一种犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗耐热保护剂及其制备方法和应用与流程

[0001]
本发明属于生物医药领域中活疫苗耐热保护剂技术领域，具体涉及一种犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗耐热保护剂及其制备方法和应用。


背景技术：

[0002]
犬瘟热是由犬瘟热病毒(canine distempervirus，cdv)引起的一种高度接触性传染病，传染性强，死亡率可高达80％以上。犬瘟热症状初期狗的体温高达39.5-41℃，食欲不振，精神沉郁，眼鼻流出水样分泌物，打喷嚏，有腹泻。在以后2-14天内达到犬瘟热中期，再次出现体温升高，咳嗽，有脓性鼻涕、脓性眼屎症状。同时继发胃肠道疾病，呕吐、拉稀，食欲废绝。精神高度沉郁，嗜睡。犬瘟热发病后期就会出现典型的神经症状，如口吐白沫，抽搐等。
[0003]
犬细小病毒(canine parvovirus，cpv)属细小病毒科，细小病毒属。cpv对多种理化因素和常用消毒剂具有较强的抵抗力，其主要感染犬，尤其幼犬，传染性极强，死亡率也高。一年四季均可发病，以冬，春多发。饲养管理条件骤变，长途运输，寒冷，拥挤均可促使犬细小病毒病发生。病犬是主要传染源，呕吐物，唾液，粪便中均有大量病毒。康复犬仍可长期通过粪便向外排毒(最长可持续半年)。有证据表明人，虱，苍蝇和蟑螂可成为cpv的机械携带者。健康犬与病犬或带毒犬直接接触，或经污染的饲料和饮水通过消化道感染。
[0004]
犬腺状病毒(canine adenovirus，cav)是哺乳动物腺病毒属中致病性最强的一种病毒。有两个血清型i型和ii型，其中i型既可引起犬传染性肝炎(以肝小叶中心坏死，肝实质细胞和皮质细胞核内出现包涵体和出血时间长为特征的急性败血性传染病)，还可引起狐狸脑炎，故又称狐狸脑炎与犬传染性肝炎病。ii型可引起犬传染性喉气管炎和肠炎。犬腺状病毒病不仅流行于家养的犬、狐中，而且广泛地流行于野生的狐、熊、郊狼和浣熊等动物中。本病一年四季均可发生，各种性别、年龄和品种的犬、狐均易感染，但其中以离乳至一岁的动物发病率和死亡率最高。病程较犬瘟热短，大约在2周内恢复或死亡，有时在数日内死亡。如与犬瘟热混合感染，则死亡率更高。患病犬及带毒犬是本病传染来源，主要通过消化道感染，也可通过胎盘传染。
[0005]
犬副流感是犬副流感病毒(canine parainfluenza virus，cpiv)感染犬的主要的呼吸道传染病。临床表现发热、咳嗽、流涕等症状，病理变化以卡他性鼻炎和支气管炎为特征。犬副流感病毒在分类上属副粘病毒科中n型副流感病毒亚型，可在原代和传代犬肾、猴肾细胞培养物中良好增殖，也可在鸡胚、羊膜腔中增殖。犬副流感病毒可感染各种年龄和品种的犬，但以幼犬较重。感染途径主要是呼吸道分泌液通过空气尘埃感染其他犬，也可通过直接接触传染。感染期间犬因抵抗力降低可继发其他细菌感染。该病是犬主要的呼吸道传染病，临床症状为突然爆发、发热、大量黏液性、不透明鼻分泌物和咳嗽，病犬疲软无力。当与支原体或支气管败血波氏杆菌混合感染时，病情加重，体温升高至40℃以上。单纯的犬副流感病毒感染常可在3～7天自然康复，继发感染咳嗽可持续数周，甚至死亡。有些幼犬感染
后可表现后躯麻痹和运动失调等症状，病犬后肢可支撑躯体，但不能行走。
[0006]
我国宠物疫苗接种率最高的疫苗种类为狂犬疫苗，根据2019年宠物行业白皮书显示，狂犬疫苗接种占比47.2％，并且已形成较成熟的疫苗消费习惯，85.7％的宠物主会定期为宠物接种疫苗。在预防胜过治疗的保健观念下，人们对疫苗产品的可支付意愿提升，宠物疫苗渗透率快速提升，从而进一步打开宠物疫苗市场规模。宠物市场对于宠物用品的需求日益剧增，其中健康问题尤为重要。在七八十年代，对于给宠物打疫苗的意识还比较薄弱，如今几乎大多数养宠物的人都有给宠物打疫苗的意识，在如今年轻一代消费观念的改变，也是养宠物最多的，对于如此大的宠物市场，疫苗也可谓供不应求。
[0007]
目前对cdv、cpv、cav和cpiv引起的犬传染病的处置策略主要是通过宠物疫苗预防和控制，例如现有犬用宠物疫苗包括犬五联(犬狂犬、犬瘟热、犬细小病毒、犬腺病毒2型、犬副流感)活疫苗(cn1137347a)；犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗(cn106399260a)；犬瘟热、犬细小病毒和犬腺病毒i型三联活疫苗(cn101905021a)等。然而，目前市面上大多数犬用弱毒活疫苗产品为常规保护剂活疫苗，其保护剂的主要成分为脱脂牛奶、蔗糖、明胶等(例如cn101905021a或cn104208669a等)，或者保护剂的主要成分为蔗糖、明胶、海藻糖、甘露醇、精氨酸等(例如cn106399260a)，这些保护剂的耐热保护效果较差，导致病毒抗原对温度敏感，如果在2～8℃条件下，保存期较短(例如仅为12个月)或者37℃条件下长时间(例如7天)保存后病毒滴度下降较多(例如超过101tcid
