一种可注射复合水凝胶及其制备方法和应用与流程

本发明涉及组织工程技术领域，涉及一种可注射复合水凝胶及其制备方法和应用，尤其涉及一种可注射t4溶菌酶/zn²⁺蛋白复合水凝胶。

背景技术：

以多孔支架材料来负载细胞和/或促骨生长因子是目前骨组织工程中研究热点之一，其中的高分子水凝胶具有高含水性(70～99％)和保水性的特点，其三维网状结构同细胞外基质非常相似，具有良好的生物相容性和生物降解性，在骨组织工程中具有很好的研究前景和应用潜能。可注射水凝胶在骨组织工程研究领域中已成为一种有效的可替代植入材料。可注射水凝胶通过注射方式在目标靶点原位固化，可填充任意不规则的骨缺损，实现微创治疗，减小对机体的创伤。

可注射水凝胶作为细胞、成骨诱导因子或药物载体也具有独特优势，一方面水凝胶的三维网状结构可以促进细胞在其表面的黏附和迁移，为三维细胞培养同时建立支架和信号基础；另一方面可通过构建特殊的水凝胶来包载成骨诱导因子或药物，延长其在局部的停留时间，避免爆炸式释放的发生。

现有可注射复合蛋白水凝胶一般是以蛋白大分子直接作为水凝胶主体，很少以蛋白分子作为体系交联剂来构建。以蛋白分子作为体系交联剂来构建的水凝胶的体系将能够发挥特定蛋白的作用，如t4溶菌酶，它具有结合金属离子的能力，便可赋于体系在组织工程中的应用。

cn104958783b公开了一种化学交联的天然多糖基可注射用水凝胶及其制备方法和在组织工程材料中，特别是眼结膜修复中的应用。该水凝胶由包含以下步骤的方法得到：将酰化天然多糖材料水溶液加入巯基化天然多糖材料水溶液中，混合均匀，加入β-甘油磷酸钠溶液调节ph至中性，37℃孵育，得到化学交联的天然多糖基可注射用水凝胶。该发明的水凝胶性能可控，可在人体生理条件下实现凝胶化，且无需添加其他化学交联剂，可应用作为组织工程材料，特别适用于眼结膜修复中，具有可注射性，且反应迅速、可在5～15min内凝胶化，原位成型、手术操作性强、手术过程中自动粘合，无需缝合固定，对任何形状、位置的创面都可有效的保护；但是采用该发明的交联剂固化时间长，机械强度差，而且需要较高浓度的β-甘油磷酸钠，当β-甘油磷酸钠超过一定值时，对机体有一定的毒性，例如浓度为800mg/ml的β-甘油磷酸钠溶液的渗透压约为1080mosm，远远高于人体细胞的正常渗透压。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可注射复合水凝胶及其制备方法和应用，本发明的可注射复合水凝胶的制备方法，通过点击化学反应迅速成型，可在生理条件下操作即可实现凝胶化，凝胶时间短，反应条件温和，凝胶性能可控；且在体系中引入t4溶菌酶，其具有络合金属离子的能力，如锌离子，因此本发明中的水凝胶也可实现镁、锌离子的缓释，丰富了体系在组织工程中尤其时骨组织工程中的应用。

本发明的目的之一在于提供一种可注射复合水凝胶的制备方法，为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一种可注射复合水凝胶的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

1)将天然多糖材料溶于中性或酸性溶液，制备天然多糖材料溶液；

2)将甘油磷酸盐溶于水或稀酸中，制备甘油磷酸盐溶液；

3)将四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶于pbs溶液中，制备四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶液；

4)将纯化的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白稀释于缓冲液中，制备t4溶菌酶/zn²⁺蛋白溶液；

5)将步骤1)、步骤2)、步骤3)和步骤4)制得的溶液混合均匀，孵育得到所述可注射复合水凝胶。

本发明的可注射复合水凝胶的制备方法，以天然多糖材料为反应原料，以甘油磷酸盐、四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯为交联剂，t4溶菌酶/zn²⁺蛋白富含大量氨基，在本发明中起到小分子交联剂的作用，可促进网络的进一步交联，通过点击化学反应，得到性能可控的化学交联的可注射复合水凝胶。本发明通过点击化学反应迅速成型，可在生理条件下操作即可实现凝胶化，凝胶时间短，反应条件温和，凝胶性能可控，且在体系中引入t4溶菌酶，其具有络合金属离子的能力，如锌离子，因此本发明中的水凝胶也可实现镁、锌离子的缓释，丰富了体系在组织工程中尤其时骨组织工程中的应用。

