本发明涉及兽用疫苗的技术领域，尤其涉及一种用wsl细胞系制备非洲猪瘟病毒活疫苗的应用及其制备方法。
背景技术：
目前国内、国外非洲猪瘟病毒及其基因缺失病毒的体外增值培养以及基因缺失活疫苗的制备所用的细胞基本是原代猪肺泡巨噬细胞和猪骨髓细胞，原代猪肺泡巨噬细胞和猪骨髓细胞制备过程繁琐，操作特别麻烦，易造成细菌和外源病毒污染，特别是骨髓细胞在接毒前还需要多次加入刺激因子和换液，此方法成本高、操作繁琐、劳动强度大、易于污染、且批间差异大、不利于规模化大生产。也有报道用vero细胞培养非洲猪瘟病毒，但病毒适应性差，不稳定，毒价低。因此，有必要提供一种具有操作简单、不易染菌、工艺稳定、易于生产、病毒含量高、质量易控等优点，可显著提高疫苗产量和质量的非洲猪瘟病毒疫苗。
技术实现要素：
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用wsl细胞系制备非洲猪瘟病毒活疫苗的应用。
优选的，所述非洲猪瘟病毒为非洲猪瘟病毒基因缺失毒株sy18δmgf/cd2v。
本发明还提供了一种用wsl细胞系制备非洲猪瘟病毒活疫苗的方法，包括如下步骤：
(1)wsl细胞系的复苏和培养：取出冻存的wsl细胞系培养至细胞形成单层；
(2)制备毒种：取所述wsl细胞系加入含非洲猪瘟病毒的细胞维持液进行毒种培养，制得毒种；
(3)制备病毒液：取所述wsl细胞系加入含毒种的细胞维持液进行病毒液培养，制得病毒液；
(4)配制疫苗：在所述病毒液中加入疫苗保护剂和抗生素，进行冷冻真空干燥，即得成品非洲猪瘟病毒活疫苗。
优选的，所述含非洲猪瘟病毒的细胞维持液中非洲猪瘟病毒的体积百分比浓度为3％～5％，所述含非洲猪瘟病毒的细胞维持液的添加量为培养瓶体积的8～12％，每毫升所述毒种中病毒含量在107.0tcid50以上。
优选的，所述含毒种的细胞维持液中毒种的体积百分比浓度为3％～5％，所述含毒种的细胞维持液的添加量为培养瓶体积的8～12％，每毫升所述病毒液中病毒含量在106.5tcid50以上。
优选的，所述毒种培养和病毒液培养的条件独立的为：在36℃～37℃的温度下培养48～72h。
优选的，所述疫苗保护剂是按照明胶：蔗糖：水＝8～10g：40～45g：100ml的比例混合溶解灭菌制得，病毒液与疫苗保护剂混配的体积比为5～9:1，所述抗生素包括青霉素和/或链霉素，所述青霉素的添加量为100iu/ml，所述链霉素的添加量为100ug/ml。
优选的，所述非洲猪瘟病毒活疫苗每头份病毒含量不低于104.5tcid50。
本发明还提供了一种用wsl细胞系制备的非洲猪瘟病毒活疫苗。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)用细胞系替代原代猪肺泡巨噬细胞、猪骨髓细胞生产非洲猪瘟病毒活疫苗，细胞制备简单容易，细胞来源和制备过程中不易污染细菌、霉菌和支原体，可从源头控制外源污染的问题，保证生产出来疫苗的纯净性和安全性。
(2)采用细胞系培养的病毒液，产毒稳定、批间差异小、质量可控，制备出的疫苗效价均一稳定，确保疫苗的免疫效力，经免疫攻毒试验结果显示，可达到100％保护。
(3)用细胞系生产非洲猪瘟病毒活疫苗，具有生产工艺简单、易操作、产量大、成本低等特点，可以大规模生产，具有良好的经济效益和应用前景。
具体实施方式
本发明制备的非洲猪瘟病毒基因缺失毒株sy18δmgf/cd2v活疫苗安全性高、免疫保护好，对非洲猪瘟强毒攻击具有完全的免疫保护作用。
本发明提供一种用wsl细胞系制备非洲猪瘟病毒活疫苗的应用。
在本发明中，所述非洲猪瘟病毒优选为非洲猪瘟病毒基因缺失毒株sy18δmgf/cd2v，来源于中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所。