50
/ml)，因此这类疫苗需要在低温条件下(例如-15℃以下)保存，并且疫苗稀释后，需尽快使用，否则易受热环境影响而降低疫苗效价。另外，由于此类活疫苗对环境温度比较敏感，因此对保存条件要求较高，在疫苗生产、运输以及使用过程中，如果耐热保护剂保护效果不佳，疫苗保存环境温度升高，就会导致疫苗效力下降或失效，造成免疫失败等问题。


技术实现要素：

[0008]
针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗耐热保护剂，其包含以下质量体积百分比含量的组分：
[0009][0010][0011]
其余为：注射用水。
[0012]
上述耐热保护剂包含以下质量体积百分比含量组分：
[0013][0014]
其余为：注射用水。
[0015]
本发明另一方面提供了上述耐热保护剂的制备方法，其包括以下步骤：
[0016]
s1)第一溶液配制：按照上述的耐热保护剂的成分含量将所需量的明胶溶于注射用水中得到第一溶解液，向其中加入所需量的蔗糖和海藻糖至完全溶解，得到第二溶解液，随后向其中加入所需量的无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠至完全溶解，获得第一溶液；
[0017]
s2)第二溶液配制：按照上述的耐热保护剂的成分含量将所需量的甘氨酸溶于注射用水中得到第三溶解液，向其中加入所需量的peg至完全溶解得到第四溶解液，随后向其中加入所需量的蛋白胨至完全溶解，得到第二溶液；
[0018]
s3)将第一溶液和第二溶液混合后定容，灭菌，获得所述耐热保护剂。
[0019]
本发明又一方面提供一种犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗，其由犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感病毒毒液和上述的耐热保护剂配制而成。
[0020]
每头份上述四联活疫苗中犬瘟热病毒含量≥10
4.0
tcid
50
/ml，犬细小病毒含量≥10
4.0
faid
50
/ml，犬腺病毒病毒含量≥10
5.5
tcid
50
/ml，犬副流感病毒含量≥10
5.5
faid
50
/ml。
[0021]
本发明再一方面提供了上述的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗的配制方法，其包括以下步骤：
[0022]
t1)将混合的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感病毒毒液与上述的耐热保护剂混匀，得到疫苗原液；
[0023]
t2)将步骤t1)的疫苗原液冷冻干燥，获得所述犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗。
[0024]
上述配制方法中，步骤t1)中所述混合的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感病毒毒液通过以下方式获得：按冻干后四联活疫苗的每头份中犬瘟热病毒含量≥10
4.0
tcid
50
/ml，犬细小病毒含量≥10
4.0
faid
50
/ml，犬腺病毒病毒含量≥10
5.5
tcid
50
/ml，犬副流感病毒含量≥10
5.5
faid
50
/ml计算出犬瘟热、犬细小、犬腺病毒和犬副流感病毒毒液的配苗用量，按照计算出的配苗用量混合。
[0025]
上述配制方法中，步骤t1)中所述混合的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感病毒
毒液中犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感病毒抗原的含量分别为10
5.00
～10
7.00
tcid
50
/ml、10
5.00
～10
7.00
faid
50
/ml、10
6.50
～10
7.50
tcid
50
/ml、10
6.50
～10
7.50
faid
50
/ml。
[0026]
上述配制方法中，步骤t1)中所述犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感病毒毒液与所述耐热保护剂按照体积比为1:1～3:1混合。
[0027]
上述配制方法中，步骤t2)中所述冷冻干燥的冻干曲线以冷冻干燥1ml疫苗原液计为：
[0028]
(1)预冻阶段：将疫苗原液在1h内降温至-40℃～-45℃，保温3h～5h，样品完全冻结后转入抽真空阶段；
[0029]
(2)抽真空阶段：在20min内将真空度降到100mt～120mt，转入升华干燥阶段；
[0030]
(3)升华干燥阶段：2h内将板层温度由-45℃升至-25℃并维持6h～8h，1h内将板层温度由-25℃升至-15℃并维持3h～5h，1h内将板层温度由-15℃升至2℃并维持2h～4h，随后转入解析干燥阶段；