其中，需要说明的是，本发明所指的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白，是t4溶菌酶的双半胱氨酸突变体r125c/e128c与氯化锌溶液的混合液，相邻的三个t4溶菌酶上的三对半胱氨酸可在由四个氯离子稳定的金刚烷样结构中配位四个锌原子，进而组装成三聚体复合物。

步骤1)中，所述天然多糖材料溶液的浓度为10-200mg/ml，例如所述天然多糖材料溶液的浓度为10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml、150mg/ml、160mg/ml、170mg/ml、180mg/ml、190mg/ml或200mg/ml等。

优选地，所述天然多糖材料溶液的浓度为40-100mg/ml，例如所述天然多糖材料溶液的浓度为40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、85mg/ml、90mg/ml、95mg/ml或100mg/ml等。

优选地，所述中性溶液可以为水，所述酸性溶液为盐酸溶液、醋酸溶液或pbs溶液，优选地，所述酸性溶液的浓度为0.1mol/l。

优选地，所述天然多糖材料为甲壳素、壳聚糖、壳寡糖和明胶中的任意一种或至少两种的混合物，优选为甲壳素和/或壳寡糖。

步骤2)中，所述甘油磷酸盐溶液的浓度为50-800mg/ml，例如甘油磷酸盐溶液的浓度为50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml、500mg/ml、600mg/ml、700mg/ml或800mg/ml等，优选为100-600mg/ml，例如优选为100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml、250mg/ml、300mg/ml、350mg/ml、400mg/ml、450mg/ml、500mg/ml、550mg/ml或600mg/ml等。

优选地，所述甘油磷酸盐为α-甘油磷酸钠、β-甘油磷酸钠和α-甘油磷酸镁中的任意一种或至少两种的混合物。本发明中利用溶菌酶蛋白和锌离子特定结合的特性，通过溶菌酶/zn²⁺实现了锌离子以化学结合形式引入到水凝胶网络中，进而达到缓释锌离子的目的；其次水凝胶中α-甘油磷酸镁也在促进构建水凝胶的同时引入了镁离子，本发明可实现锌、镁离子的协同释放。

优选地，所述稀酸为0.2mol/l的盐酸溶液。

步骤3)中，所述四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶液的浓度为5-500mg/ml，优选为100-200mg/ml；例如四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶液的浓度为5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml、400mg/ml或500mg/ml等；优选为100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml、150mg/ml、160mg/ml、170mg/ml、180mg/ml、190mg/ml或200mg/ml等。

t4溶菌酶双半光氨酸突变体的设计一方面使得溶菌酶蛋白表面引入了金属结合位点，更容易结合并携带促骨再生的锌离子混入材料，锌离子的释放是通过蛋白的降解实现，从而起到了缓释的效果；另一方面，锌离子的加入介导了其与t4溶菌酶形成三聚体新型多核锌硫簇，该三聚体的生成使得溶液中的溶菌酶发生有序聚集，进而从宏观上影响了该水凝胶的理化性质(成胶时间、力学性能等)，更满足材料的需求。

步骤4)中，所述t4溶菌酶/zn²⁺蛋白溶液的浓度为1-100mg/ml，优选为10-40mg/ml；例如t4溶菌酶/zn²⁺蛋白溶液的浓度为1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml等；优选为10mg/ml、15mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml或40mg/ml等。

步骤5)中，所述天然多糖材料溶液、所述甘油磷酸盐溶液、所述四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶液和所述t4溶菌酶/zn²⁺蛋白溶液的体积比为24:1:1:1-5:1:1:1，例如体积比为24:1:1:1、23:1:1:1、22:1:1:1、21:1:1:1、20:1:1:1、19:1:1:1、18:1:1:1、17:1:1:1、16:1:1:1、15:1:1:1、14:1:1:1、13:1:1:1、12:1:1:1、11:1:1:1、10:1:1:1、9:1:1:1、8:1:1:1、7:1:1:1、6:1:1:1或5:1:1:1等，优选为9:1:1:1～6:1:1:1。