本发明还提供了一种用wsl细胞系制备非洲猪瘟病毒活疫苗的方法，包括如下步骤：
(1)wsl细胞系的复苏和培养：取出冻存的wsl细胞系培养至细胞形成单层；
(2)制备毒种：取所述wsl细胞系加入含非洲猪瘟病毒的细胞维持液进行毒种培养，制得毒种；
(3)制备病毒液：取所述wsl细胞系加入含毒种的细胞维持液进行病毒液培养，制得病毒液；
(4)配制疫苗：在所述病毒液中加入疫苗保护剂和抗生素，进行冷冻真空干燥，即得成品非洲猪瘟病毒活疫苗。
在本发明中，所述wsl细胞系为猪肺泡巨噬细胞，所述wsl细胞系购买自上海莼试生物技术有限公司。
wsl细胞系的复苏步骤为：从液氮中取出冻存的wsl细胞，迅速放入37℃的水浴中融化，得到细胞悬液，然后用细胞生长液将细胞悬液浓度优选稀释到40～60万个/ml，进一步优选为50万个/ml，然后分装于细胞培养瓶中，每瓶装量为培养瓶容积量的1/10，塞紧瓶口，置于温室中培养，待细胞单层形成后即可进行传代培养。
在本发明中，所述细胞生长液的配方优选为：含8～10％胎牛血清的rpmi-1640细胞培养液，再按照100iu/ml加入青霉素、100ug/ml加入链霉素，ph值优选为7.0～7.2，进一步优选为7.1。
在本发明中，所述细胞培养瓶的规格优选为1000ml培养瓶。
在本发明中，所述置于温室中培养的温度优选为36℃～37℃，时间优选为48～72h，进一步优选为72h。
wsl细胞系的培养：将上述长成单层的细胞经胰酶消化后，按照1:3的分种率分散到1000ml的细胞培养瓶中，在分种后的细胞培养瓶中加入100ml细胞生长液继续培养，形成单层细胞后即可用于接种病毒。
制备毒种：取所述wsl细胞系加入含非洲猪瘟病毒的细胞维持液进行毒种培养，制得毒种；
在本发明中，优选取上述形成单层细胞的wsl细胞系培养瓶，弃去培养瓶中的细胞生长液后，加入含非洲猪瘟病毒的细胞维持液进行毒种培养。
在本发明中，所述含非洲猪瘟病毒的细胞维持液中非洲猪瘟病毒的体积百分比浓度优选为3％～5％，进一步优选为3.5％；所述含非洲猪瘟病毒的细胞维持液的添加量优选为培养瓶体积的8～12％，进一步优选为10％。
在本发明中，所述细胞维持液的配方优选为：含3～5％胎牛血清的rpmi-1640细胞培养液，再加入青霉素100iu/ml、链霉素100ug/ml，ph值优选为7.2～7.4，进一步优选为7.3。
在本发明中，所述毒种培养的温度优选为36℃～37℃，所述毒种培养的时间优选为3天，即当病变细胞(cpe)达到75％以上时即可收获培养液作为毒种。
在本发明中，每毫升所述毒种中病毒含量优选在107.0tcid50以上。
取形成单层细胞的wsl细胞系培养瓶，弃去培养瓶中的细胞生长液后，加入含毒种的细胞维持液进行病毒液培养，制得病毒液；
在本发明中，含毒种的细胞维持液优选是在细胞维持液中加入毒种混合得到，所述含毒种的细胞维持液中毒种的体积百分比浓度优选为3～5％，进一步优选为3.5％。
在本发明中，所述含毒种的细胞维持液的添加量优选为培养瓶体积的8～12％，进一步优选为10％
在本发明中，所述病毒液培养的温度优选为36℃～37℃，所述病毒液培养的时间优选为3天，即当病变细胞(cpe)达到75％以上时即可收获培养液作为病毒液。
在本发明中，每毫升所述病毒液中病毒含量优选在106.5tcid50以上。
在本发明中，还优选将制备的病毒液置于-15℃以下保存。
制备疫苗保护剂：在本发明中，所述疫苗保护剂优选按照明胶：蔗糖：水＝8～10g：40～45g：100ml的比例混合溶解灭菌制得，进一步优选按照明胶：蔗糖：水＝8g：40g：100ml的比例混合溶解灭菌制得。