[0031]
(4)解析干燥阶段：将板层温度在2h内升温到28℃～30℃，保温4h～6h。
[0032]
基于以上技术方案提供的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗耐热保护剂组合适宜量的蔗糖、明胶、海藻糖、蛋白胨、甘氨酸和peg等成分，其成分简单、原料易得、且制备方法简单，实施例结果表明，使用该耐热保护剂配制得到的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗在冻干后能够保持各病毒抗原原有的理化特性和生理活性，且各病毒抗原有效成分损失均极少(冻干后滴度最多仅下降10
0.75
tcid
50
/ml(或faid
50
/ml)，最少可仅为10
0.25
tcid
50
/ml(或faid
50
/ml))，冻干后疫苗疏松多孔，可以使犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗易于复水而恢复活性，且疫苗含水量低，易长期稳定保存，例如在37℃下保存7日后病毒抗原滴度最多仅下降10
0.50
tcid
50
/ml，在2～8℃下保存24个月后病毒抗原滴度最多仅下降10
0.50
tcid
50
/ml，因此该耐热保护剂具有良好的耐热保护效果，可以保证犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗的免疫有效性。因此，本发明提供的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗在室温条件下可以放置较长的时间，在使用时稀释后无需低温保存仍可保持较高效价，更加便于用户使用。
[0033]
本发明在配制犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗时为降低在冷冻干燥过程中所引起的病毒含量损失，依据各种影响因素综合考虑，设计并优化确定了理想的冻干曲线，使得配制得到的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗在冻干外型、剩余水份含量及病毒冻干前后病毒抗原滴度损失方面均具有良好的效果。并且在配制疫苗时使用的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感病毒原液与耐热保护剂可以按照体积比为3:1左右进行混合，且能够保证配制的四联活疫苗保持有效的各病毒抗原效价，因此疫苗生产成本低。并且实施例结果还验证了配制的四联活疫苗能够确保犬只的安全性。
[0034]
综上所述，本发明提供的耐热保护剂不仅可确保犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗应有的效力水平，具有较好的耐热保护效果，还可确保犬的安全性，可满足市场用户的需求，具有良好的经济效益及社会效益，应用前景广阔。
附图说明
[0035]
图1为利用实施例中保护剂4配制的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗的分装冻干后照片。
具体实施方式
[0036]
本发明旨在提供一种耐热保护效果好的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗的耐热保护剂，以确保犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗可以长时间稳定保存，并保持其良好的免疫效力水平和安全性。还基于该耐热保护剂提供了一种免疫效力好、安全性高且可以长时间稳定保存的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗。
[0037]
通过以下具体实施方式详细说明本发明。
[0038]
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
[0039]
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。
[0040]
以下实施例中使用的化学物质，其中明胶：购自sigma公司；peg 6000、d-海藻糖均购自国药公司；蔗糖、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠等均购自天津科盟化工公司；甘氨酸：购自sigma公司；蛋白胨购自oxoid公司。
[0041]
实施例1：制备犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗耐热保护剂
[0042]
该实施例旨在制备用于犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗的耐热保护剂，该耐热保护剂的作用是对疫苗有效成分在冷冻干燥过程及冻干后储存阶段实施保护以保证疫苗的免疫效果，该耐热保护剂的制备方法具体包括以下步骤：
