用镊子取含有1，6-己二醇或不含有1，6-己二醇的两种微丸，并分别将含有1，6-己二醇或不含有1，6-己二醇的两种微丸放入右眼或左眼微口袋中，再用vongraef刀将药丸插入口袋，将其推入角膜层下；

s6-6、在眼睛上涂三层抗菌素药膏；

s6-7、正常饲养，手术后第6天，将小鼠麻醉，在裂隙灯显微镜下进行拍照，观察角膜血管生成情况。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

（1）本发明提供一种工业用原料1,6-己二醇在医药方面中的用途；1,6-己二醇具有强烈的抑制血管生成的作用，可以治疗血管生成相关的疾病，如糖尿病视网膜病、老年性黄斑病变、关节炎、银屑病等，为治疗血管生成相关的疾病提供了新的药物方向及治疗靶点。此外，1,6-己二醇是一种工业原料，价格低廉，因此，可大幅减轻社会和患者的医疗负担，具有良好的应用前景。

（2）本发明的实施例中通过成管实验验证了1,6-己二醇能够显著抑制huvecs的成管，并且这种抑制作用随着1,6-己二醇浓度的升高呈现逐渐增强的趋势；通过损伤愈合实验验证了1,6-己二醇能够抑制内皮细胞的迁移；通过基质胶实验验证了1,6-己二醇显著抑制了基质胶中的血管生成；通过角膜微口袋实验验证了1,6-己二醇明显抑制了小鼠角膜微口袋手术后角膜中的血管生成；从以上实验验证1,6-己二醇能够抑制血管生成的作用，可以治疗血管生成相关的疾病。

附图说明

图1为本发明的实施例中内皮细胞成管实验中对照组、浓度为1:2000、浓度为1:1000、浓度为1:500、浓度为1:300、浓度为1:100、浓度为1:50的1,6-己二醇实验组抑制血管内皮细胞huvecs的成管能力图。

图2为本发明的实施例中损伤-愈合实验中对照组、浓度为1:500、浓度为1:300、浓度为1:100的1,6-己二醇组在0、12、24小时抑制huvecs细胞的迁移能力图。

图3为本发明的实施例中小鼠角膜微口袋实验的实验结果图。其中，左右分别为对照组和1，6-己二醇实验组抑制角膜血管生成的情况图。

图4为本发明的实施例中基质胶实验的中对照组和1，6-己二醇实验组的基质胶中血管生成的情况图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。

实施例1

一、实验材料

1,6-己二醇(1,6-hexanediol)（sigma），matrigel（bdbioscience），vegf（北京义翘神州），heparin（sigma），ecm&kit（sciencell），phosphatebuffferedsaline（1×）（hyclone），penicillin-streptomycinsolution（hyclone），胎牛血清（四季青）。

二、实验方法

1、1,6-己二醇溶液、heparin的配置和matrigel的分装

1,6-己二醇粉末溶解于无菌水中，储存浓度为1g/ml，至于4℃避光保存；heparin用无菌水溶解，储存浓度为25ku/ml，置于-20℃保存；将matrigel在冰盒上操作分装，1ml/管，置于-80℃冰箱保存。

2、细胞培养

huvecs细胞在特定的培养基ecm中培养，每3-4天进行一次传代。

3、成管实验（tubeformation）

将huvecs种入六孔板中，待细胞贴壁后使用无血清的ecm饥饿过夜，再分别用不同浓度1,6-己二醇（1:2000、1:1000、1:500、1:300、1:100、1:50）在ecm中处理24个小时，并以不加入1,6-己二醇作为对照组。然后将融化的matrigel铺入96孔板中，放置培养箱孵育30分钟，待其凝固。将6孔板中的细胞消化下来，按一定浓度种入96孔板中，放入培养箱孵育6小时后拍照观察。

4、损伤-愈合实验

huvecs细胞种入6孔板中，其中，分别加入不同浓度1,6-己二醇（1:500、1:300、1:100）处理过夜，并以不加入1,6-己二醇作为对照组处理过夜。细胞长满后，用枪头进行划痕，共划3道。用pbs洗细胞3次，去除漂浮的细胞，继续培养24小时。分别于0、12、24小时取样，拍照。每个样品取6个视野尺寸，并统计数据。