在本发明中，所述溶解优选采用加热溶解。
在本发明中，所述灭菌优选于高压锅中116℃灭菌30min。
配置疫苗：在所述病毒液中加入疫苗保护剂和抗生素，进行冷冻真空干燥，即得成品非洲猪瘟病毒活疫苗。
在本发明中，所述病毒液与疫苗保护剂混配的体积比优选为5～9:1，进一步优选为7:1。
在本发明中，所述抗生素优选包括青霉素、链霉素、阿米卡星注射液，进一步优选为青霉素、链霉素。
在本发明中，所述抗生素的添加量优选为各100～200iu(ug)/ml，进一步优选为100iu(ug)/ml。
在本发明中，所述冷冻真空干燥的条件优选为：预冻：时间4小时，当温度达到-40℃～-45℃时保持2小时；抽真空：时间0.5小时，板层温度-45℃，当真空度达到12pa时即可对冻干箱内产品进行加热；一期干燥(即升华干燥)：时间16小时，板层温度由-45℃加热到-5℃用时1小时，然后在此温度保持15小时，真空度在12pa；二期干燥(即解吸干燥)：时间6小时，板层温度由-5℃加热到+30℃用时2小时，此时产品温度为20℃，在此温度保持4小时后，真空度降到1pa以下时，冻干结束。
在本发明中，所述非洲猪瘟病毒活疫苗每头份病毒含量优选不低于104.5tcid50。
本发明还提供了一种用wsl细胞系制备的非洲猪瘟病毒活疫苗，优选按照上述方法制备得到。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1生产用细胞系的培养与鉴定
在本实施例中，用wsl细胞系制备非洲猪瘟病毒活疫苗，该wsl细胞系为猪肺泡巨噬细胞。
将购买自上海莼试生物技术有限公司的wsl细胞系从液氮中取出，迅速放入37℃的水浴中融化，得到细胞悬液，然后用细胞生长液将细胞悬液浓度稀释到50万个/ml，分装于容量为1000ml的细胞培养瓶中，每瓶装量为培养瓶容积量的1/10，即100ml，塞紧瓶口，置于温室中在37℃下培养72h，细胞单层形成，即得到复苏的wsl细胞。
将上述长成单层的wsl细胞系经胰酶消化后，按照1:3的分种率分散到1000ml的细胞培养瓶中，在分种后的细胞培养瓶中加入100ml的细胞生长液继续置于温室中在37℃下培养48h，再次形成单层细胞。
按照上述方法培养得到3批用于生产的wsl细胞系。
培养的wsl细胞应该具有形态良好、性状稳定、产毒高等特点。具体细胞标准为：
(1)细胞形态：将培养的wsl细胞接种于含10％胎牛血清的rpmi-1640细胞培养液中，置于37℃、5％co2的培养箱中培养观察，5h即可贴壁，48h可长成单层；显微镜下观察，贴壁细胞呈不规则形状。
(2)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，无细菌生长。
(3)支原体检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，无支原体生长。
(4)外源病毒检验：将形成单层的wsl细胞系至少取75cm2的单层，按现行《中国兽药典》附录进行检验，无外源病毒污染。
(5)胞核学检验：从基础细胞库和最高代次wsl细胞(40代)中，各取50个处于有丝分裂中的wsl细胞进行检查，基础细胞库中的wsl细胞存在的染色体标志，在最高代次wsl细胞中也存在，与基础细胞相比，最高代次wsl细胞的染色体模式数差异不超过15％，核型相同。
(6)致瘤性试验：对基础细胞库中wsl细胞和生产中所用最高代次wsl细胞进行检验。用无胸腺小鼠每组10只，各皮下注射107个被检细胞，作为试验组；同时用hela细胞作为阳性对照细胞，每只小鼠各皮下注射106个细胞；用二倍体细胞(wi-38细胞)作为阴性对照细胞。阳性对照组观察21日，出现明显的肿瘤，阴性对照组观察21日，无变化为阴性，试验组小鼠观察21日均无结节和肿瘤形成。同时对接种部位进行解剖和病理学检查，均无肿瘤形成。