[0043]
1.1、第一溶液配制：按照下表1所示的耐热保护剂(耐热保护剂1、2、3、4、5)的成分含量(其中％表示质量体积百分比含量，即g/100ml，下同)，分别精密称取所需量的明胶于定量注射用水中，期间置60℃水浴加热并不停搅拌至完全溶解，再分别称取蔗糖、海藻糖加入溶液中至完全溶解，随后精密依次称取无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠加入溶液中，置60℃水浴加热并不停搅拌将其溶解，获得第一溶液，其中无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠的加入目的是创建磷酸盐缓冲体系；
[0044]
1.2、第二溶液配制：按照下表1所述的各耐热保护剂的成分含量，分别精密称取甘氨酸于定量去注射水中，置60℃水浴，同时不停晃动直至完全溶解，再精密称取所需量的peg 6000(还可以使用例如peg4000、peg1000、peg400、peg200等规格的peg)于溶液中使其完全溶解，随后精密称取蛋白胨加入到溶液中，置60℃水浴，同时不停晃动将其溶解，获得第二溶液；
[0045]
1.3、将第一溶液和第二溶液混合后定容，121℃20min高压灭菌，即可获得耐热保护剂(分别命名为保护剂1、保护剂2、保护剂3、保护剂4和保护剂5)，37℃保存备用。
[0046]
注：配制耐热保护剂时，采取单溶每一种试剂，在单溶时逐渐增加溶质的量，避免出现过饱和现象，以及避免出现溶解不彻底的情况。
[0047]
表1：犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗耐热保护剂的组成及含量
[0048][0049]
实施例2：配制犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗
[0050]
该实施例利用上述实施例1制备的保护剂1、保护剂2、保护剂3、保护剂4和保护剂5作为活疫苗的耐热保护剂，以配制犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗，四联活疫苗的配制方法包括以下步骤：
[0051]
2.1、犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感病毒毒液的制备
[0052]
2.1.1、制备犬瘟热病毒毒液
[0053]
犬瘟热病毒病毒液繁殖：取生长良好的vero细胞(金宇保灵生物药品有限公司国家工程实验室提供)单层，弃掉生长液，消化细胞，将细胞悬液按照2.1
×
105个/ml接种至反应器，载体用量为2～5g/l，设定反应器参数(温度37℃、溶氧45％-60％、ph值7.1)，待细胞长满单层后按维持液1％比例接种常规疫苗用犬瘟热病毒种毒，设定反应器参数(温度37℃、溶氧45％-60％、ph值7.1)。待出现80％左右细胞病变时，收获病毒液，置-40℃以下保存，待检备用。
[0054]
2.1.2、制备犬细小病毒毒液
[0055]
犬细小病毒病毒液繁殖：取生长良好的f81细胞(金宇保灵生物药品有限公司国家工程实验室提供)单层，弃掉生长液，消化细胞，将细胞悬液按照2.6
×
105个/ml接种至反应器，载体用量为2～5g/l，设定反应器参数(温度37℃、溶氧45％-60％、ph值7.1)，待细胞长满单层后按维持液2％比例接种常规疫苗用犬细小病毒种毒。待出现80％左右细胞病变时，收获病毒液，置-40℃以下保存，待检备用。
[0056]
2.1.3、制备犬腺病毒2型病毒毒液
[0057]
犬腺病毒病毒液繁殖：取生长良好的mdck悬浮细胞(金宇保灵生物药品有限公司国家工程实验室提供)，细胞密度按照6-9
×
105个/ml接种反应器，设定反应器参数(温度37℃、溶氧45％-60％、ph值7.1)。培养48-72小时，细胞密度≥3
×
106个/ml时，按培养体积的1％接种常规疫苗用犬腺病毒ii型种毒。培养48～72小时，待出现50％左右细胞病变时，收获病毒液，置-40℃以下保存，待检备用。
[0058]
2.1.4、制备犬副流感病毒毒液
[0059]
犬副流感病毒弱毒病毒液繁殖：取生长良好的mdck悬浮细胞，细胞密度按照5-7
×
105个/ml接种反应器，设定反应器参数(温度37℃、溶氧45％-60％、ph值7.1)。培养48-72h，细胞密度≥3
×
106个/ml时，按培养体积的1％接种常规疫苗用犬副流感弱毒种毒。培养48-96小时收获，置-40℃以下保存，待检备用。
[0060]
2.1.5、病毒含量测定
[0061]
表2：病毒含量及感染性测定结果
[0062][0063]
2.2、按冻干后的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗的每头份疫苗中犬瘟热病毒含量≥10
4.0