5、基质胶实验（matrigelplugassay）

将matrigel置于4度过夜融化，加入heperin（30u/ml）混匀，不加入或加入1,6-己二醇（1：50）作为对照组和1,6-己二醇实验组，置于冰上。将两组分别注入同一只小鼠（c57b/l6）左右腹部皮下，左侧为对照组，右侧为1,6-己二醇实验组。正常饲养，于第五天取出基质胶比较血管生成情况。

6、角膜微口袋实验

用matrigel制作含有1，6-己二醇或不含有1，6-己二醇的两种微丸；将c57b/l6小鼠麻醉，置于解剖显微镜下进行显微手术操作，用30°显微刀在小鼠的左眼和右眼角膜缘处开一切口，切口距离角膜缘1毫米，切口长度为1-2毫米；用vongraef刀做一个垂直于切口的口袋；将刀滑入切口处的角膜层下，轻轻插刀，沿切口移动，扩大切口空间，从而形成口袋；用镊子取含有1，6-己二醇或不含有1，6-己二醇的两种微丸，并分别将含有1，6-己二醇或不含有1，6-己二醇的两种微丸放入右眼（1,6-己二醇）或左眼微口袋中，再用vongraef刀将药丸插入口袋，将其推入角膜层下；在眼睛上涂三层抗菌素药膏；正常饲养，手术后第6天，将小鼠麻醉，在裂隙灯显微镜下进行拍照，观察角膜血管生成情况。

三、实验结果

成管实验的实验结果：1,6-己二醇显著抑制内皮细胞成管

液相分离可以确保体内生物学过程高效有序地进行，血管生成是一个多种蛋白、多种细胞参与的一个多步骤的复杂有序过程，目前研究还不够透彻。因此，本发明设想蛋白质介导的液相分离肯能参与调控了血管成管。由于血管生成与临床上多种疾病的发生密切相关，如心脑血管疾病、肿瘤、炎症等。而且液相分离的抑制剂——1,6-己二醇，是一种工业原理，价格低廉，如果可以转化的临床用药，将会为社会和患者减轻巨大医疗负担。为此，本发明首先检测了1,6-己二醇是否可以影响血管内皮细胞huvecs的成管能力。在huvecs中用不同弄得的1,6-己二醇进行处理，结果显示1,6-己二醇能够显著抑制huvecs的成管，并且这种抑制作用随着1,6-己二醇浓度的升高呈现逐渐增强的趋势（如图1所示）。这一结果提示1,6-己二醇可能在血管生成中发挥抑制作用。

损伤愈合实验的实验结果：1,6-己二醇抑制内皮细胞的迁移

为了进一步研究1,6-己二醇对内皮细胞的影响，本发明进行了损伤愈合实验。用不同浓度的1,6-己二醇处理huvecs细胞后，发现1,6-己二醇能够抑制内皮细胞的迁移（如图2所示），这一结果进一步支持1,6-己二醇抑制血管生成。

角膜微口袋实验的实验结果：1,6-己二醇抑制小鼠角膜中血管生成

以上体外实验说明1,6-己二醇抑制血管生成，体内情况还未知。于是，本发明用角膜微口袋手术模型，在小鼠中研究1,6-己二醇是否在体内也同样发挥了抑制作用。结果如图3所示，同一小鼠的左眼和右眼相比，1,6-己二醇明显抑制了小鼠角膜微口袋手术后角膜中的血管生成。

基质胶实验的实验结果：1,6-己二醇显著抑制病理性血管生成

matrigelplug实验是研究病理性血管生成的经典实验，所以，本发明又在小鼠中做了基质胶实验。同一小鼠的左右两测皮下基质胶相比较，结果1,6-己二醇显著抑制了基质胶中的血管生成（如图4所示）。这些结果提示1,6-己二醇在病理性血管生成中也发挥抑制作用。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。