步骤5)中，所述孵育的时间为60s～30min，例如孵育的时间为60s、1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min或30min等；所述孵育的温度为35-40℃，例如孵育的温度为35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃等；所述孵育在恒温培养箱中进行。

作为本发明的优选方案，所述可注射复合水凝胶的制备方法包括如下步骤：

1)将天然多糖材料溶于中性或酸性溶液，制备浓度为10-200mg/ml的天然多糖材料溶液，4℃下保存备用；

2)将甘油磷酸盐溶于0.2mol/l的盐酸溶液中，并用1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph至中性，制备浓度为50-800mg/ml的甘油磷酸盐溶液，4℃下保存备用；

3)将四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶于pbs溶液中，制备浓度为5-500mg/ml的四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶液，现配现用；

4)将纯化的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白稀释于缓冲液中，制备浓度为1-100mg/ml的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白溶液，-20℃保存备用；

5)将步骤1)、步骤2)、步骤3)和步骤4)制得的溶液按体积比为24:1:1:1-5:1:1:1混合均匀，在恒温培养箱中37℃孵育60s-30min，得到所述可注射复合水凝胶。

本发明的制备方法，以天然多糖材料为反应原料，以甘油磷酸盐、四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯为交联剂，t4溶菌酶/zn²⁺蛋白富含大量氨基，在本发明中起到小分子交联剂的作用，可促进网络的进一步交联，通过点击化学反应，通过控制不同的溶液浓度来控制水凝胶的成胶时间、溶胀率、降解速率，得到性能可控的可注射复合水凝胶，且在体系中引入t4溶菌酶，其具有络合金属离子的能力，如锌离子，因此本发明中的水凝胶也可实现镁、锌离子的缓释，丰富了体系在组织工程中尤其时骨组织工程中的应用。

本发明的目的之二在于提供一种目的之一所述的制备方法得到的可注射复合水凝胶。

本发明的目的之三在于提供一种目的之二所述的可注射复合水凝胶的应用，将所述可注射复合水凝胶用于组织工程材料。

本发明的可注射复合水凝胶，具有三维孔洞结构，有利于细胞的迁移、药物或生长因子的负载和释放，可作为锌离子、镁离子的可控释放的载体，能够解决现有可注射水凝胶的生物相容性差的问题；该可注射复合水凝胶可含有种子细胞、药物或生长因子等，可用作组织工程材料，尤其是骨缺损中空洞局部填充支架材料。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的可注射复合水凝胶的制备方法，通过点击化学反应迅速成型，可在生理条件下操作即可实现凝胶化，凝胶时间短，反应条件温和，凝胶性能可控。

本发明的制备方法制得的可注射复合水凝胶，具有更好的力学稳定性和生物相容性，可维持h-bmsc细胞的形态；该水凝胶具有可注射性，反应迅速，可在1～5min内固化成型。

本发明的制备方法制得的可注射复合水凝胶，具有三维孔洞结构，有利于细胞的迁移、药物或生长因子的负载和释放手术操作性强、手术过程中自动粘合，可适用于任意形状的缺损，能够促进小鼠胚胎成骨细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的生长。

本发明制备的可注射复合水凝胶可应用于组织工程材料，尤其适用于骨缺损的局部空洞填充材料。

附图说明

图1为本发明中实施例7中所制备的水凝胶sem图；

图2为本发明中实施例7中的所制备的水凝胶流变图谱；

图3为本发明中实施例7中的所制备的水凝胶对培养2天的h-bmsc细胞活性的影响；

图4为本发明中实施例7中的所制备的水凝胶对培养7天的h-bmsc细胞活性的影响；图5为本发明中实施例7中的所制备的水凝胶中镁离子释放特性的研究；

图6为本发明中实施例7中的所制备的水凝胶中锌离子释放特性的研究；

图7为本发明中实施例7中的所制备的水凝胶对h-bmsc的成骨相关基因表达的影响。

具体实施方式

下面结合附图1-7，并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

如无具体说明，本发明的各种原料均可市售购得，或根据本领域的常规方法制备得到。

实施例1

本实施例的可注射复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)称取壳寡糖溶于pbs溶液中，于室温下搅拌0.5h，配置成浓度为40mg/ml的溶液，4℃下保存备用；