tcid
50
/ml，犬细小病毒含量≥10
4.0
faid
50
/ml，犬腺病毒病毒含量≥10
5.5
tcid
50
/ml，犬副流感病毒含量≥10
5.5
faid
50
/ml计算出犬瘟热、犬细小、犬腺病毒和犬副流感病毒毒液的配苗用量，按照计算出的配苗用量混合；该实施例中直接将上述步骤2.1制备的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感病毒液按照体积比为1:1:1:1比例混合，得到疫苗病毒抗原原液(即混合的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感病毒毒液，其中四种病毒的病毒抗原含量大约为：犬瘟热病毒含量为约10
6.75
tcid
50
/ml，犬细小病毒含量约为10
5.75
faid
50
/ml，犬腺病毒含量约为10
7.75
tcid
50
/ml，犬副流感病毒含量约为10
7.50
faid
50
/ml)；
[0064]
2.3、取上述步骤2.2获得的疫苗病毒抗原原液分别与实施例1获得的五种耐热保护剂(保护剂1、保护剂2、保护剂3、保护剂4和保护剂5)按照体积比为2:1和3:1混合均匀，具体操作为将疫苗病毒抗原原液匀速加入盛放耐热保护剂的储液瓶内，人工缓慢混匀15min左右(避免产生过多的泡沫)，即可获得疫苗原液；
[0065]
2.4、用移液器将步骤2.3获得的疫苗原液按1ml(1头份)/瓶分装，即分装为1ml/瓶，随后冷冻干燥，即可配制得到犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗(冻干制剂)；其中冷冻干燥的冻干曲线以冷冻干燥1ml疫苗原液计为：
[0066]
(1)预冻速度：工艺选择在产品进箱后再将冻干箱降温的慢冻速率。
[0067]
(2)预冻的最低温度：根据配制成混合疫苗的共熔点温度-25℃，将预冻最低温度低于此温度。
[0068]
(3)预冻时间：在1h内将冻干箱内温度降到预定的-40℃～-45℃，随后保持3h～5h。
[0069]
(4)抽真空时间：预冻后立即进入降压阶段，并在20min内将真空度降到100mt～120mt，直到结束。
[0070]
(5)升华干燥阶段：真空度降到120mt时开始加热，此时开始处于升华干燥阶段。2h内将板层温度由-45℃升至-25℃并维持6h～8h，1h内将板层温度由-25℃升至-15℃并维持3h～5h，1h内将板层温度由-15℃升至2℃并维持2h～4h，使瓶内冻结产品自上而下逐渐升华，最终成型。
[0071]
(6)解析干燥阶段：产品完成升华干燥时己经形成初步型态，此时需要提高真空度，真空度设定为10mt，进而改进冻干箱内热量传递，增加气体的对流传热，将板层温度2h内升到产品最高允许温度28℃，维持4h～6h。
[0072]
(7)产品最高允许温度：根据产品确定板层最高允许温度28℃。由于传递的热差，板层温度常比产品最高允许温度略低。
[0073]
(8)冻干总时间：根据冻干机性能、疫苗特性及装量，将预冻时间、升华干燥阶段和解析干燥时间全过程确定为31h左右。
[0074]
对该实施例配制的各犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗冻干前后的病毒含量进行检测，检测结果如下表3-表6所示。还按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》检验规程文献中记载的方法对该实施例配制的疫苗产品进行了常规项目检测，如下表7所示。
[0075]
表3：四联活疫苗冻干前后犬瘟热病毒含量的检测结果
[0076][0077]
表4：四联活疫苗冻干前后犬细小病毒含量的检测结果
[0078][0079]
表5：四联活疫苗冻干前后犬腺病毒含量的检测结果
[0080][0081]
表6：四联活疫苗冻干前后犬副流感病毒含量的检测结果
[0082]
[0083]
表7：犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗成品常规检测结果
[0084][0085]
由上表3-表6检测结果可知，使用保护剂3和保护剂4配制得到的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗在冻干前后，其中的各病毒含量(滴度)下降较少，最多仅下降10
0.75
tcid
50
/ml(或faid
50
/ml)，最少仅下降10
0.25
tcid
50
/ml(或faid
50