本实施例中，所述hela细胞源自一位美国妇女海莉耶塔·拉克斯(henriettalacks)的子宫颈癌细胞的细胞系。
实施例2疫苗制备
用实施例1得到的3批wsl细胞系制备非洲猪瘟病毒活疫苗。
取形成良好单层的wsl细胞系的培养瓶，弃去细胞生长液，接种含有3.5％(体积百分比)非洲猪瘟病毒基因缺失毒株sy18δmgf/cd2v的细胞维持液100ml，置温室中于37℃下培养。当病变细胞(cpe)达到75％以上时(一般培养3天左右)即得毒种。
毒种鉴定：经鉴定毒种培养液完全符合非洲猪瘟病毒基因缺失活疫苗弱毒株毒种标准，对猪安全，毒种培养液中每毫升病毒含量≥107.5tcid50。且按现行《中国兽药典》附录进行检验，无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。
取形成良好单层的wsl细胞的培养瓶，弃去细胞生长液，加入含3.5ml毒种的细胞维持液100ml，置温室中于37℃下培养。当病变细胞(cpe)达到75％以上时(一般培养3天左右)即可收获培养液，作为病毒液。将收获的病毒液置-15℃以下保存。
病毒液的检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染，对猪安全。将病毒液用细胞维持液做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6三个稀释度，接种到已形成细胞单层的96孔细胞培养板中，每个稀释度接种上述相应的细胞6孔，每孔0.1ml，补充细胞维持液0.9ml，使之总量为1ml。观察细胞病变，计算tcid50。结果每毫升病毒含量≥107.0tcid50，符合要求。
疫苗保护剂的制备：在100ml注射用水中加入明胶8g、蔗糖40g，加热充分溶解后，于高压锅中116℃高压灭菌30分钟。
配苗、分装及冻干：将检验合格的病毒液，按病毒液7体积份加入保护剂1体积份和青霉素100iu/ml、链霉素100ug/ml的抗生素后，充分摇匀，定量分装，每头份病毒含量不低于104.5tcid50，分装后迅速进行冷冻真空干燥，即得成品疫苗。
其中，冷冻真空干燥的条件为：预冻：时间4小时，当温度达到-40℃～-45℃时保持2小时；抽真空：时间0.5小时，板层温度-45℃，当真空度达到12pa时即可对冻干箱内产品进行加热；一期干燥(即升华干燥)：时间16小时，板层温度由-45℃加热到-5℃用时1小时，然后在此温度保持15小时，真空度在12pa；二期干燥(即解吸干燥)：时间6小时，板层温度由-5℃加热到+30℃用时2小时，此时产品温度为20℃，在此温度保持4小时后，真空度降到1pa以下时，冻干结束。
按照上述方法制备得到3批非洲猪瘟病毒活疫苗，分别命名为wsl201901、wsl201902、wsl201903。
上述所用细胞生长液的配方是：90～92％rpmi-1640细胞培养液，再加入8～10％胎牛血清和青霉素100iu/ml、链霉素100ug/ml的抗菌素，ph值调整为7.0～7.2。
上述所用细胞维持液的配方是：95～97％rpmi-1640细胞培养液，再加入3～5％胎牛血清和青霉素100iu/ml、链霉素100ug/ml的抗菌素，ph值调整为7.2～7.4。
实施例3疫苗的检验
(1)性状淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
(2)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