2)称取β-甘油磷酸钠溶于水中，充分溶解，配置成浓度为50mg/ml的溶液，4℃下保存备用；

3)称取四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶于pbs溶液中，充分溶解，配置成浓度为5mg/ml的溶液，现配现用；

4)将纯化的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白稀释于缓冲液中，制备浓度为1mg/ml的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白溶液，-20℃保存备用；

5)将步骤1)、步骤2)、步骤3)和步骤4)的溶液按照体积比为6:1:1:1混合均匀，于37℃的恒温培养箱中孵，育孵育时间30min，使其凝胶化，得到可注射复合水凝胶。

实施例2

本实施例的可注射复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)称取壳寡糖溶于pbs溶液中，于室温下搅拌1h，配置成浓度为85mg/ml的溶液，4℃下保存备用；

2)称取β-甘油磷酸钠溶于水中，充分溶解，配置成浓度为500mg/ml的溶液，4℃下保存备用；

3)称取四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶于pbs溶液中，充分溶解，配置成浓度为100mg/ml的溶液，现配现用；

4)将纯化的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白稀释于缓冲液中，制备浓度为10mg/ml的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白溶液，-20℃保存备用；

5)将上述步骤1)、步骤2)、步骤3)和步骤4)的溶液按照体积比为9:1:1:1混合均匀，于37℃的恒温培养箱中孵，育孵育时间30min，使其凝胶化，得到可注射复合水凝胶。

实施例3

本实施例的可注射复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)称取壳寡糖溶于pbs溶液中，于室温下搅拌2h，配置成浓度为100mg/ml的溶液，4℃下保存备用；

2)称取β-甘油磷酸钠溶于水中，充分溶解，配置成浓度为800mg/ml的溶液，4℃下保存备用；

3)称取四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶于pbs溶液中，充分溶解，配置成浓度为200mg/ml的溶液，现配现用；

4)将纯化的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白稀释于缓冲液中，制备浓度为20mg/ml的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白溶液，-20℃保存备用；

5)将上述步骤1)、步骤2)、步骤3)和步骤4)的溶液按照体积比为8:1:1:1混合均匀，于37℃的恒温培养箱中孵，育孵育时间30min，使其凝胶化，得到可注射复合水凝胶。

实施例4

本实施例的可注射复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)称取壳寡糖溶于pbs溶液中，于室温下搅拌2h，配置成浓度为100mg/ml的溶液，4℃下保存备用；

2)称取β-甘油磷酸钠溶于水中，充分溶解，配置成浓度为800mg/ml的溶液，4℃下保存备用；

3)称取四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶于pbs溶液中，充分溶解，配置成浓度为200mg/ml的溶液，现配现用；

4)将纯化的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白稀释于缓冲液中，制备浓度为20mg/ml的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白溶液，-20℃保存备用；

5)将上述步骤1)、步骤2)、步骤3)和步骤4)的溶液按照体积比为9:1:1:1混合均匀，于37℃的恒温培养箱中孵，育孵育时间1min，使其凝胶化，得到可注射复合水凝胶。

实施例5

本实施例的可注射复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)称取壳寡糖溶于pbs溶液中，于室温下搅拌0.5h，配置成浓度为85mg/ml的溶液，4℃下保存备用；

2)称取α-甘油磷酸镁溶于水中，充分溶解，配置成浓度为500mg/ml的溶液，4℃下保存备用；

3)称取四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶于pbs溶液中，充分溶解，配置成浓度为100mg/ml的溶液，现配现用；

4)将纯化的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白稀释于缓冲液中，制备浓度为50mg/ml的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白溶液，-20℃保存备用；

5)将上述步骤1)、步骤2、步骤3)和步骤4)的溶液按照体积比为9:1:1:1混合均匀，于37℃的恒温培养箱中孵，育孵育时间30min，使其凝胶化。

实施例6

本实施例的可注射复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)称取壳寡糖溶于pbs溶液中，于室温下搅拌2h，配置成浓度为85mg/ml的溶液，4℃下保存备用；