/ml)，因此保护剂3和保护剂4能够在冷冻干燥过程有效保护犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗中的各病毒抗原不被降解，获得效价水平较高的疫苗产品。相对于保护剂3和保护剂4，保护剂5中不含有蛋白胨，四联活疫苗在冻干前后各病毒滴度下降较多；然而相对于保护剂3和保护剂4，保护剂1和保护剂2中也含有蛋白胨，但是四联活疫苗冻干前后各病毒滴度下降也较多，可见本发明提供的耐热保护剂中各适量配比组分是相互影响的，共同作用以保护犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗中的各病毒抗原不被降解，获得效价水平较高的疫苗产品。根据表7的检测结果，可见使用保护剂3和保护剂4获得的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗在冻干后呈淡黄色或淡粉色海绵状疏松团块，且易与瓶壁脱离(图1示出了使用保护剂4的经分装(4瓶)、冷冻干燥之后获得的四联活疫苗冻干产品的照片)，含水量均在2.0％以下，能够迅速溶解于水中，因此配制得到的疫苗产品具有较佳的冻干外型、较低的水分含量和良好的溶解特性。其中相对于保护剂3，保护剂4的耐热保护效果更佳，疫苗冻干前后的病毒含量下降最多仅为10
0.5
tcid
50
/ml(或faid
50
/ml)，更能保证获得效价水平更高的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗。
[0086]
该实施例还对以保护剂4作为疫苗耐热保护剂配制获得的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》检验规程文献中记载的方法进行了耐老化试验，其中具体为：将犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗置
37℃7日，以及在2～8℃保存24个月，检测疫苗产品中各病毒含量的变化情况，检测结果如下表8-表11所示。
[0087]
表8：耐老化试验犬瘟热病毒检测结果(tcid
50
/ml)
[0088][0089]
表9：耐老化试验犬细小病毒结果(faid
50
/ml)
[0090][0091]
表10：耐老化试验犬腺病毒结果(tcid
50
/ml)
[0092][0093]
表11：耐老化试验犬副流感病毒结果(faid
50
/ml)
[0094][0095]
由上表8至表11的检测结果可知，以保护剂4作为耐热保护剂配制获得的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗无论是按照抗原:保护剂为2:1，还是3:1，该疫苗在37℃条件下保存7天后的各病毒滴度下降均未超过101tcid
50
/ml(或faid
50
/ml)，下降最多的也仅为10
0.5
tcid
50
/ml(或faid
50
/ml)；该疫苗在2～8℃条件下保存24个月后的各病毒滴度下降也均未超过101tcid
50
/ml(或faid
50
/ml)，下降最多的也仅为10
0.50
tcid
50
/ml(或faid
50
/ml)。以保护剂3作为耐热保护剂配制犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗时，也同样如保护剂4一样具有良好的耐热保护效果。因此，本发明提供的耐热保护剂可以保证使用其的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗能够稳定长期保存，且有效抑制其中各病毒滴度的下降，从而保证各病毒抗原的免疫效力。
[0096]
实施例3：制备犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗耐热保护剂
[0097]
该实施例按照实施例1中步骤1.1-1.3相同的方法，根据下表12所列耐热保护剂的
组成及含量制备犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗耐热保护剂，分别命名为保护剂6、保护剂7和保护剂8。利用保护剂6、保护剂7和保护剂8按照与实施例2中步骤2.3-2.4相同的方法分别配制了犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗，其中抗原:保护剂＝3:1。随后按照与实施例2相同的方法分别对使用保护剂6、保护剂7和保护剂8配制得到的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗冻干前后各病毒滴度的下降情况以及成品常规项目进行检测，检测结果如下表13所示。
[0098]
表12：犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗耐热保护剂的组成及含量
[0099][0100]
表13：疫苗冻干后病毒滴度下降情况和成品常规项目检测结果
[0101][0102]
由上表12-表13结果可知，使用保护剂6-保护剂8配制得到的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗在冻干前后，其中的各病毒含量(滴度)下降较少，最多仅下降10
0.5
tcid
50
/ml(或faid