(3)支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无支原体生长。
(4)外源病毒检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，无外源病毒污染。
(5)鉴别检验
病毒基因鉴定：按非洲猪瘟病毒p72基因实时pcr核酸检测法进行pcr扩增，扩增呈阳性；按mgf基因缺失型非洲猪瘟病毒检测法和cd2v基因缺失型非洲猪瘟病毒检测法，分别检测病毒mgf基因和cd2v基因，扩增出大小为1616bp和1791bp的条带(即mgf-mcherry、cd2v-egfp缺失性条带)；按mgf基因缺失和红色荧光蛋白基因插入的进一步鉴定和cd2v基因缺失和绿色荧光蛋白基因插入的进一步鉴定，分别检测病毒mgf和cd2v缺失和荧光蛋白插入基因，并分别扩增出大小为882bp和747bp的条带；按asfv强毒mgf基因检测和asfv强毒cd2v基因(mgf和cd2v的pcr鉴定)检测病毒基因，未出现任何条带。
荧光蛋白检查：将wsl201901批疫苗1瓶(含20头份)用细胞维持液3ml溶解，取0.2ml接种生长状态良好的bmdm细胞(骨髓巨噬细胞)，补加含10％胎牛血清的rpmi-1640细胞培养液5ml，同时设正常bmdm细胞对照，置37℃、5％co2培养箱中培养5日，分别在绿色和蓝色滤光片条件下进行荧光显微镜观察，分别观察到红色和绿色荧光。wsl201902和wsl201903批号的疫苗做同样的实验也同样观察到了红色和绿色荧光。证明疫苗抗原有红色荧光蛋白基因插入和绿色荧光蛋白基因插入。
(6)安全检验用无菌pbs液(0.01mol/l，ph值7.2～7.4)将3批疫苗分别稀释至10头份/ml，肌肉注射1月龄健康仔猪5头(非洲猪瘟病毒抗原和抗体均为阴性)，每头1.0ml(含10头份)。接种后每日上午测定体温1次，观察21日。检验结果表明3批疫苗接种仔猪后，均未出现红肿、硬块等局部反应，与对照组相比，仔猪精神状态和食欲均正常，无变化；无全身反应和体温升高，疫苗高度安全。
(7)效力检验将制备的3批疫苗分别进行病毒含量测定和免疫攻毒试验。
病毒含量测定：用无血清的rpmi-1640细胞培养液将疫苗稀释成1头份/ml，再做10倍系列稀释，取10-2、10-3、10-4和10-5四个稀释度，分别接种生长状态良好的bmdm细胞(接种前弃去96孔培养板上的生长液)，每个稀释度接种6孔，每孔0.1ml，补加含10％胎牛血清的rpmi-1640细胞培养液，每孔0.9ml，同时设正常细胞对照6孔。置37℃、含5％co2培养箱培养5日，在荧光显微镜下观察荧光度，计算tcid50，结果3批疫苗每头份病毒含量分别为104.75tcid50、105.0tcid50、105.0tcid50。
免疫攻毒：用无菌pbs液(0.01mol/l，ph值7.2～7.4)将疫苗稀释为1头份/ml。用1月龄健康仔猪10头(非洲猪瘟病毒抗原和抗体均为阴性)，随机分为2组，每组5头。第1组各颈部肌肉注射疫苗1头份，注射两次，间隔14日，第2组不免疫作为对照，同条件下隔离饲养。第二次免疫后14日，所有猪口服非洲猪瘟强毒sy18株(103.0tcid50/ml)1.0ml/头，观察28日。对照猪全部发病且5/5死亡，3批疫苗免疫猪全部保护，分别为5/5健活、5/5健活、5/5健活。
(8)剩余水分测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，符合规定。
(9)真空度测定按现行《中国兽药典》附录进行测定，符合规定。
实施例4