2)称取α-甘油磷酸镁溶于水中，充分溶解，配置成浓度为500mg/ml的溶液，4℃下保存备用；

3)称取四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶于pbs溶液中，充分溶解，配置成浓度为150mg/ml的溶液，现配现用；

4)将纯化的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白稀释于缓冲液中，制备浓度为100mg/ml的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白溶液，-20℃保存备用；

5)将上述步骤1)、步骤2)、步骤3)和步骤4)的溶液按照体积比为9:1:1:1混合均匀，于37℃的恒温培养箱中孵，育孵育时间30min，使其凝胶化，得到可注射复合水凝胶。

实施例7

本实施例的可注射复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)称取壳寡糖溶于pbs溶液中，于室温下搅拌2h，配置成浓度为85mg/ml的溶液，4℃下保存备用；

2)称取α-甘油磷酸镁溶于水中，充分溶解，配置成浓度为500mg/ml的溶液，4℃下保存备用；

3)称取四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶于pbs溶液中，充分溶解，配置成浓度为200mg/ml的溶液，现配现用；

4)将纯化的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白稀释于缓冲液中，制备浓度为20mg/ml的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白溶液，-20℃保存备用；

5)将上述步骤1)、步骤2)、步骤3)和步骤4)的溶液按照体积比为9:1:1:1混合均匀，于37℃的恒温培养箱中孵，育孵育时间30min，使其凝胶化，得到可注射复合水凝胶。

实施例8

本实施例与实施例7的区别之处在于，壳寡糖溶液的浓度为5mg/ml，其他的与实施例7的均相同。

实施例9

本实施例与实施例7的区别之处在于，壳寡糖溶液的浓度为400mg/ml，其他的与实施例7的均相同。

实施例10

本实施例与实施例7的区别之处在于，α-甘油磷酸镁溶液的浓度为10mg/ml，其他的与实施例7的均相同。

实施例11

本实施例与实施例7的区别之处在于，α-甘油磷酸镁溶液的浓度为900mg/ml，其他的与实施例7的均相同。

实施例12

本实施例与实施例7的区别之处在于，四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶液的浓度为1mg/ml，其他的与实施例7的均相同。

实施例13

本实施例与实施例7的区别之处在于，四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶液的浓度为800mg/ml，其他的与实施例7的均相同。

实施例14

本实施例与实施例7的区别之处在于，t4溶菌酶/zn²⁺蛋白溶液为30mg/ml，其他的与实施例7的均相同。

实施例15

本实施例与实施例7的区别之处在于，壳寡糖溶液、α-甘油磷酸镁溶液、四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶液和t4溶菌酶/zn²⁺蛋白溶液的体积比为30:1:1:1，其他的与实施例7的均相同。

实施例16

本实施例与实施例7的区别之处在于，壳寡糖溶液、α-甘油磷酸镁溶液、四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶液和t4溶菌酶/zn²⁺蛋白溶液的体积比为1:1:1:1，其他的与实施例7的均相同。

实施例17

本实施例与实施例7的区别之处在于，将壳寡糖替换为甲壳素，其他的与实施例7的均相同。

对比例1

本对比例与实施例7的区别之处在于，交联剂仅采用了α-甘油磷酸镁，未采用四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯，壳寡糖溶液、α-甘油磷酸镁溶液体积比为9:2，其他的与实施例7的均相同。

对比例2

本对比例与实施例7的区别之处在于，交联剂仅采用了四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯，未采用α-甘油磷酸镁，可壳寡糖溶液、四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶液体积比为9:2，其他的与实施例7的均相同。

对比例3

本对比例与实施例7的区别之处在于，交联剂替换为α-甘油磷酸钠，其他的与实施例7的均相同。对比例4

本对比例与实施例7的区别之处在于，交联剂替换为四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酯，其他的与实施例7的均相同。

对比例5

本对比例与实施例7的区别之处在于，未添加t4溶菌酶/zn²⁺蛋白，其他的与实施例7的均相同。

实施例7所制备的可注射复合水凝胶的sem图如图1所示，由图1可以看出，本发明中制备的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白复合水凝胶具有致密的三位网络结构，且孔径分布均匀，其孔径大小约为100μm。