50
/ml)，最少仅下降10
0.25
tcid
50
/ml(或faid
50
/ml)，因此保护剂6-保护剂8能够在冷冻干燥过程有效保护犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗中的各病毒抗原不被降解，获得效价水平较高的疫苗产品。根据表13检测结果还可见使用保护剂6-保护剂8获得的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗在冻干后呈淡黄色或淡粉色海绵状疏松团块，且易与瓶壁脱离，含水量均在2.0％以下，甚至在1.6％以下，能够迅速溶解于水中，因此配制得到的疫苗产品具有较佳的冻干外型、较低的水分含量和良好的溶解特性。因此，本发明提供的耐热保护剂可以有效保护使用其的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗在冷冻干燥过程中病毒抗原不被降解，从而保证疫苗免疫效力，
同时获得具有良好的冻干外型、较低的水分含量和良好的溶解特性的四联活疫苗产品。
[0103]
现有技术中也公开了一系列耐热保护剂，例如专利文献cn108030925a公开的冻干保护剂包括以下配比的组分：蛋白水解物1％-20％(w/v)、蔗糖3％-10％(w/v)、氨基酸0.5％-6％(w/v)、明胶0.5％-4％(w/v)以及海藻糖0.5-15％(w/v)，所用溶剂为注射用水。该专利文献的实施例虽然证明了其公开的冻干保护剂具有良好的冻干保护效果，但是其验证的仅为对单一病毒抗原疫苗的冻干保护效果，且验证的只是对猪伪狂犬病毒或猪瘟病毒的冻干效果，其是否能够用于本发明的对耐热保护剂要求更加严苛的且属于不同病毒的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗没有任何提示。另外，本发明人还利用该专利文献cn108030925a的实施例1公开的每l冻干保护剂(溶剂为水)中含有酶解酪蛋白9.5g、胰蛋白胨70g、水解乳蛋白25g、蔗糖80g、谷氨酸钠24g、明胶10g以及海藻糖12g的冻干保护剂(命名为保护剂9)为例以验证其是否能够有效降低本发明的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗中的病毒抗原在冻干过程中的损失以及对制备获得的疫苗成品的常规项目进行检测，并与该实施例制备的保护剂6的保护效果作比较。其中疫苗配制方法同实施例2中步骤2.3-2.4，抗原:保护剂的体积比选择为1:1、2:1和3:1，冻干曲线选择使用实施例2中配制犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗所采用的冻干曲线。以下表14-表17分别示出了使用以上两种保护剂(保护剂9和保护剂6)的四联活疫苗冻干前后各病毒滴度的变化情况，表18示出了四联活疫苗成品的常规项目检测结果。
[0104]
表14：四联活疫苗冻干前后犬瘟热病毒含量检测结果
[0105][0106]
表15：四联活疫苗冻干前后犬细小病毒含量检测结果
[0107][0108]
表16：四联活疫苗冻干前后犬腺病毒病毒含量检测结果
[0109]
[0110]
表17：四联活疫苗冻干前后犬副流感病毒含量检测结果
[0111][0112]
表18：四联活疫苗成品常规项目检测结果
[0113][0114]
由上表14-表17检测结果可知，将专利文献cn108030925a实施例1中公开的冻干保护剂(即保护剂9)用作本发明的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗的耐热保护剂时，并不能在冷冻干燥过程中有效降低四联活疫苗中各病毒含量的损失，在抗原与保护剂的体积比为1:1、2:1、3:1混合条件下配制获得的四联活疫苗，其冻干前后病毒滴度下降最高可达到10
4.25
tcid
50
/ml(犬腺病毒)，最低也达到10
0.75
tcid
50
/ml(或faid
50
/ml)，可见疫苗冻干后各病毒抗原损失较多，将会严重影响该疫苗的免疫效果和储存稳定性；根据表18检测结果可见，利用保护剂9获得的疫苗成品出现结块、熔化、蜂窝状等外型不好的物理性状，且冻干后疫苗中剩余水分均在2.0％以上，水分含量较高，不易保存，因此该保护剂9不能用作本发明的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗的耐热保护剂。相比于保护剂9，本发明提供的保护剂6用作犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗的耐热保护剂时，疫苗冻干前后各病毒含量的损失最高仅为10
0.5
tcid
50
/ml(或faid
50
/ml)，且获得的疫苗成品具有良好的冻干外型以及较低的水分含量，显然，本发明提供的耐热保护剂对犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗的耐热保护效果更为理想，并且当抗原与保护剂的体积比为3:1时仍然可以获得具有良好效力水平和冻干外型的疫苗产品，因此可以有效节约疫苗生产成本。