将本发明制备的非洲猪瘟病毒活疫苗与现有方法制备的同类制品作对比试验
1材料
1.1试验用疫苗
非洲猪瘟病毒基因缺失活疫苗(wsl传代细胞源)3批，分别为；wsl201901、wsl201902、wsl201903；非洲猪瘟病毒基因缺失活疫苗(猪原代肺泡巨噬细胞)3批，分别为:pam201901、pam201902、pam201903；非洲猪瘟病毒基因缺失活疫苗(猪骨髓细胞)3批，分别为:201901、201902、201903。
1.2试验用猪
为本公司自繁自养健康的1月龄仔猪，(健康猪的标准是：试验前观察7天，每日测温，观察期间采血，用pcr方法检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、蓝耳病病毒、圆环病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒等均为阴性，同时无体温升高)。同时使用前每头仔猪经非洲猪瘟病毒抗体检测，均为阴性。
2方法与结果
2.1物理性状检验肉眼观察疫苗物理性状，三组疫苗各3批均为淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加pbs稀释液后迅速溶解。
2.2无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，三组疫苗各3批均无菌生长。
2.3支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，三组疫苗各3批均无支原体生长。
2.4外源病毒检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，三组疫苗各3批均无外源病毒污染。
2.5安全检验每批疫苗取样，将疫苗用pbs稀释为5.0ml含10头份，颈部肌肉注射1月龄无非洲猪瘟病毒中和抗体的仔猪5头，各5.0ml，观察21日。结果见表1：
表1安全检验结果比较
证明本发明提供的非洲猪瘟病毒基因缺失活疫苗(wsl传代细胞源)3批均是安全的。
2.6效力检验
2.6.1病毒含量测定将疫苗用rpmi-1640培养液做10倍系列稀释，取10-2、10-3、10-4三个稀释度，每个稀释度接种相应的细胞6孔，每孔0.1ml，补充细胞维持液0.9ml，使之总量为1ml。观察并记录细胞病变情况，计算tcid50，结果如表2：
表2病毒含量测定结果比较
由表2可知，本发明提供的疫苗病毒含量符合标准。
2.6.2用猪检验将上述九批疫苗每批用pbs稀释为每ml含1头份，颈部肌肉注射1月龄无非洲猪瘟病毒中和抗体的仔猪5头，每头1ml，同时留5头不接种作对照，14日后用同批次疫苗相同剂量加强免疫一次。二免后14日连同条件相同的对照猪，每头猪口服强毒1ml(含103.0tcid50)，观察21日。结果见表3：
表3用猪效力检验结果比较
证明本发明提供的疫苗对非洲猪瘟强毒攻击具有完全的免疫保护作用。
2.7剩余水分测定按现行《中国兽药典》附录进行检测，三组疫苗各3批均符合规定；
2.8真空度测定按现行《中国兽药典》附录进行检测，三组疫苗各3批均符合规定。
3小结
参照现行《中国兽药典》及《非洲猪瘟病毒基因缺失活疫苗制造与检验规程》(草案)活疫苗成品检验方法进行检验，结果显示：用wsl细胞系生产的3批非洲猪瘟病毒基因缺失活疫苗免疫猪后，安全无不良反应。免疫后攻毒保护率可达100％，全部合格。从疫苗的病毒含量、免疫效力和安全性试验结果可以看出，该疫苗的病毒滴度和免疫保护效力均达到了很好的效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。