实施例7所制备的可注射复合水凝胶的流变图谱如图2所示，由图2可以看出，本发明中制备的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白复合水凝胶具有良好的粘弹性，其g’储能模量能达到7800pa，损耗模量g”和储能模量g’值比约为0.007，表明水凝胶具有良好的刚性。

实施例7所制备的可注射复合水凝胶对h-bmsc细胞活性的影响如图3、图4所示，其中，图3为培养h-bmsc细胞2天，图4为培养h-bmsc细胞7天，由图3可以看出，本发明中制备的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白复合水凝胶可以维持h-bmsc细胞的良好形态；由图4可以看出，在h-bmsc细胞培养第七天时，h-bmsc细胞开始呈现纺锤形态，说明该水凝胶体系一定程度上可促进h-bmsc的增殖。

实施例7所制备的可注射复合水凝胶中镁离子释放特性的研究如图5所示。由图5可以看出，本发明中制备的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白复合水凝胶由于甘油磷酸镁的引入可以实现对镁离子的缓慢释放，在前7天由于水凝胶的吸水膨胀呈现快速释放，释放周期可维持21天，累积释放率在40天达约50％。

实施例7所制备的可注射复合水凝胶中锌离子释放特性的研究如图6所示。本发明中制备的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白复合水凝胶由于t4溶菌酶的引入赋于水凝胶络合锌离子的能力，进而可实现对锌离子的缓慢释放。t4溶菌酶/zn²⁺蛋白以化学键的形式稳定与水凝胶网络中，因此锌离子的释放需要更久的时间。由图6可以看出，锌离子从第四天开始释放，此后呈现缓慢释放趋势，释放周期可维持36天，累积释放率在40天达约60％。

实施例7所制备的可注射复合水凝胶对h-bmsc细胞成骨分化的研究如图7所示，将本发明实施例7所制备的可注射复合水凝胶加入h-bmsc细胞培养基中作为实验组，以不添加本发明制备的水凝胶的h-bmsc细胞培养基作为阴性对照组，其中，图7中每个图中的左侧条形图代表阴性对照组数据，右侧条形图代表本发明的添加水凝胶的实验组数据。由图7可以看出，与不添加水凝胶的阴性对照组相比，本发明中制备的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白复合水凝胶可以促进成骨相关因子的表达，包括alp，col-1，runx2和opn。这是由于本发明中的水凝胶可以缓释镁、锌离子，镁、锌离子都可以促进h-bmsc细胞向成骨细胞的分化。

实施例8若壳聚糖溶液的浓度太低，会使体系成胶时间太长，影响其固化过程；实施例9若壳聚糖溶液的浓度太高，会使预聚液粘度多大，不利于可注射性能的实现。

实施例10若α-甘油磷酸镁溶液的浓度太低，会使体系成胶时间太长，影响其固化过程；实施例11若α-甘油磷酸镁溶液的浓度太高，会使最终水凝胶的细胞毒性增大，不利于其生物应用的实施。

实施例12若四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶液的浓度太低，会使体系成胶时间太长，影响其固化过程；实施例13若四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶液的浓度太高，会使最终水凝胶的细胞毒性增大，不利于其生物应用的实施。

实施例14的t4溶菌酶/zn²⁺蛋白溶液的浓度太高，会使体系成胶时间减慢，且锌离子的浓度过高会使体系的细胞毒性增大。

实施例15、16壳寡糖溶液、α-甘油磷酸镁溶液、四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯溶液和t4溶菌酶/zn²⁺蛋白溶液的体积比太高或太低，会使成胶时间过短或过久，不利于操作。

实施例17的多糖替换为甲壳素，甲壳素的分子量要高于壳聚糖或壳寡糖，会使水凝胶机械强度增强。

对比例1的交联剂仅采用α-甘油磷酸镁，未采用四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯，会使体系成胶时间太长，且机械性能差。

对比例2的交联剂仅采用四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯，未采用α-甘油磷酸镁，会使体系成胶时间太长，且机械性能差。

对比例3、4的交联剂替换为α-甘油磷酸钠或四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酯，会使成胶时间加大，且细胞毒性增大。

对比例5未添加t4溶菌酶/zn²⁺蛋白，会使水凝胶交联不致密，机械性能差。

本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。