[0115]
实施例4：配制犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗的冻干曲线优化
[0116]
该实施例利用实施例1获得的保护剂4作为耐热保护剂，按照与实施例2中步骤2.3
相同的方法将实施例2中步骤2.2获得的疫苗病毒抗原原液与保护剂4按照体积比为3:1混合均匀，获得疫苗原液；随后将疫苗原液按照1ml/瓶分装后进行冷冻干燥处理，其中本发明人设计了多种冻干曲线，以从中筛选确定理想的适宜于犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗的冻干曲线，以下列出了两种冻干曲线：冻干曲线1和冻干曲线2。
[0117]
冻干曲线1：与实施例2中配制犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗所采用的冻干曲线相同；基于该冻干曲线1获得的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗命名为四联活疫苗1；
[0118]
冻干曲线2(作为对照冻干曲线)：
[0119]
所述冷冻干燥的冻干曲线以冷冻干燥1ml疫苗原液计为：
[0120]
(1)预冻阶段：将疫苗原液在1h内降温至-40℃～-45℃，保温3h～5h，样品完全冻结后转入抽真空阶段；
[0121]
(2)抽真空阶段：在20min内将真空度降到100mt～120mt，转入升华干燥阶段；
[0122]
(3)升华干燥阶段：2h内将板层温度由-45℃升至-18℃并维持5h～8h，1h内将板层温度由-18℃升至-10℃并维持3h～6h，1h内将板层温度由-10℃升至-2℃并维持2h～4h，随后转入解析干燥阶段；
[0123]
(4)解析干燥阶段：将板层温度在2h内升温到28℃，保温4h～6h。
[0124]
基于该冻干曲线2获得的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗命名为四联活疫苗2。
[0125]
按照与实施例2中相同的方法，分别对四联活疫苗1和四联活疫苗2冻干前后各病毒滴度下降情况以及疫苗成品常规项目进行检测，检测结果如下表19所示。
[0126]
表19：疫苗冻干后病毒滴度下降情况和成品常规项目检测结果
[0127][0128]
根据上表19检测结果可知，四联活疫苗1中的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感病毒在冻干后病毒滴度最多下降10
0.50
tcid
50
/ml(犬瘟热病毒)，最少下降仅为10
0.25
tcid
50
/ml(或faid
50
/ml)，并且疫苗冻干后物理性状、溶解度、剩余水分均良好。而四联活疫苗2中的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感病毒在冻干后病毒滴度最多下降10
0.75
tcid
50
/ml(犬瘟
热病毒)，最少也为10
0.50
tcid
50
/ml(或faid
50
/ml)，且冻干后物理性状稍差，疫苗底部发生轻微熔化，出现锯齿状，溶解后出现少量颗粒。其中对于四联活疫苗中同一病毒，相对于四联活疫苗1，四联活疫苗2中的病毒滴度下降均相对较多。因此，本发明采用冻干曲线1不但可以减小犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗在冻干过程中病毒滴度的损失，而且能够提高产品质量。
[0129]
实施例5：犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗安全性试验
[0130]
该实施例以上述实施例3中以保护剂6作为耐热保护剂、以抗原和保护剂体积比为2:1和3:1配制获得的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗(分别命名为四联活疫苗3和四联活疫苗4)作为实验组，以灭菌生理盐水作为对照组，分别肌肉接种2～3月龄健康易感比格犬5只，每只1ml，连续观察21日，如下表20所示，各组比格犬均无异常反应，表明本发明配制的犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗具有良好的安全性。
[0131]
表20：犬瘟热、犬细小、犬腺病毒、犬副流感四联活疫苗安全性试验结果
[0132]
疫苗接种剂量(ml/只)比格犬(月)每组接种数量(只)检测结果四联活疫苗312～355/5正常四联活疫苗412～355/5正常灭菌生理盐水12～355/5正常
[0133]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。